一种乙肝表面抗原化学发光免疫检测试剂盒及其应用

摘要

本发明涉及一种乙肝表面抗原化学发光免疫检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：间接连接抗HBsAg抗体1的磁颗粒试剂，化学发光标记物标记的HBsAg抗体2溶液，化学发光底物液，清洗液，所述抗HBsAg抗体1至少包含两种抗体或抗体的免疫反应片段，且至少包含一种抗S蛋白单克隆抗体1，所述抗HBsAg抗体2至少包含两种抗体或抗体的免疫反应片段，且至少包含一种抗S蛋白单克隆抗体2，所述抗S蛋白单克隆抗体1和抗S蛋白单克隆抗体2针对的HBsAg的表位不同，本发明的试剂盒在国际上尚属首例，在检测HBsAg时具有高灵敏度和准确度，极大提高了HBsAg突变株的检出能力，显著提高了临床输血、手术等的安全性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种乙肝表面抗原化学发光免疫检测试剂盒及其应用，属于体外检测技术领域。

背景技术

乙肝表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒(HBV)感染后首先出现的血清学标志物，是临床上应用最多的HBV感染血清标志物，是WHO公认的判断HBV感染的关键指标。HBV复制周期快且聚合酶易错配以及乙肝疫苗、抗病毒治疗的广泛应用，HBsAg突变在慢性HBV感染患者中非常常见。HBsAg突变会导致患者HBsAg检测结果呈阴性，但其血清或肝脏中仍存在HBVDNA，即隐匿性HBV感染(OBI)。OBI患者如果作为献血者或肝移植供体，将会对输血和手术安全构成重大隐患。同时，HBsAg突变会加速隐匿性乙型肝炎向肝硬化或肝癌进展，并引发免疫抑制后的HBV再激活，导致检测试剂漏检、疫苗保护失败、抗病毒治疗失败等，对疾病进展和疗效判断造成重要影响。因此，研究如何提高对HBsAg突变体的检出能力，具有重要意义。

目前用于HBsAg筛查的试剂盒主要有酶联免疫试剂盒、化学发光免疫试剂盒等，中国血站血液筛查普遍使用酶联免疫试剂盒，但市场上的酶联免疫试剂普遍采取单克隆抗体捕获加单克隆抗体检测的模式，由于结合位点单一，如果在结合的位点上表面抗原发生突变，则会造成抗原对相应抗体的结合力下降甚至不能结合，容易造成漏检；化学发光法具有很高的灵敏度和特异性，欧美血站及医院以及中国大型三甲医院多采用化学发光免疫试剂盒，并正逐渐替代酶联免疫试剂盒，成为主流，国际上先进的试剂公司如雅培和罗氏公司为提高突变株的检测能力对化学发光免疫试剂进行了升级，试剂基本由两种单克隆捕获抗体加多克隆检测抗体构成，多克隆抗体针对的抗原表位多，即使抗原某个位点发生突变，多克隆抗体仍可以跟突变抗原的其他表位结合，而捕获抗体由两种单克隆抗体构成，对突变株的检出能力较好，但是目前市场上采用的两种捕获抗体都是针对S蛋白的，而广义的HBsAg由三种蛋白组成：主要表面蛋白(S蛋白)、乙肝表面抗原大蛋白(由乙肝表面抗原前S1、乙肝表面抗原前S2和乙肝表面抗原S三种蛋白连接折叠而成)、乙肝表面抗原中蛋白(由乙肝表面抗原前S2和乙肝表面抗原S两种蛋白连接折叠而成)，若HBV的有些突变导致S蛋白不表达，S蛋白、乙肝表面抗原大蛋白和乙肝表面抗原中蛋白则均不可以被捕获抗体捕获，导致不能有效检出乙肝表面抗原的突变株。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：为解决现有试剂盒对乙肝表面抗原突变株检出能力较低的技术问题，提供一种乙肝表面抗原化学发光免疫检测试剂盒及其应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种乙肝表面抗原化学发光免疫检测试剂盒，包括：间接连接抗HBsAg抗体1的磁颗粒试剂，化学发光标记物标记的HBsAg抗体2溶液，化学发光底物液，清洗液，所述抗HBsAg抗体1至少包含两种抗体或抗体的免疫反应片段，且至少包含一种抗S蛋白单克隆抗体1，所述抗HBsAg抗体2至少包含两种抗体或抗体的免疫反应片段，且至少包含一种抗S蛋白单克隆抗体2，所述抗S蛋白单克隆抗体1和抗S蛋白单克隆抗体2针对的HBsAg的表位不同。

优选地，所述抗HBsAg抗体1由摩尔比为1:0.2-1的抗S蛋白单克隆抗体1和多克隆抗体Fab片断组成，或由摩尔比为1:0.2-1的抗S蛋白单克隆抗体1和抗前S2蛋白单克隆抗体1组成，或由摩尔比为1:0.2-1:0.2-1的抗S蛋白单克隆抗体1、抗前S2蛋白单克隆抗体1和多克隆抗体Fab片断组成。

优选地，所述抗HBsAg抗体2由摩尔比为1:0.5-2的抗S蛋白单克隆抗体2和多克隆抗体Fab片断组成，或由摩尔比为1:0.2-1的抗S蛋白单克隆抗体2和抗前S2蛋白单克隆抗体2组成，或由摩尔比为1:0.2-1:0.5-2的抗S蛋白单克隆抗体1、抗前S2蛋白单克隆抗体2和多克隆抗体Fab片断组成，所述抗前S2蛋白单克隆抗体1和抗前S2蛋白单克隆抗体2针对的HBsAg的表位不同。

优选地，所述多克隆抗体Fab片断由多克隆抗体特异性Fab酶切产物经过G蛋白亲和柱和HBsAg抗原亲和柱的双重纯化而得，用于诊断试剂的特异性好。

具体地，所述多克隆抗体Fab片断由以下方法制备和纯化：多克隆抗体与特异性Fab加工酶按体积比1:0.5-1于Tris-HCl缓冲体系中反应12-24小时，得酶切产物；将酶切产物过G蛋白亲和柱收集流出蛋白P1，PBS缓冲液充分平衡G蛋白亲和柱后，用HCl-甘氨酸洗脱得蛋白P2，蛋白P2通过HBsAg抗原亲和柱收集流出蛋白P3，PBS缓冲液充分平衡HBsAg抗原亲和柱后，用HCl-甘氨酸洗脱得蛋白P4，蛋白P4用Tris-HCl调节pH到7.5-8.0，于PBS中透析即可。

优选地，所述间接连接抗HBsAg抗体1的磁颗粒由链霉亲和素包被的磁颗粒和标记生物素的抗HBsAg抗体1组成，或由抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁颗粒和标记异硫氰酸荧光素的抗HBsAg抗体1组成。

优选地，链霉亲和素包被的磁颗粒为纳米级的Fe₂O₃或Fe₃0₄磁性粒子和有机高分子材料的复合物，所述有机高分子材料优选为葡聚糖；所述磁颗粒的粒径大小为0.1-5μm；所述磁颗粒还可以通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团，所述活性功能基团为-OH、-COOH或-NH₂。

优选地，所述化学发光标记物选自鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯或吖啶磺酰胺。

优选地，所述化学发光底物液包括化学发光激发液1和化学发光激发液2，所述化学发光激发液1含无机酸和过氧化物，所述化学发光激发液2含氢氧化物和tritonx-100。

本发明还提供上述乙肝表面抗原化学发光免疫检测试剂盒的应用，按照以下步骤使用：

将待测样本与间接连接抗HBsAg抗体1的磁颗粒试剂反应，形成磁性抗原-抗体复合物悬浮液；

将所述的磁性抗原-抗体复合物悬浮液置于磁场内，洗涤所述磁性抗原-抗体复合物；

将所述洗涤后的磁性抗原-抗体复合物与化学发光标记物标记的抗HBsAg抗体2反应后，形成磁性复合物悬浮液；

将所述的磁性复合物悬浮液置于磁场内，洗涤所述磁性复合物；

向洗涤后的磁性复合物中先加入化学发光激发液1，再加入化学发光激发液2，检测化学发光光子强度。

本发明的有益效果是：

本发明的乙肝表面抗原化学发光免疫检测试剂盒，抗HBsAg抗体1和抗HBsAg抗体2均是至少包含两种抗体或抗体的免疫反应片段，且至少包含一种抗S蛋白单克隆抗体，若由抗S蛋白单克隆抗体1和抗前S2蛋白单克隆抗体组成时，可以有效防止突变导致的S蛋白不能表达时而造成的漏检；若由抗S蛋白单克隆抗体1和多克隆抗体Fab片断组成时，多克隆抗体Fab片断既能针对HBsAg的多个表位，同时Fab片断作为多克隆抗体的特异区，尤其是经过G蛋白亲和柱和HBsAg抗原亲和柱的双重纯化的多克隆抗体Fab片断可极大地程度地避免多克隆抗体交叉反应带来的假阳性，混合使用的抗S蛋白单克隆抗体1具有高特异性和高亲和力，使得试剂盒检测HBsAg时具有极高的灵敏度；若由抗S蛋白单克隆抗体1、抗前S2蛋白单克隆抗体和多克隆抗体的免疫反应片段组成，则可以进一步提高试剂盒检测HBsAg的灵敏度和准确度；此试剂盒在国际上尚属首例，使用该试剂盒极大提高了HBsAg突变株的检出能力，显著提高了临床输血、手术等的安全性。

具体实施方式

现在对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例提供一种乙肝表面抗原化学发光免疫检测试剂盒，包括：间接连接抗HBsAg抗体1的磁颗粒试剂，化学发光标记物标记的HBsAg抗体2溶液，化学发光底物液，清洗液；

所述抗HBsAg抗体1由摩尔比为1:0.2的抗S蛋白单克隆抗体1和多克隆抗体Fab片断组成；

所述抗HBsAg抗体2由摩尔比为1:2的抗S蛋白单克隆抗体2和多克隆抗体Fab片断组成；

所述多克隆抗体Fab片断由以下方法制备和纯化：多克隆抗体与特异性Fab加工酶按体积比1:0.5于0.2M，pH为7.2的Tris-HCl缓冲体系中37℃下反应24小时，得酶切产物；将酶切产物过G蛋白亲和柱收集流出蛋白P1，用0.2M，pH为7.2的PBS缓冲液充分平衡G蛋白亲和柱后，用0.1M，pH为2.7的HCl-甘氨酸洗脱得蛋白P2；蛋白P2直接通过HBsAg抗原亲和柱收集流出蛋白P3，用0.2M，pH为7.2的PBS缓冲液充分平衡HBsAg抗原亲和柱后，用0.1M，pH为2.7的HCl-甘氨酸洗脱得蛋白P4，蛋白P4用1M，pH为8.0的Tris-HCl调节pH到7.5-8.0，于0.2M，pH为7.2的PBS缓冲液中透析即可；

所述化学发光标记物为鲁米诺；

所述间接连接抗HBsAg抗体1的磁颗粒由链霉亲和素包被的磁颗粒和标记生物素的抗HBsAg抗体1组成；所述链霉亲和素包被的磁颗粒为纳米级的Fe₂O₃磁性粒子和葡聚糖的复合物，所述磁颗粒的粒径大小为0.1-5μm；

所述化学发光底物液包括化学发光激发液1和化学发光激发液2，所述化学发光激发液1含0.1M硝酸和1g/100mL过氧化氢，所述化学发光激发液2含0.25M氢氧化钠和0.1g/100tritonx-100。

实施例2

本实施例提供一种乙肝表面抗原化学发光免疫检测试剂盒，与实施例1的试剂盒基本相同，不同之处在于：

所述抗HBsAg抗体1由摩尔比为1:1的抗S蛋白单克隆抗体1和多克隆抗体Fab片断组成；

所述抗HBsAg抗体2由摩尔比为1:0.5的抗S蛋白单克隆抗体2和多克隆抗体Fab片断组成；

所述多克隆抗体Fab片断由以下方法制备和纯化：多克隆抗体与特异性Fab加工酶按体积比1:1于0.2M，pH为7.2的Tris-HCl缓冲体系中37℃下反应12小时，得酶切产物；将酶切产物过G蛋白亲和柱收集流出蛋白P1，用0.2M，pH为7.2的PBS缓冲液充分平衡G蛋白亲和柱后，用0.1M，pH为2.7的HCl-甘氨酸洗脱得蛋白P2；蛋白P2直接通过HBsAg抗原亲和柱收集流出蛋白P3，用0.2M，pH为7.2的PBS缓冲液充分平衡HBsAg抗原亲和柱后，用0.1M，pH为2.7的HCl-甘氨酸洗脱得蛋白P4，蛋白P4用1M，pH为8.0的Tris-HCl调节pH到7.5-8.0，于0.2M，pH为7.2的PBS缓冲液中透析即可；

所述化学发光标记物为异鲁米诺；

所述间接连接抗HBsAg抗体1的磁颗粒由抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁颗粒和标记异硫氰酸荧光素的抗HBsAg抗体1组成；所述抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁颗粒为纳米级的Fe₃O₄磁性粒子和葡聚糖的复合物，所述磁颗粒的粒径大小为0.1-5μm。

实施例3

本实施例提供一种乙肝表面抗原化学发光免疫检测试剂盒，与实施例1的试剂盒基本相同，不同之处在于：

所述抗HBsAg抗体1由摩尔比为1:0.2:1的抗S蛋白单克隆抗体1、抗前S2蛋白单克隆抗体和多克隆抗体Fab片断组成；

所述抗HBsAg抗体2由摩尔比为1:0.2:2的抗S蛋白单克隆抗体1、抗前S2蛋白单克隆抗体和多克隆抗体Fab片断组成；

所述多克隆抗体Fab片断由以下方法制备和纯化：多克隆抗体与特异性Fab加工酶按体积比1:1于0.2M，pH为7.2的Tris-HCl缓冲体系中37℃下反应12小时，得酶切产物；将酶切产物过G蛋白亲和柱收集流出蛋白P1，用0.2M，pH为7.2的PBS缓冲液充分平衡G蛋白亲和柱后，用0.1M，pH为2.7的HCl-甘氨酸洗脱得蛋白P2；蛋白P2直接通过HBsAg抗原亲和柱收集流出蛋白P3，用0.2M，pH为7.2的PBS缓冲液充分平衡HBsAg抗原亲和柱后，用0.1M，pH为2.7的HCl-甘氨酸洗脱得蛋白P4，蛋白P4用1M，pH为8.0的Tris-HCl调节pH到7.5-8.0，于0.2M，pH为7.2的PBS缓冲液中透析即可；

所述化学发光标记物为吖啶酯。

实施例4

本实施例提供一种乙肝表面抗原化学发光免疫检测试剂盒，与实施例3的试剂盒基本相同，不同之处在于：

所述抗HBsAg抗体1由摩尔比为1:1:0.2的抗S蛋白单克隆抗体1、抗前S2蛋白单克隆抗体和多克隆抗体Fab片断组成；

所述抗HBsAg抗体2由摩尔比为1:1的抗S蛋白单克隆抗体2和抗前S2蛋白单克隆抗体组成。

实施例5

本实施例提供一种乙肝表面抗原化学发光免疫检测试剂盒，与实施例3的试剂盒基本相同，不同之处在于：

所述抗HBsAg抗体1由摩尔比为1:1的抗S蛋白单克隆抗体1和抗前S2蛋白单克隆抗体组成；

所述抗HBsAg抗体2由摩尔比为1:0.2的抗S蛋白单克隆抗体2和抗前S2蛋白单克隆抗体组成。

实施例6

本实施例提供一种乙肝表面抗原化学发光免疫检测试剂盒，与实施例3的试剂盒基本相同，不同之处在于：

所述抗HBsAg抗体1由摩尔比为1:0.2的抗S蛋白单克隆抗体1和抗前S2蛋白单克隆抗体组成；

所述抗HBsAg抗体2由摩尔比为1:1:0.5的抗S蛋白单克隆抗体1、抗前S2蛋白单克隆抗体和多克隆抗体Fab片断组成。

效果例1

采用实施例1-5的试剂盒、罗氏和雅培的进口化学发光免疫试剂盒(分别为abbottarchitect HBsAg quantitative assay和ROCHE Elecsys HBsAgⅡscreening assay)以及英科新创(国药准字S10910148)、科华(国药准字S10910113)、万泰(国药准字S10980090)三家国内厂家主流的酶联免疫试剂盒检测HBsAg的天然突变株(结果见表1)，

采用实施例1-5的试剂盒检测天然突变株的步骤如下：

将50μL待测样本和120μL浓度为500ng/mL的间接连接抗HBsAg抗体1的磁颗粒试剂反应10分钟后，形成磁性抗原-抗体复合物悬浮液；

将所述的磁性抗原-抗体复合物悬浮液置于磁场内，洗涤所述磁性抗原-抗体复合物；

将所述洗涤后的磁性抗原-抗体复合物与100μL浓度500ng/mL的吖啶酯标记的抗HBsAg抗体2反应10分钟后，形成磁性复合物悬浮液；

将所述的磁性复合物悬浮液置于磁场内，洗涤所述磁性复合物；

向所述的磁性复合物中注入100μL化学发光激发液1，1.5秒后，注入100μL化学发光激发液2，检测其化学发光光子强度；

将所述化学发光光子强度与Cutoff值比较，若样本化学发光光子强度大于cutoff值，判为阳性，若样本化学发光光子强度小于cutoff值，判为阴性，所述Cutoff值是为500例阴性样本发光值的平均值+2SD。

采用罗氏的进口化学发光免疫试剂盒检测HBsAg的天然突变株的步骤如下：

将50μL待测样本、2种生物素化的抗HBsAg单克隆抗体各50μL以及100μL钌复合物标记的抗S蛋白单抗和多抗反应10min，形成夹心复合物；

加入20μL链霉亲和素磁珠与所述的夹心复合物反应10min，形成磁性复合物悬浮液；

将所述的磁性复合物悬浮液置于磁场内，洗涤所述磁性复合物；

向所述的磁性复合物中注入100μL化学发光激发液1，1.5秒后，注入100μL化学发光激发液2，检测其化学发光光子强度；

将所述化学发光光子强度与Cutoff值比较，若样本化学发光光子强度大于cutoff值，判为阳性，若样本化学发光光子强度小于cutoff值，判为阴性，所述Cutoff值是为500例阴性样本发光值的平均值+2SD。

采用雅培的进口化学发光免疫试剂盒检测HBsAg的天然突变株的步骤如下：

将50μL待测样本和120μL顺磁微粒子试剂反应10分钟后，形成磁性抗原-抗体复合物悬浮液；

将所述的磁性抗原-抗体复合物悬浮液置于磁场内，洗涤所述磁性抗原-抗体复合物；

将所述洗涤后的磁性抗原-抗体复合物与100μL吖啶酯标记的抗HBsAg抗体反应10分钟后，形成磁性复合物悬浮液；

将所述的磁性复合物悬浮液置于磁场内，洗涤所述磁性复合物；

向所述的磁性复合物中注入100μL化学发光激发液1，1.5秒后，注入100μL化学发光激发液2，检测其化学发光光子强度；

将所述化学发光光子强度与Cutoff值比较，若样本化学发光光子强度大于cutoff值，判为阳性，若样本化学发光光子强度小于cutoff值，判为阴性，所述Cutoff值是为500例阴性样本发光值的平均值+2SD。

采用英科新创、科华、万泰国内厂家主流的酶联免疫试剂盒检测HBsAg的天然突变株的步骤如下：

将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按1:24稀释成工作洗涤液；

于反应板各孔中加50μL待测样品，再加入酶结合物50μL，充分混匀后，覆盖封口胶纸，置37℃水浴箱孵育30分钟；

取出已孵育完毕的反应板，洗板5次，拍干；

每孔加入显色剂A液、B液各50μL，轻轻震荡混匀后，覆盖封口胶纸，置37℃避光孵育15分钟；

每孔加入终止液50微升；

用酶标仪读数，取波长450nm，读取各孔OD值；

将所述OD值与Cutoff值比较，若OD值大于cutoff值，判为阳性，若OD值小于cutoff值，判为阴性，所述Cutoff值是为500例阴性样本发光值的平均值+2SD；

表1不同试剂盒对天然突变株的检测结果

注：所述效果例1的12株HBsAg天然突变株购买自德国PEI实验室，是精选出来考核世界各地的乙肝表面抗原诊断试剂对突变株的检出能力的。

由表1可见，三种国产主流酶联免疫试剂盒对上述HBsAg的天然突变株的检出率较低，并且各个厂家的酶联免疫试剂盒对不同突变株的检出能力不同；相比而言，两家进口的国际主流化学发光免疫试剂盒对突变株的检出能力比国产酶联免疫试剂盒高，但仍有一定的漏检；而本专利的化学发光免疫试剂盒对12株HBsAg的天然突变株的检出率均为100％，检测能力极强。

效果例2

由于效果例1采用的12株天然突变株仅代表HBsAg重要的突变，但并不能完全反应出试剂盒对实际临床病例的检出能力，于是本效果例筛选了500例临床上HBsAg突变发生率高的慢性肝病患者(包括慢性肝炎、肝硬化、肝癌病人)的阳性血液样本以及500例健康人体的阴性血液样本，通过效果例1的检测方法分别考察实施例1-6的试剂盒、英科新创、科华、万泰3家国内厂家主流的酶联免疫试剂盒以及罗氏、雅培的进口化学发光免疫试剂盒对血液样本中HBsAg的检出率，结果如表2。

表2不同试剂盒对临床血液样本的检测结果

由表3可见，从对500例阳性血液样本的检测结果看，两家进口的国际主流化学发光免疫试剂盒对临床阳性血液样本的检出能力比国产酶联免疫试剂盒高，但均低于本专利实施例1-6的化学发光免疫试剂盒的检出能力；从对500例阳性血液样本的检测结果看，本专利的试剂盒假阳性结果出现的概率极低。可见，本专利的HBsAg检测试剂盒具有高灵敏度和准确性。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。