α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株

摘要

本发明公开了α‑红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株，构建IPP和DMAPP合成质粒pS‑MVA以及α‑红没药醇合成质粒，再将两种质粒共同导入到大肠杆菌菌株

说明书

技术领域

本发明属于代谢工程领域，具体涉及一种α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株和应用。

背景技术

α-红没药醇（bisabolol）又称甜没药醇，是自然界中存在的一种天然倍半萜醇。它有几种旋光异构体如下所示：

他们分别在医药，食品和化妆品等行业发挥着重要的作用。(-)-α-红没药醇主要存在于菊科植物春黄菊花（Matricaria>）等植物中，具有抗菌、抗炎、抗微生物、抗消化等作用。它作为活性成分用于皮肤化妆品或抑制皮肤炎症，以保护和护理过敏性皮肤等。

美洲本土草药甜舌草（Lippia>）中含有的荷南度辛（hernandulcin）是一种天然的高效甜味剂，其的主链就是(+)-α-红没药醇。荷南度辛具有比蔗糖千倍以上的增甜能力，且不会像其它的合成甜味剂（如糖精、阿斯巴甜和三氯蔗糖）等对人体产生不好的影响。它可以作为理想的蔗糖的替代品为肥胖和糖尿病人群提供更好的甜品食物体验，而不产生高热量负担。因此，利用(+)-α-红没药醇合成荷南度辛，值得期待。此外，红没药醇还会散发出清淡令人愉快的香气，也是一种稳定性优良的定香剂，日益在香料香精化妆品的应用中受到重视。然而，α-红没药醇作为次级代谢产物，天然产量有限，以现行的生物质直接提取方式获取α-红没药醇还受制于生物体生长周期、环境、地域等诸多因素，且生产规模的扩张会危及生态和环境安全，甚至造成濒危植物消失的生态灾难。若采用化学合成的方式，α-红没药醇复杂手性化学结构，使得直接化学合成难度高，纯度低，生物活性差。

大肠杆菌(Escherichia>)作为最为广泛的模式微生物，相较于植物细胞，甚至其它一些微生物，具有生长周期短、遗传背景清晰、遗传操作简单成熟和易于规模扩大化培养等优点，因此，利用合成生物构建大肠杆菌微细胞工厂可以实现以廉价的碳源和培养基生产具有高附加值和广泛用途的α-红没药醇，是一条可持续发展的替代途径。

发明内容

本发明目的是提供一种α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株和应用，本发明构建了一种α-红没药醇合成质粒并导入大肠杆菌中获得大肠杆菌工程菌株，在大肠杆菌工程菌株合成α-红没药醇，还通过合成生物学方法优化工程菌株提高α-红没药醇产量。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种α-红没药醇合成质粒，α-红没药醇合成质粒是以pTrc99A载体为骨架质粒，该骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的人工合成型α-红没药醇合成酶基因或野生型α-红没药醇合成酶基因；所述人工合成型α-红没药醇合成酶基因选自人工合成型AaBBS基因、人工合成型LdBBS>MrBBS基因、人工合成型ScBBS基因以及人工合成型SsBBS基因中的任意一种，核苷酸序列分别如序列表SEQ>

当骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的人工合成型α-红没药醇合成酶基因时，所述α-红没药醇合成质粒的构建方法，包括如下步骤：

（1）ispA>

（2）所述人工合成型α-红没药醇合成酶基因克隆在所述质粒pT-ispA的BamHI和SalI位点之间，即分别获得质粒pT-IMr、pT-ILd、pT-IAa、pT-ISc、pT-ISs。

当骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的野生型α-红没药醇合成酶基因时，所述α-红没药醇合成质粒的构建方法，包括如下步骤：

（1）ispA>

（2）所述野生型ScBBS基因通过PCR的方法从>S.>基因组DNA扩增获取，所述野生型LdBBS和野生型MrBBS基因从相应的cDNA中扩增获取；所用基因引物序列如下：

上游引物ScBBS_WT–F的序列为>

下游引物ScBBS_WT-R的序列为5’-TAGCTCGAGAAGGCCCGTGCGTGTCATGGGTGGTAG-3’；

上游引物LdBBS_WT-F的序列为>

下游引物LdBBS_WT-R的序列为5’-TATCGTCGACTTATGGAAGAGGAATGGGTTC-3’；

上游引物MrBBS_WT-F的序列为5’-TGGATCCAAGGAGATATATCAAATGTCAACTTTATCAGTTTCTAC-3’；

下游引物MrBBS_WT–R的序列为5’-TAGAGTCGACTTAGACAATCATAGGGTGAACGAAG-3’；

（3）将步骤（2）扩增所得的基因片段插入到质粒pT-ispA的BamHI和SalI 位点之间，即分别获得质粒pT-ILdWT、pT-IMrWT和pT-IScWT。

一种大肠杆菌工程菌株，是由下列方法构建得到的：

（1）由粪肠球菌基因mvaES、>mvaK1DK2>

（2）按照权利要求2或3所述的构建方法构建权利要求1所述的α-红没药醇合成质粒，所述α-红没药醇合成质粒选自pT-IAa、pT-ILd、pT-IMr、pT-ISc以及pT-ISs中的任意一种，或者所述α-红没药醇合成质粒选自pT-ILdWT、pT-IScWT以及pT-IMrWT中的任意一种；

（3）将步骤（2）获得的α-红没药醇合成质粒与所述IPP和DMAPP合成质粒pS-MVA一起共转化到大肠杆菌菌株E.> DH5α中，得到大肠杆菌工程菌株。

所述大肠杆菌工程菌株在大肠杆菌合成α-红没药醇中的应用，具体步骤如下：挑取在固体培养基划线培养过夜的单菌落接种种子培养基，在30~37℃摇床振荡培养至OD₆₀₀为3左右。种子培养基为胰蛋白胨16g/L、酵母抽提物10g/L、氯化钠5g/L、氨苄青霉素100mg/L和氯霉素50mg/L。将培养好的种子按0.1>600接种到主培培养基，>

上述技术方案中的有关内容解释如下：

1、上述方案中，所述野生型LdBBS基因的Genbank登录号为JQ731636、野生型ScBBS基因的Genbank登录号为AB621339以及野生型MrBBS基因的Genbank登录号为KJ020282。

2、上述方案中，所述粪肠球菌的拉丁名为Enterococcus>，所述肺炎链球菌的拉丁名为Streptococcus>。

3、上述方案中，所述人工合成型AaBBS 基因的来源具体为黄花蒿（Artemisia>annua）α-红没药醇合成酶基因AaBBS；人工合成型LdBBS>Lippia>dulcis）α-红没药醇合成酶基因LdBBS；人工合成型MrBBS基因的来源具体为春黄菊花（Matricaria>）α-红没药醇合成酶基因（MrBBS）；人工合成型ScBBS基因的来源具体为放线菌（Streptomyces>）α-红没药醇合成酶基因；人工合成型SsBBS基因的来源具体为>Santalum spicatum）α-红没药醇合成酶基因SsBBS。

4、上述方案中，pSTV28质粒是现有的可通过商业渠道购买的质粒，生产厂家为Takara；IPP和DMAPP合成质粒pS-MVA的构建可参考现有技术文献：Yoon S. H., Lee S.H., Das A. et al. (2009). Combinatorial expression of bacterial wholemevalonate pathway for the production of β-carotene in>E.>coli.>

本发明的设计特点以及有益效果是：如同所有的萜类化合物一样，α-红没药醇的合成起始于异戊二烯焦磷酸（IPP， isopentenyl diphosphate）和其异构体双甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP, dimethylallyl diphosphate）。此两个焦磷酸前体在自然界中可以通过甲基赤藓糖醇（MEP）路径和甲羟戊酸（MVA）路径进行合成。MEP路径起始于甘油醛-3-磷酸和丙酮酸，主要存在于原核生物及植物质体中；MVA路径起始于乙酰辅酶A，主要存在于真核生物和少量细菌中。大肠杆菌具有一条天然的MEP路径，外源导入由6个酶基因（mvaES、mvaK1DK2、>idi）组成MVA途径同样可以实现IPP和DMAPP的大量合成。这两种基本的结构单元在法尼烯基焦磷酸（FPP，farnesyl>E. coli>DH5α，进而利用生物方法合成了α-红没药醇，产量高，活性高，绿色环保。

附图说明

附图1为本发明的α-红没药醇在大肠杆菌中的合成通路和构建示意图；

附图2为本发明的pSTV28质粒的结构图；

附图3为本发明的pTrc99A载体质粒的结构图；

附图4为本发明的pT-IMr、pT-ILd、pT-IAa、pT-ISc、pT-ISs以及pT-ILdWT、pT-IMrWT和pT-IScWT 载体构建路线图；

附图5为实施例的大肠杆菌工程菌株的菌株1合成(+)-α-红没药醇的GC-MS分析；

附图6为实施例的α-红没药醇在不同大肠杆菌工程菌株中的产量；

附图7为实施例的α-红没药醇在不同大肠杆菌工程菌株中的生长状况；

附图8为实施例的优化核糖体结合位点序列（RBS）提高α-红没药醇产量；

附图9为优化基因顺序提高α-红没药醇产量；

附图10为增加碳源供给提高α-红没药醇产量；

附图11为优化核糖体结合位点序列（RBS）的pT-I_iMr_j载体构建图；

附图12为优化核糖体结合位点序列（RBS）的pT-Mr_jI_i载体构建图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株

1、α-红没药醇合成质粒及其构建

α-红没药醇合成质粒是以pTrc99A载体为骨架质粒，该骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的人工合成型α-红没药醇合成酶基因或野生型α-红没药醇合成酶基因；所述人工合成型α-红没药醇合成酶基因选自密码子优化的人工合成型AaBBS>LdBBS>MrBBS基因、人工合成型ScBBS基因以及人工合成型SsBBS基因中的任意一种，核苷酸序列分别如序列表SEQ>

当骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的人工合成型α-红没药醇合成酶基因时，所述α-红没药醇合成质粒的构建方法，包括如下步骤：

（1）ispA 基因片段经PCR以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模版扩增获取，扩增的上游引物ispA-EcoR-F的序列为5’-ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC-3’（ 如SEQ IDNo.6所示）和下游引物ispA-BamH-R的序列为5’- TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG-3’ （ 如SEQ ID No.7所示）；扩增所得基因片段经过EcoRI和BamHI消化后插入到pTrc99A载体的EcoRI和BamHI两位点之间，获得质粒pT-ispA；

（2）所述密码子优化的人工合成型α-红没药醇合成酶基因在合成时分别在质粒pT-ispA的上游引入BamHI位点， 在下游引入BglII和SalI位点，密码子优化的人工合成型α-红没药醇合成酶基因经BamHI和SalI消化后插入到pT-ispA的BamHI和SalI位点之间，即分别获得质粒pT-IMr、pT-ILd、pT-IAa、pT-ISc、pT-ISs。

当骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的野生型α-红没药醇合成酶基因时，所述α-红没药醇合成质粒的构建方法，包括如下步骤：

（1）ispA 基因片段经PCR以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模版扩增获取，扩增的上游引物ispA-EcoR-F的序列为5’-ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC-3’ （ 如SEQ IDNo.6所示）和下游引物ispA-BamH-R的序列为5’- TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG-3’ （ 如SEQ ID No.7所示）；扩增所得基因片段经过EcoRI和BamHI消化后插入到pTrc99A载体的EcoRI和BamHI两位点之间，获得质粒pT-ispA；

（2）所述野生型ScBBS基因通过PCR的方法从>S.>基因组DNA扩增获取，所述野生型LdBBS和野生型MrBBS基因从相应的cDNA中扩增获取；所用基因引物序列如下：

上游引物ScBBS_WT–F的序列为>

下游引物ScBBS_WT-R的序列为5’-TAGCTCGAGAAGGCCCGTGCGTGTCATGGGTGGTAG-3’>

上游引物LdBBS_WT-F的序列为>

下游引物LdBBS_WT-R的序列为5’-TATCGTCGACTTATGGAAGAGGAATGGGTTC-3’>

上游引物MrBBS_WT-F的序列为5’-TGGATCCAAGGAGATATATCAAATGTCAACTTTATCAGTTTCTAC-3’>

下游引物MrBBS_WT–R的序列为5’-TAGAGTCGACTTAGACAATCATAGGGTGAACGAAG-3’>

（3）将步骤（2）扩增所得的基因片段插入到质粒pT-ispA的BamHI和SalI 位点之间，即分别获得质粒pT-IScWT、pT-ILdWT和pT-IMrWT。

2、大肠杆菌工程菌株的构建以及应用

大肠杆菌工程菌株的构建方法如下：

（1）由粪肠球菌基因mvaES、>mvaK1DK2>idi组成完整的IPP和DMAPP合成操纵子，将IPP和DMAPP合成操纵子克隆到pSTV28质粒的EcoRI>lac的驱动，得到IPP和DMAPP合成质粒pS-MVA；

（2）按照上述方法构建所述的α-红没药醇合成质粒，所述α-红没药醇合成质粒选自pT-IAa、pT-ILd、pT-IMr、pT-ISc以及pT-ISs中的任意一种，或者所述α-红没药醇合成质粒选自pT-ILdWT、pT-IScWT以及pT-IMrWT中的任意一种；

（3）将步骤（2）获得的α-红没药醇合成质粒与所述IPP和DMAPP合成质粒pS-MVA一起共转化到大肠杆菌菌株E. coli>DH5α中，得到大肠杆菌工程菌株。

所述大肠杆菌工程菌株在大肠杆菌合成α-红没药醇中的应用，具体步骤如下：挑取在固体培养基划线培养过夜的单菌落接种种子培养基，在30~37℃摇床振荡培养至OD₆₀₀为3左右。种子培养基为胰蛋白胨16g/L、酵母抽提物10g/L、氯化钠5g/L、氨苄青霉素100mg/L和氯霉素50mg/L。将培养好的种子按0.1>600接种到主培培养基，>

表1 大肠杆菌工程菌株命名如下：

菌株名描述菌株1E. coli>DH5α 共转化质粒 pS-MVA和pT-ILdWT菌株2E. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT- ILd菌株3E. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT- IScWT菌株4E. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT- ISc菌株5E.> DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IMrWT菌株6E. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IMr菌株7E.> DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IAa菌株8E. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-ISs

3、α-红没药醇产量的测定

α-红没药醇产量的测定通过气相色谱（GC）法进行。摇瓶培养到规定时间（48 h）后，离心分离所覆盖的癸烷，α-红没药醇能够被萃取到癸烷中。然后上样1μL 到气相色谱仪。柱温箱控温程序为：50°C 保持1min；以20°C/min升温到200°C，然后再以10°C/min升温到260°C，保持2min。色谱柱为安捷伦HP-INNOWAX 133。测量析出α-红没药醇峰面积。以α-红没药醇标准品标定各菌株产量。大肠杆菌工程菌株1~8在摇瓶中培养48h，然后从摇瓶分离癸烷有机层。以菌株1为例，气相色谱分析显示在保留时间10.88min 有一个明显大峰。气质联用分析（GC-MS）确定为(+)-α-红没药醇。同时还在7.42min和11.86min检测到两个很小的峰分别为α-红没药烯和法尼烯。此外还有大肠杆菌宿主色氨酸（Try）代谢调控产物吲哚（保留时间）12.79min。此结果说明经编辑构建的大肠杆菌工程菌株能够合成α-红没药醇，且α-红没药醇是合成的主要产物，占比达到95%以上，参见附图5所示。

4、不同工程菌株合成α-红没药醇的产量比较

大肠杆菌工程菌株1-8在摇瓶中培养48h，然后从摇瓶分离癸烷有机层。GC分析定量结果如附图6所示。不同物种来源的α-红没药醇合成酶展现出不同的活性，使得α-红没药醇产量在各菌株中产量各异。优化密码子方面，优化LdBBS基因密码子对α-红没药醇产量的提升效果不明显；而优化ScBBS和MrBBS基因密码子对产量有明显提升。总体而言，甜舌草α-红没药醇合成酶（LdBBS）、放线菌α-红没药醇合成酶（ScBBS）、春黄菊花α-红没药醇合成酶（MrBBS）、黄花蒿α-红没药醇合成酶（AaBBS）具有较高的酶活性，可以在摇瓶培养方式下合成α-红没药醇>

5、优化核糖体结合位点序列（RBS）提高α-红没药醇产量

在所有工程菌株中，FPP合成酶基因和α-红没药醇合成酶基因的表达协调水平决定了α-红没药醇合成操纵子的合成效率。优化核糖体结合位点序列（RBS）是一种有效的协调操纵子内基因表达水平的有效策略。工程菌株6中，ispA基因和MrBBS基因起始密码前RBS序列为RBS_A和RBS₁。根据在线软件预测为其起始强度分别为100单位和1000单位。以此菌株（菌株6）为例，为优化α-红没药醇合成操纵子中两基因翻译起始的能力进而调控两个酶的表达水平。本发明设计不同强度的RBS序列如下：

IspA 基因RBS序列：

RBS_AATAAGGTAAAGGT>

RBS_BAAGGAGCAGTCGAAGA>

RBS_CGGGAGGTTTTCAGTA>

RBS_DAAGGAGGTTACGGAAA>

MrBBS 基因RBS序列：

RBS₁AAGGAGATATATCAA>

RBS₂AGGAGGTAAAAGTTC>

RBS₃ATAAAGGAGGTAAGA>

以此序列调控ispA基因和MrBBS基因的表达水平，构建12株工程菌株A1-D3，如表2所示。采用摇瓶培养48h后，GC分析定量产量如附图8所示。>

表2

菌株名描述菌株A1E. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IAMr1 (此菌株等同于菌株6)菌株A2E.> DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IAMr2菌株A3E. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IAMr3菌株B1E. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IBMr1菌株B2E. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IBMr2菌株B3E. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IBMr3菌株C1E.> DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-ICMr1菌株C2E. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-ICMr2菌株C3E. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-ICMr3菌株D1E. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IDMr1菌株D2E. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IDMr2菌株D3E. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-IDMr3菌株1AE. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr1IA菌株1BE. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr1IB菌株1CE. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr1IC菌株1DE. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr1ID菌株2AE. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr2IA菌株2BE. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr2IB菌株2CE. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr2IC菌株2DE. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr2ID菌株3AE. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr3IA菌株3BE. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr3IB菌株3CE. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr3IC菌株3DE. coli>DH5α 共转化质粒pS-MVA和pT-Mr3ID

设计ispA基因和MrBBS基因引物如下：

IspA_A-F：ACGGATCCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC（>

IspA_B-F：ACGGATCCGGGAGGTTTTCAGTAATGGACTTTCCGCAGCAAC（>

IspA_C-F：ACGGATCC>

IspA_D-F：ACGGATCCAAGGAGGTTACGGAAAATGGACTTTCCGCAGCAAC（>

IspA-R：TATC GTCGACTCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG（ 如SEQ ID No.18所示）；

MrBBS₂-F：ACGGATCCAGGAGGTAAAAGTTCATGTCAACCCTGTCAGTCTCC（>

MrBBS₃-F：ACGGATCC>

MrBBS-R：TATCGTCGACTCTAAGATCTTCACACAATCATCGGGTG（ 如SEQ ID No.21所示）。

利用PCR的方法可以扩增得到具有不同RBS序列的ispA_i>j（j=2，3）和酶切得到的MrBBS₁。在所以片段的上游都有BamHI位点，下游都有BglII>ispA_i>i（i=A,B,C,D），再将经过BamHI和SalI消化的MrBBS_j（j=1，2，3）插入到pT-ispAi质粒的BgllI和SalI之间，即可获取pT-IiMrj系列的质粒。调整ispA_i（i=A,B,C,D）和MrBBS_j（j=1，2，3）插入到pTrc99A的先后顺序，即可获取pT-MrjIi系列的质粒。两系列质粒构建路线图如附图11所示。

6、优化α-红没药醇合成操纵子基因顺序提高α-红没药醇产量

操纵子中基因的表达受到启动子表达极性的影响，同时基因转录形成的二级结构也会影响着RBS的翻译起始效率, 进而影响α-红没药醇合成操纵子合成效率。将ispA基因和MrBBS基因表达顺序调整，构建12株新型工程菌株1A-3D。采用摇瓶培养48h后，GC分析定量产量如附图9所示。菌株3D合成α-红没药醇1578mg/L，比起始菌株（1A）高出1.15倍。

7、增加培养基碳源共计提高α-红没药醇产量

将培养基中碳源增加到3%（v/v），考察菌株菌株D3和3D在重组碳源下合成α-红没药醇的能力。α-红没药醇在摇瓶培养条件下合成产量如附图10所示。碳源增加使得在48小时时，菌株6合成α-红没药醇产量达到1743mg/L,比碳源为3%（v/v）提高了1.4倍；到72小时时产量继续增加到1878mg/L，表明培养基优化有继续提高α-红没药醇产量的潜力。菌株D3和3D合成随培养时间逐渐增加，约在48小时达到顶峰。α-红没药醇产量分别为2042mg/L 和2090mg/L，比菌株6在相同条件产量提高1.17倍和1.12倍，表明优化菌株比原始菌株更强的合成α-红没药醇的能力。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州大学

<120> α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1678

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatccaagg agatatatca aatgtcgctg accgaagaaa aaccgatccg tccgattgct 60

aatttctcgc cgtccatttg gggtgaccag ttcctgattt acgataatca ggttgaacaa 120

ggcgtcgaac agatcgtgaa agacctgaaa aaagaagtgc gtcaactgct gaaagaagca 180

ctggatattc cgatgaaaca tgctaacctg ctgaaactgg tggacgaaat tcagcgcctg 240

ggtatctcgt acctgtttga acaggaaatc gatcatgcac tgcaacacat ttatgaaacg 300

tacggcgata attggtcagg tgaccgtagc tctctgtggt ttcgtctgat gcgcaaacag 360

ggctactttg ttacctgcga tgtcttcaac aatcataaag acgaatccgg cgtcttcaaa 420

caatcactga aaaaccacgt ggaaggtctg ctggaactgt atgaagccac gagcatgcgt 480

gtcccgggtg aaattatcct ggaagatgca ctggtgttta cccagtcgca cctgagcatt 540

atcgctaaag acacgctgtc gatcaatccg gcgctgagca ccgaaattca gcgcgccctg 600

aaaaaaccgc tgtggaaacg tctgccgcgc atcgaagcgg ttcaatacat tccgttttat 660

gaacagcaag attcccataa caaaaccctg attaaactgg ccaaactgga atttaatctg 720

ctgcagtcac tgcaccgtga agaactgtct caactgagta aatggtggaa agcgttcgat 780

gttaaaaaca atgccccgta ctctcgtgac cgcattgtcg aatgctattt ttgggcgctg 840

gcctctcgct tcgaaccgca gtatagtcgt gcgcgcatct ttctggcaaa agtgattgct 900

ctggttacgc tgattgatga catctatgat gcgtacggca cgtatgaaga actgaaaatt 960

ttcaccgaag ccatcgaacg ttggagtatt acctgcctgg atatgatccc ggaatacatg 1020

aaaccgatct acaaactgtt catggacacg tataccgaaa tggaagaaat cctggcaaaa 1080

gaaggcaaaa ccaacatctt caactgtggt aaagaatttg ttaaagattt cgtgcgcgtt 1140

ctgatggtcg aagctcagtg gctgaacgaa ggccatatcc cgaccacgga agaactggat 1200

agcattgcag tgaacctggg cggtgctaat ctgctgacca cgacctgtta cctgggcatg 1260

tctgacatcg tgaccaaaga agcgtttgaa tgggccgtta gtgaaccgcc gctgctgcgt 1320

tataaaggca ttctgggtcg tcgcctgaat gatctggcgg gtcataaaga agaacaggaa 1380

cgcaaacacg tcagttcctc agtggaatcg tacatgaaag aatataacgt tagcgaagaa 1440

tacgccaaaa atctgctgta taaacaggtg gaagacctgt ggaaagacat caaccgtgaa 1500

tacctgatta cgaaaaccat cccgcgcccg ctgctggtcg cagtgattaa tctggttcac 1560

tttctggatg tcctgtatgc tgaaaaagac aacttcaccc gcatgggcga agaatacaaa 1620

aatctggtga aatccctgct ggtttatccg atgtcaattt aaagatctta gagtcgac 1678

<210> 2

<211> 1641

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaactcaa cctcccgccg ctccgctaac tacaaaccga ccatctggaa caacgaatat 60

ctgcaatctc tgaactcaat ctacggtgaa aaacgttttc tggaacaggc cgaaaaactg 120

aaagatgaag tgcgcatgct gctggaaaaa acctccgacc cgctggatca tattgaactg 180

gtggacgttc tgcagcgtct ggcaatctca tatcacttca cggaatacat tgatcgcaat 240

ctgaaaaaca tctatgacat tctgatcgat ggccgtcgct ggaatcatgc tgataacctg 300

cacgcgacca cgctgagttt tcgtctgctg cgccagcatg gttatcaagt ctccccggaa 360

gtgtttcgca atttcatgga tgaaaccggc aatttcaaga aaaacctgtg cgatgacatt 420

aaaggtctgc tgtcactgta tgaagcatcg tacctgctga ccgaaggcga aacgatcatg 480

gatagcgcac aggcttttgc gacccatcac ctgaaacaaa aactggaaga aaacatgaac 540

aaaaacctgg gtgatgaaat tgcccatgca ctggaactgc cgctgcactg gcgtgttccg 600

aaactggacg tccgctggtc gatcgatgcc tatgaacgtc gccaggatat gaatccgctg 660

ctgctggaac tggccaaact ggactttaac attgcacagt caatgtatca agatgaactg 720

aaagaactga gtcgttggta ctccaaaacc catctgccgg aaaaactggc tttcgcgcgt 780

gatcgcctgg ttgaaagcta tctgtggggc ctgggtctgg cctctgaacc gcatcacaaa 840

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attaaatatc tggaacagct gccggaatac atgcaaatct gctttctggc gctgttcaat 1020

accgttaacg aacgctctta tgactttctg ctggataaag gcttcaatgt cattccgcat 1080

agctcttatc gttgggctga actgtgtaaa acgtacctga tcgaagcgaa ctggtatcac 1140

agtggttaca aaccgtccct gaatgaatat ctgaaccagg gcctgatttc agttgccggt 1200

ccgcatgcac tgtcgcacac ctacctgtgt atgacggaca gtctgaaaga aaaacatatc 1260

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tgccatatgc acgataccgg ctgtaatgaa gaagaaacgc gcgcgtatat taaaaacctg 1440

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gatttccgta cggcagcaat gaacggtgcc cgcgtcagtc agtttatgta tcaatacgat 1560

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatccaagg agatatatca aatgtcaacc ctgtcagtct ccacgccgtc cttctcatcg 60

tcgccgctgt cctcagtgaa caaaaatagc acgaaacaac acgttacgcg caatagtgtg 120

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ctgccggaat acatgaaact gatctaccat gaacagttcc gtgtgcacca agaaatggaa 1140

gaatctctgg aaaaagaagg taaagcatac cagatccatt acatcaaaga aatggctaaa 1200

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cataaagaag aacaggaacg cggccacatc gcctcatcga ttgaatgcta tcgtaaagaa 1500

accggtgcat ctgaagaaga agcgtgtatg gattttctga aacaggtcga agacggctgg 1560

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<212> DNA

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ctggacattc tgggttggtt taccatcctg gatgaccgtt tcgatggccc ggttggtcat 300

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agccgcaatc aggcggtgca agtggttcgt acccgcgttc gtcgcctgcg tgatgactct 840

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