泡沫分离法浓缩人尿中尿激酶的方法

摘要

本发明的技术方案属于生物分离领域，尤其涉及泡沫分离法浓缩人尿中尿激酶的方法。该工艺包括：第一步，合格尿液的检测；第二步，合格尿液的预处理；第三步，两级泡沫分离工艺。该工艺通过加入尿激酶活性稳定剂有效抑制了泡沫分离过程中气‑液界面诱导的尿激酶失活，大幅提高了尿激酶活性的富集比(尿激酶活性富集比为100.0～233.3)，又能增大回收率(高尿激酶总活性收率为75.0～90.0％)。

说明书

技术领域

本发明的技术方案属于生物分离领域，尤其涉及泡沫分离法浓缩人尿中尿激酶的方法。

背景技术

尿激酶，是从健康人尿中分离的，或从人肾组织或动物细胞培养中获得的一种酶蛋白。它可将不具有丝氨酸蛋白酶活性的纤溶酶原激活从而发挥其溶栓作用，在临床上可预防和控制心肌梗死和脑血栓等疾病。

尿激酶的主要来源于人尿。目前，从人尿中分离尿激酶的方法主要包括沉淀法和吸附法，其中后者使用最为广泛。但是，人尿中尿激酶含量很低，造成沉淀法和吸附法的成本较高。泡沫分离技术具有低浓度下效率高、成本低和无污染等优点，在分离低浓度蛋白质方面有明显的优势。

泡沫可以诱导蛋白质变性是降低蛋白质泡沫分离效果的主要原因之一。对此问题，上述及目前研究并未采取任何有效技术以减少泡沫诱导的尿激酶失活。

发明内容

发明的目的：为了提供一种效果更好的泡沫分离法浓缩人尿中尿激酶的方法，具体目的见具体实施部分的多个实质技术效果。

为了达到如上目的，本发明采取如下技术方案：

泡沫分离法浓缩人尿中尿激酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

合格尿液的预处理：

向收集到的合格尿液中加入尿激酶活性稳定剂，加入质量为尿液质量的0.2～0.5％，然后调节尿液pH至8.7；

两级泡沫分离工艺：

第一级泡沫分离工艺：对预处理尿液进行泡沫分离，用泡沫分离塔间歇分离，温度为20.0～30.0℃，表观气速为1.7～3.4mm/s，液层高度为1.0～1.6m，泡沫层高度为0.6～1.2m，对流出塔顶的泡沫进行收集并消泡，待泡沫不能从塔顶流出时，即可停止鼓气；从塔顶流出的泡沫经过消泡后得到第一级消泡液，其尿激酶活性浓度为50.0～80.0IU/mL，该消泡液直接作为第二级泡沫分离的进料；

第二级泡沫分离工艺：将第一级分离得到的消泡液进行泡沫分离，用泡沫分离塔间歇分离，温度为35.0～45.0℃，表观气速为0.8～2.6mm/s，液层高度为0.8～1.2m，泡沫层高度为0.8～1.4m，对流出塔顶的泡沫进行收集并消泡，待泡沫不能从塔顶流出时，即可停止鼓气；从塔顶流出的泡沫经过消泡方法后得到第二级消泡液，其尿激酶活性浓度为500.0～700.0IU/mL，该消泡液作为亲和层析法纯化尿激酶的原料；泡沫分离塔内所剩残液的尿激酶活性浓度为15.0～35.0IU/mL，该残液稀释至与合格尿液的尿激酶活性浓度相同，与预处理尿液混合均匀后，作为第一级泡沫分离的进料液。

本发明进一步技术方案在于，在合格尿液的预处理之前还包含对合格尿液检测的步骤，该步骤为合格尿液的pH值为5.0～6.5，尿激酶活性浓度为3.0～5.0IU/mL。

本发明进一步技术方案在于，所述尿激酶活性稳定剂是β-环糊精、α-环状糊精、γ-环状糊精、羟丙基β环糊精或钼酸钠。

本发明进一步技术方案在于，所述消泡方法为机械消泡法。

本发明进一步技术方案在于，所述两级泡沫分离工艺是采用如下两级泡沫分离装置来实现的：两级泡沫分离装置包含空气泵，空气泵连接着转子流量计，转子流量计连接着止水夹，管道通过止水夹后通向两个泡沫分离塔，两个泡沫分离塔分别为泡沫分离塔以及二级泡沫分离塔，所述的泡沫分离塔上方包含多个上方部分开口，所述的多个上方部分开口通过导向管连接到二级泡沫分离塔；所述的两个泡沫分离塔上方分别连接着泡沫收集器。

本发明进一步技术方案在于，在泡沫分离塔中上方的多个上方部分开口能够将泡沫通过导向管导向到二级泡沫分离塔中，能提高泡沫分离的效率。

采用如上技术方案的本发明，相对于现有技术有如下有益效果：泡沫分离技术是一项基于溶液中溶质表面活性的表面吸附差异，利用上升泡沫作为分离介质的分离技术，在生物分离领域得到日益广泛的应用。该技术的优点在于设备简单、投资少、能耗小、操作方便和无污染。本发明工艺方法首次将两级泡沫分离技术应用于浓缩人尿中的尿激酶，并通过添加尿激酶活性稳定剂来提高分离效果，经过两级泡沫分离的连续浓缩，第二级消泡液中的尿激酶活性浓度达到500.0～700.0IU/mL，尿激酶活性富集比达到100.0～233.3，可直接作为后续纯化步骤的原料；将第二级泡沫分离的残液经稀释后与预处理尿液混合后可作为第一级泡沫分离的进料液。这样的两级泡沫分离工艺既能有效浓缩人尿中的尿激酶活性，又能提高尿激酶总活性收率(75.0～90.0％)，因此可以有效降低尿激酶分粗分离成本。

附图说明

为了进一步说明本发明，下面结合附图进一步进行说明：

图1为发明的结构示意图；

1.空气泵；2.转子流量计；3.止水夹；4.气体分布器；5.泡沫分离塔；6.泡沫收集器；7.气管一；8.气管二；9.上方部分开口；10.阀门；11.上方气体口；12.导向管；13.二级泡沫分离塔。

本附图为本装置主要部件组成的示意图，不代表本发明的外形尺寸、连接方式、装配形式、位置关系等，图示省略了部分手动阀门、管件等。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。需要说明的是，下面描述中使用的词语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”和“下”指的是附图中的方向，词语“内”和“外”分别指的是朝向或远离特定部件几何中心的方向。

本专利提供多种并列方案，不同表述之处，属于基于基本方案的改进型方案或者是并列型方案。每种方案都有自己的独特特点。

实施例1

a.合格尿液的检测：

合格尿液应当澄清，其pH值为5.5，按照中国药典(2005年版)测定尿激酶活性浓度为3.3IU/mL；

b.合格尿液的预处理：

向收集到的合格尿液中加入β-环糊精，加入质量为尿液质量的0.2％，然后调节尿液pH至8.7；

c.两级泡沫分离工艺：

第一级泡沫分离工艺：对预处理尿液进行泡沫分离，用泡沫分离塔间歇分离，温度为20.0～22.0℃，表观气速为1.7～1.9mm/s，液层高度为1.4～1.5m，泡沫层高度为0.6～0.7m，对流出塔顶的泡沫进行收集并消泡，待泡沫不能从塔顶流出时，即可停止鼓气。从塔顶流出的泡沫经过机械消泡后得到第一级消泡液，其尿激酶活性浓度为60.0～65.0IU/mL，该消泡液直接作为第二级泡沫分离的进料；

第二级泡沫分离工艺：将第一级分离得到的消泡液进行泡沫分离，用泡沫分离塔间歇分离，温度为35～37℃，表观气速为0.9～1.1mm/s，液层高度为0.8～0.9m，泡沫层高度为0.8～0.9m，对流出塔顶的泡沫进行收集并消泡，待泡沫不能从塔顶流出时，即可停止鼓气。从塔顶流出的泡沫经过机械消泡后得到第二级消泡液，其尿激酶活性浓度为500.0～550.0IU/mL，富集比为151.5～166.7，该消泡液作为亲和层析法纯化尿激酶的原料；泡沫分离塔内所剩残液的尿激酶活性浓度为20.0～25.0IU/mL，该残液稀释至与合格尿液的尿激酶活性浓度相同，与预处理尿液混合均匀后，作为第一级泡沫分离的进料液。尿激酶的总活性收率为75.0～80.0％。

实施例2

a.合格尿液的检测：

合格尿液应当澄清，其pH值为5.5，按照中国药典(2005年版)测定尿激酶活性浓度为4.2IU/mL；

b.合格尿液的预处理：

向收集到的合格尿液中加入α-环状糊精，加入质量为尿液质量的0.3％，然后调节尿液pH至8.7；

c.两级泡沫分离工艺：

第一级泡沫分离工艺：对预处理尿液进行泡沫分离，用泡沫分离塔间歇分离，温度为24.0～26.0℃，表观气速为2.1～2.3mm/s，液层高度为1.0～1.1m，泡沫层高度为1.0～1.1m，对流出塔顶的泡沫进行收集并消泡，待泡沫不能从塔顶流出时，即可停止鼓气。从塔顶流出的泡沫经过机械消泡后得到第一级消泡液，其尿激酶活性浓度为50.0～55.0IU/mL，该消泡液直接作为第二级泡沫分离的进料；

第二级泡沫分离工艺：将第一级分离得到的消泡液进行泡沫分离，用泡沫分离塔间歇分离，温度为40.0～42.0℃，表观气速为1.2～1.4mm/s，液层高度为0.9～1.0m，泡沫层高度为1.0～1.1m，对流出塔顶的泡沫进行收集并消泡，待泡沫不能从塔顶流出时，即可停止鼓气。从塔顶流出的泡沫经过机械消泡后得到第二级消泡液，其尿激酶活性浓度为530.0～580.0IU/mL，富集比为129.2～138.0，该消泡液作为亲和层析法纯化尿激酶的原料；泡沫分离塔内所剩残液的尿激酶活性浓度为23.0～28.0IU/mL，该残液稀释至与合格尿液的尿激酶活性浓度相同，与预处理尿液混合均匀后，作为第一级泡沫分离的进料液。尿激酶的总活性收率为80.0～85.0％。

实施例3

a.合格尿液的检测：

合格尿液应当澄清，其pH值为5.5，按照中国药典(2005年版)测定尿激酶活性浓度为5IU/mL；

b.合格尿液的预处理：

向收集到的合格尿液中加入γ-环状糊精，加入质量为尿液质量的0.4％，然后调节尿液pH至8.7；

c.两级泡沫分离工艺：

第一级泡沫分离工艺：对预处理尿液进行泡沫分离，用泡沫分离塔间歇分离，温度为28～30℃，表观气速为2.8～3.0mm/s，液层高度为0.8～0.9m，泡沫层高度为1.1～1.2m，对流出塔顶的泡沫进行收集并消泡，待泡沫不能从塔顶流出时，即可停止鼓气。从塔顶流出的泡沫经过机械消泡后得到第一级消泡液，其尿激酶活性浓度为50～55IU/mL，该消泡液直接作为第二级泡沫分离的进料；

第二级泡沫分离工艺：将第一级分离得到的消泡液进行泡沫分离，用泡沫分离塔间歇分离，温度为43.0～45.0℃，表观气速为2.3～2.5mm/s，液层高度为0.8～0.9m，泡沫层高度为1.3～1.4m，对流出塔顶的泡沫进行收集并消泡，待泡沫不能从塔顶流出时，即可停止鼓气。从塔顶流出的泡沫经过机械消泡后得到第二级消泡液，其尿激酶活性浓度为550.0～600.0IU/mL，富集比为110.0～120.0，该消泡液作为亲和层析法纯化尿激酶的原料；泡沫分离塔内所剩残液的尿激酶活性浓度为15.0～20.0IU/mL，该残液稀释至与合格尿液的尿激酶活性浓度相同，与预处理尿液混合均匀后，作为第一级泡沫分离的进料液。尿激酶的总活性收率为85～90％。

实施例4

a.合格尿液的检测：

合格尿液应当澄清，其pH值为5.5，按照中国药典(2005年版)测定尿激酶活性浓度为3.0IU/mL；

b.合格尿液的预处理：

向收集到的合格尿液中加入钼酸钠，加入质量为尿液质量的0.3％，然后调节尿液pH至8.7；

c.两级泡沫分离工艺：

第一级泡沫分离工艺：对预处理尿液进行泡沫分离，用泡沫分离塔间歇分离，温度为28.0～30.0℃，表观气速为2.0～2.2mm/s，液层高度为1.5～1.6m，泡沫层高度为1.1～1.2m，对流出塔顶的泡沫进行收集并消泡，待泡沫不能从塔顶流出时，即可停止鼓气。从塔顶流出的泡沫经过机械消泡后得到第一级消泡液，其尿激酶活性浓度为70～75IU/mL，该消泡液直接作为第二级泡沫分离的进料；

第二级泡沫分离工艺：将第一级分离得到的消泡液进行泡沫分离，用泡沫分离塔间歇分离，温度为43～45℃，表观气速为0.8～0.9mm/s，液层高度为1.0～1.1m，泡沫层高度为1.3～1.4m，对流出塔顶的泡沫进行收集并消泡，待泡沫不能从塔顶流出时，即可停止鼓气。从塔顶流出的泡沫经过机械消泡后得到第二级消泡液，其尿激酶活性浓度为650.0～700.0IU/mL，富集比为216.7～233.3，该消泡液作为亲和层析法纯化尿激酶的原料；泡沫分离塔内所剩残液的尿激酶活性浓度为30.0～35.0IU/mL，该残液稀释至与合格尿液的尿激酶活性浓度相同，与预处理尿液混合均匀后，作为第一级泡沫分离的进料液。尿激酶的总活性收率为75.0～80.0％。

比较例1

a.合格尿液的检测：

合格尿液应当澄清，其pH值为5.5，按照中国药典(2005年版)测定尿激酶活性浓度为4.2IU/mL；

b.合格尿液的预处理：

调节合格尿液pH至8.7；

c.两级泡沫分离工艺：

第一级泡沫分离工艺：对预处理尿液进行泡沫分离，用泡沫分离塔间歇分离，温度为24.0～26.0℃，表观气速为2.1～2.3mm/s，液层高度为1.0～1.1m，泡沫层高度为1.0～1.1m，对流出塔顶的泡沫进行收集并消泡，待泡沫不能从塔顶流出时，即可停止鼓气。从塔顶流出的泡沫经过机械消泡后得到第一级消泡液，其尿激酶活性浓度为45.0～50.0IU/mL，该消泡液直接作为第二级泡沫分离的进料；

第二级泡沫分离工艺：将第一级分离得到的消泡液进行泡沫分离，用泡沫分离塔间歇分离，温度为40.0～42.0℃，表观气速为1.2～1.4mm/s，液层高度为0.9～1.0m，泡沫层高度为1.0～1.1m，对流出塔顶的泡沫进行收集并消泡，待泡沫不能从塔顶流出时，即可停止鼓气。从塔顶流出的泡沫经过机械消泡后得到第二级消泡液，其尿激酶活性浓度为300.0～350.0IU/mL，富集比为71.4～83.3，该消泡液作为亲和层析法纯化尿激酶的原料；泡沫分离塔内所剩残液的尿激酶活性浓度为20.0～25.0IU/mL，该残液稀释至与合格尿液的尿激酶活性浓度相同，与预处理尿液混合均匀后，作为第一级泡沫分离的进料液。尿激酶的总活性收率为40.0～45.0％。

与实施例2做对比，当合格尿液中不添加尿激酶活性稳定剂时，尿激酶活性的富集比和回收率都显著降低。这是因为两级泡沫分离工艺过程中大量的气-液界面会诱导部分尿激酶分子结构展开从而失去活性，因而会降低尿激酶的活性富集比和收率；但是，当尿激酶活性稳定剂存在时，可以减少气-液界面诱导的尿激酶变性或者辅助失活的尿激酶复性，从而提高尿激酶的活性富集比和收率。

作为进一步的改进，两级泡沫分离工艺可以采用本专利提供的装置实现：

所述两级泡沫分离工艺是采用如下两级泡沫分离装置来实现的：两级泡沫分离装置包含空气泵1，空气泵连接着转子流量计2，转子流量计连接着止水夹3，管道通过止水夹后通向两个泡沫分离塔，两个泡沫分离塔分别为泡沫分离塔5以及二级泡沫分离塔13，所述的泡沫分离塔上方包含多个上方部分开口9，所述的多个上方部分开口9通过导向管连接到二级泡沫分离塔13；所述的两个泡沫分离塔上方分别连接着泡沫收集器6。在泡沫分离塔5中上方的多个上方部分开口9能够将泡沫通过导向管导向到二级泡沫分离塔13中，能提高泡沫分离的效率。相对于现有技术，采用本结构能够避免泡沫分离塔5上方抽出，能在泡沫产生的过程中持续就能抽出。

所述的导向管上包含阀门，阀门能够开闭。

作为进一步的改进，泡沫分离塔5上方包含上方气体口，随后气体能够被导入到二级泡沫分离塔13中，进一步利用气体。当然气体也可以通过下方通入。

开创性地，以上各个效果独立存在，还能用一套结构完成上述结果的结合。

以上结构实现的技术效果实现清晰，如果不考虑附加的技术方案，本专利名称还可以是一种新型分离方法。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。