一种高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法

摘要

本发明属于基因检测领域，涉及一种高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法。本发明将人全基因组DNA提取后利用特异性引物扩增线粒体DNA，扩增产物纯化后进行打断反应，回收目的片段后进行修饰和接上测序接头得到DNA文库，测序并分析数据。本发明所述的方法能够快速、全面、同时检测人体整个线粒体DNA基因存在的突变、缺失等信息，具有省时省力，特异性强的特点，其不仅能够及时发现线粒体疾病的存在，而且丰富线粒体疾病的数据库，从而可以为临床诊断提供依据。

说明书

技术领域

本发明属于基因检测领域，涉及一种高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法。

背景技术

线粒体是真核细胞中一种重要的细胞器，为细胞的氧化磷酸化提供了场所，在细胞能量代谢、细胞凋亡、维持细胞内钙铁离子平衡等生命活动中起着至关重要的作用。人类线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)存在于细胞质线粒体中，全长16569bp。它呈双链闭合环状结构，分为编码区和非编码区两部分，其中编码区有37个基因，包括22个编码转移核糖核酸(tRNA)、2个编码核糖体核糖核酸(12S和16SrRNA)，13个编码多肽。mtDNA基因排列紧密,序列之间不包含内含子。与核DNA相比，mtDNA具有如下特点：(1)有独特的母系遗传特性，mtDNA随母本的卵细胞传递给子代；(2)多拷贝数，人类每个体细胞中含有成百上千个线粒体,每一个线粒体内含有2～10个mtDNA的拷贝；(3)高突变率，mtDNA的突变频率比核基因组10～20倍；(4)高异质性，突变的mtDNA与野生型的mtDNA可以同时存在于一个细胞质内，发挥着不同的生物功能。

据文献报道，mtDNA突变会导致人类多因素疾病、部分遗传性疾病和人类衰老等的发生。1988年首次报道已经确认了100种以上的致病点突变和200种缺失、插入和重排，其中约60％的点突变影响线粒体tRNA，35％影响呼吸链多肽亚单位，5％累及线粒体rRNA。mtDNA突变通过影响线粒体氧化磷酸化功能，减少ATP合成，进而使线粒体无法提供足够的能量，引起细胞出现退变甚至坏死，导致相关组织、器官功能受损，出现相应的临床症状。常见的线粒体病主要包括线粒体病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征(MELAS)、Leber遗传性视神经病变(LHON)、肌阵挛性癫痫症和破碎红纤维病(MERRF)、神经肌无力-共济失调-色素性视网膜炎(NARP)、母系遗传Leigh氏综合征(MILS)、母系遗传糖尿病伴耳聋(MIDD)、Pearson氏综合征、Kearns-Sayre综合征(KSS)、慢性进行性外眼肌麻痹(CPEO)等。

目前临床上对mtDNA的检测，仅集中在对少数常见线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，如对线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征(MELAS)常见突变A3243G的筛查，阳性检出率低，大多数患者难以获得准确的病因诊断。目前常用的检测方法主要包括Sanger测序和高通量测序技术(NGS)。其中Sanger测序法能够对线粒体DNA全基因组进行测序，进而检测和分析线粒体基因突变位点。但是，Sanger测序也具有一定的缺陷，如测序成本高、背景高、检测灵敏度低、无法同时进行大量样本处理、不能大规模应用到临床诊断上等。

中国发明专利CN103614482A公布了基于高通量基因测序无创检测线粒体DNA的方法，是以提取口腔细胞总基因组DNA作为样本；中国发明专利CN105087767A公布了线粒体基因组检测方法及引物，提供了一种用于法医鉴定检材的引物组，用来检测基因组量少的样本的线粒体DNA的全长序列，用于法医学中微量检材的检测；中国发明专利CN106755456A公布了用于线粒体全基因组检测的引物组合及试剂盒，利用6对特异性引物进行PCR扩增整个线粒体基因组，然后用Sanger测序技术检测线粒体全基因组以辅助诊断由于mtDNA突变导致的线粒体病。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法，其能够快速、全面、同时检测人体整个线粒体DNA基因存在的突变、缺失等信息，具有省时省力，特异性强的特点，能够及时发现线粒体疾病的存在，为临床诊断提供依据，丰富线粒体疾病的数据库。

为了达到本发明的目的，采用如下技术方案：

一种高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法，该检测方法具体包括如下步骤：

(1)目的片段获得：按照人全基因组DNA提取试剂盒(Life technologies)说明书提取DNA，利用设计的MtDNA特异性引物，以提取的线粒体DNA为模板，进行PCR扩增反应得到线粒体DNA扩增产物，将线粒体DNA扩增产物纯化后进行打断反应，得到特定大小的目的片段；

其中所述的PCR扩增的反应体系包括：PCR为20μl总体系，具体是2X Phanta MaxBuffer 10μl，dNTP mix 1μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，mtDNA1F(10uM)另一个反应用mtDNA2F(10uM)2μl，mtDNA1R(10uM)另一个反应用mtDNA2R(10uM)2μl，ddH₂O>

(2)DNA文库建立：对目的片段末端进行磷酸化修复，并在加3’端加A碱基即得测序产物；给测序产物加上测序接头后进行琼脂糖凝胶电泳分离纯化，回收目标DNA片段形成DNA文库；

优选地，所述步骤(2)中测序产物的制备方法为：取新的nuclease free离心管，按以下体系加入试剂，End Prep Enzyme Mix，3μL；End Repair Reaction Buffer(10X)，6.5μL；PCR产物，55.5μL；移液器吹打混匀，然后按照以下PCR循环条件进行反应：20℃，30s；65℃，30s；4℃，Forever。

(3)目标DNA片段测序：将DNA文库中目标DNA片段进行PCR扩增，使用Agilent 2100生物分析仪进行DNA片段大小和浓度的检测，浓度和片段大小符合要求后进行测序。

优选地，所述的MtDNA特异性引物包含两对引物，其中mtDNA 1F序列为TCCCCACATCAAGCCCGAATGATATTTC；mtDNA 1R序列为ATTCCGGATAGGCCGAGAAAGTGTTGT；mtDNA 2F序列为ATTTCACTATCATATTCATCGGCGTAAAT；MTDNA 2R序列为GGGACGGATCGGAGAATTGTGTAGGCGAAT。

优选地，所述插入片段的大小为300‐500bp。所述步骤2)中测序产物加测序接头的操作中将测序产物25ul、DNA Adapter2.5ul、PEG6000 5ul和T4DNA Ligase 2.5ul混合。

本发明提供的是基于NGS技术的线粒体基因检测,涉及分子生物和生物信息学,本方法采用的是人全基因组DNA为样本，设计了两对特异性引物，进行PCR扩增、建库和测序，得到人样本的线粒体全基因组序列，获得准确的人线粒体序列信息。该方法实验设计严谨、流程清晰，采用先进的NGS技术进行检测，检测结果准确可靠，自动化程度高，能够快速得到人线粒体全基因组序列信息，满足临床相关疾病检测的需求，能够全面发现线粒体相关疾病，有助于线粒体疾病的早期预防、诊断和治疗，同时也丰富了临床数据库。

附图说明

图1为本发明线粒体基因PCR产物电泳图。

图2为本发明线粒体基因PCR产物的文库质检图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施实例，对本发明的技术方案作进一步的详细说明。但本发明不限于以下实施实例。

实施例 一种高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法

本发明高通量快速检测线粒体基因突变或缺失的方法，实验操作具体步骤如下：

1.提取人全基因组DNA样本，严格按照人全基因组DNA提取试剂盒(Life technologies)说明书提取DNA。具体内容如下：

主要仪器：

主要试剂：

具体操作步骤：

1)取适量组织在液氮环境中充分研磨后再转移至1.5mL离心管，加入1mLTrizol，立即充分混匀；

2)将混匀的组织在室温放置10min，使充分裂解；

3)加入200μL氯仿，充分震荡混匀，4℃离心，12000rpm10min；

4)取上层水相，加入等体积的酚:氯仿(25:24),充分混匀，4℃离心，12000rpm10min；

5)取上层水相，加入等体积氯仿，充分混匀，4℃离心，12000rpm10min；

6)取上层水相，加入等体积异丙醇，‐20℃静置1小时，4℃离心，12000rpm10min；

7)弃上清，加入1mL75％乙醇，洗涤沉淀，4℃离心，8000rpm5min，弃上清；

8)重复上一步

9)短暂离心，移液器吸干乙醇，真空干燥2‐4min；

10)加20‐50μL RNase‐Free Water，室温溶解10min，混匀后瞬时离心；

11)‐80℃保存。

2.设计2对mtDNA特异性引物。

第一对mtDNA特异性引物序列为：mtDNA 1F：TCCCCACATCAAGCCCGAATGATATTTC；mtDNA 1R：ATTCCGGATAGGCCGAGAAAGTGTTGT。

第二对mtDNA特异性引物序列为：mtDNA 2F：ATTTCACTATCATATTCATCGGCGTAAAT；mtDNA 2R：GGGACGGATCGGAGAATTGTGTAGGCGAAT。

3.利用设计好的引物扩增mtDNA，得到扩增后PCR产物。

上述PCR扩增的反应体系如表1所示：

表1 PCR扩增的反应体系

试剂用量2X Phanta Max Buffer10μldNTP mix1μlPhanta Max Super‐Fidelity DNA Polymerase1μlmtDNA1F(10uM)另一个反应用mtDNA2F(10uM)2μlmtDNA1R(10uM)另一个反应用mtDNA2R(10uM)2μlddH2O3μlDNA模板(10‐100ng)1μl总体系20μl

上述PCR扩增的反应程序如表2所示：

表2 PCR扩增的反应程序

4.PCR扩增结束后，得到PCR产物1和PCR产物2，分别取2μl PCR产物1和PCR产物2进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，DNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。

5.对上述线粒体DNA进行纯化，DNA纯化方法可以按照本领域所公知的纯化方法进行。

6.取PCR产物1和PCR产物2等量的纯化后的PCR产物混合，将混合样本打断至片段大小为300‐500bp，回收所需大小的目的片段。

7.对打断后的样本进行末端修复磷酸化，然后进行3’端加A碱基。具体操作如下：

1)取新的nuclease free离心管，按以下体系加入试剂，移液器吹打混匀。

2)按以下PCR循环条件进行反应：

20℃30s

65℃30s

4℃ Forever

8.接着给上述产物加测序接头。本发明用的是illumina公司的接头，具体配比如下：

上述产物25ulDNA Adapter2.5ulPEG60005ulT4DNA Ligase2.5ul

9.然后对连接反应完成后的样本进行琼脂糖凝胶电泳分离纯化，回收300‐500bp的样本片段。

10.PCR扩增上一步所得样本，使文库量满足上机要求。

11.使用Agilent 2100生物分析仪进行文库质检，QPCR定量，DNA片段大小和浓度各指标检测合格后才能上机检测。文库质检图如图2所示。

12.以上得到的DNA通过Illumina HiSeq2000测序，得到测序数据，进行数据分析。结果如下：

(1)所得的基因与人的核基因组的比对率为94.36％，未比对上的reads与人类线粒体基因组的比对率为91.19％；

(2)100x组装结果与人线粒体比对情况：将24条scaffold(基因组de novo测序，通过reads拼接获得Contigs后，往往还需要构建454Paired-end库或Illumina Mate-pair库，以获得一定大小片段(如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb)两端的序列。基于这些序列，可以确定一些Contig之间的顺序关系，这些先后顺序已知的Contigs组成Scaffold。)与人线粒体进行比对，只有1条scaffold未比对上(C27,381bp)；

(3)全部reads组装结果，共得到了37643条scaffold，具体情况如表3所示：

表3 reads组装结果

(4)将去除人核基因组后的reads与人线粒体进行比对，计算线粒体的覆盖度以及每个位点的深度，表4表示深度大于等于某个值的碱基位点以及对应线粒体的覆盖度。

表4 深度大于等于某个值的碱基位点以及对应线粒体的覆盖度

Depth>＝Bases CountCoverage1016569100％501656899.99％1001655999.94％2001654399.84％5001522091.86％