肿瘤坏死因子α诱导蛋白3在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用

摘要

本发明公开了肿瘤坏死因子α诱导蛋白3在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用。本发明通过高脂饮食(HFD)诱导建立小鼠糖尿病心肌病模型、通过构建过表达A20的重组腺病毒载体(AdA20)，感染原代大鼠心肌细胞，并以高水平脂肪酸刺激，建立糖尿病心肌病的体外细胞模型，同时以WT小鼠和心脏特异性A20基因敲除小鼠(A20‑CKO)为实验对象，利用HFD诱导建立小鼠糖尿病心肌病模型，发现HFD 24W的小鼠心脏组织中A20的蛋白表达水平显著下调；在高脂饮食所诱导的小鼠糖尿病心肌病模型中，A20具有抑制心肌肥厚，改善心功能，阻碍糖尿病心肌病进展的作用。由于A20是机体内源性蛋白质，因此作为药物的安全性很高。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3，又称A20)在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用。

背景技术

随着社会的发展，目前心血管疾病已经成为发展中国家及发达国家共同面对的巨大问题[1]。需要格外关注的是，糖尿病患病人数急剧增加是目前心血管疾病发病率居高不下的重要原因之一[2]。糖尿病心肌病被认为是一种由糖尿病引起的心肌结构和功能的改变，同时排除缺血性疾病、高血压及其他可能引起心肌病变的疾病[2-3]。糖尿病心肌病病理特征为：心肌细胞肥大、间质纤维化和 PAS染色阳性物质浸润，冠状小动脉基底膜增厚，心肌内可见微血管病变。糖尿病心肌病的心脏结构改变特征为：接近正常的左心室舒张末期容积；左心室重量及室壁厚度增加；心肌肥厚及纤维化；心肌细胞脂肪沉积[2-4]。糖尿病心肌病功能改变特征为：舒张功能受损而收缩功能受损不明显，心室壁弹性减弱。近年来，全世界众多学者对糖尿病心肌病的发生发展机制开展了大量研究，发现多种因素、多个环节，如高血糖、高血脂、高胰岛素血症对心肌的毒性作用，心肌细胞能量代谢的改变，钙稳态的破坏，线粒体功能异常以及多种信号通路的改变共同参与了糖尿病心肌病的进展[2-5]。然而，糖尿病心肌病的发生发展机制至今仍未完全明确，现有的研究及发现在临床实践中仍具有一定的局限性，尚不能形成真正有效的针对糖尿病心肌病的防治措施。因此，进一步系统阐明糖尿病心肌病的发病机制，从细胞分子水平对糖尿病心肌病进行调控，探索新的防治糖尿病心肌病的治疗靶点，具有非常重要的理论和实践意义。

A20蛋白，又称肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)，是一种泛素修饰酶，最早被认为是TNF，IL-1及LPS刺激人脐静脉后产生的原发反应蛋白[6-7]。随之发现其在多种受刺激的细胞，如淋巴细胞，肺支气管上皮细胞，心肌细胞等中都有表达[6]。A20的主要功能表现在抑制TNF诱导的NFκB活性，炎症以及凋亡反应[7-10]。既往的研究表明，A20与多种疾病发生发展有关，包括Crohn’s 疾病，风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，心肌梗死，心肌肥厚等[7-10]。但目前为止，尚未见A20在糖尿病心肌病中作用的相关报道。

参考文献

[1].Shah AM,Mann DL.In search of new therapeutic targets andstrategies for heart failure:recent advances in basic science.Lancet.2011；378:704-712

[2].Bugger H,Abel ED.Molecular mechanisms of diabetic cardiomyopathy.Diabetologia.2014；57:660-671

[3].Liu F,Song R,Feng Y,Guo J,Chen Y,Zhang Y,Chen T,Wang Y,Huang Y,LiCY,Cao C,Zhang Y,Hu X,Xiao RP.Upregulation of mg53induces diabeticcardiomyopathy through transcriptional activation of peroxisomeproliferation- activated receptor alpha.Circulation.2015；131:795-804

[4].Kuwabara Y,Horie T,Baba O,Watanabe S,Nishiga M,Usami S,Izuhara M,Nakao T,Nishino T,Otsu K,Kita T,Kimura T,Ono K.Microrna-451exacerbateslipotoxicity in cardiac myocytes and high-fat diet-induced cardiachypertrophy in mice through suppression of the lkb1/ampk pathway.Circulationresearch. 2015；116:279-288

[5].Devereux RB,Roman MJ,Paranicas M,O'Grady MJ,Lee ET,Welty TK,Fabsitz RR,Robbins D,Rhoades ER,Howard BV.Impact of diabetes on cardiacstructure and function:The strong heart study.Circulation.2000；101:2271-2276

[6].Ma A,Malynn BA.A20:Linking a complex regulator of ubiquitylationto immunity and human disease.Nature reviews.Immunology.2012；12:774-785

[7].Hitotsumatsu O,Ahmad RC,Tavares R,Wang M,Philpott D,Turer EE,LeeBL, Shiffin N,Advincula R,Malynn BA,Werts C,Ma A.The ubiquitin-editing enzymea20restricts nucleotide-binding oligomerization domain containing 2-triggeredsignals.Immunity.2008；28:381-390

[8].Li HL,Zhuo ML,Wang D,Wang AB,Cai H,Sun LH,Yang Q,Huang Y,Wei YS,Liu PP,Liu DP,Liang CC.Targeted cardiac overexpression of a20improves leftventricular performance and reduces compensatory hypertrophy after myocardialinfarction.Circulation.2007；115:1885-1894

[9].Huang H,Tang QZ,Wang AB,Chen M,Yan L,Liu C,Jiang H,Yang Q,BianZY, Bai X,Zhu LH,Wang L,Li H.Tumor suppressor a20protects against cardiachypertrophy and fibrosis by blocking transforming growth factor-beta-activated kinase 1-dependent signaling.Hypertension.2010；56:232-239

[10].Kang NI,Yoon HY,Lee YR,Won M,Chung MJ,Park JW,Hur GM,Lee HK,Park BH.A20attenuates allergic airway inflammation in mice.Journal ofimmunology.2009；183:1488-1495

发明内容

为解决临床防治糖尿病心肌病现有技术的缺陷和不足，本发明的目的是确定 A20基因的表达与糖尿病心肌病之间的相互关系。提供一种A20在制备保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/治疗糖尿病心肌病的药物中的新应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明第一方面提供了肿瘤坏死因子α诱导蛋白3在制备预防、缓解和/治疗糖尿病心肌病的药物中的应用。

优选地，提供了肿瘤坏死因子α诱导蛋白3在制备抑制糖尿病心肌病所引起的心肌肥厚，改善心功能的药物中的应用。

本发明涉及的肿瘤坏死因子α诱导蛋白3在制备预防、缓解和/治疗糖尿病心肌病的药物中的应用，具体的是肿瘤坏死因子α诱导蛋白3可用于制备预防、缓解和/治疗糖尿病心肌病的药物。

本发明涉及的肿瘤坏死因子α诱导蛋白3在制备预防、缓解和/治疗糖尿病心肌病的药物中的应用，具体的是肿瘤坏死因子α诱导蛋白3作为药物靶点筛选预防、缓解和/治疗糖尿病心肌病的药物，所述药物是提高肿瘤坏死因子α诱导蛋白3表达量的试剂。

优选地，提高肿瘤坏死因子α诱导蛋白3表达量的试剂，给药方式为直接裸 DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法，或蛋白微球制剂皮下注射法。

所述的A20，包括基因、蛋白。所述的A20基因在对象体内经转录翻译为肿瘤坏死因子α诱导蛋白3蛋白产物。

本发明通过试验确定了A20的表达与糖尿病心肌病之间的关系：

1、A20蛋白水平在高脂诱导的糖尿病心肌病模型中显著下降

本发明以野生型C57BL/6小鼠(WT)为实验对象，通过高脂饮食(HFD) 诱导建立小鼠糖尿病心肌病模型，并通过蛋白质印迹(WB)的手段检测小鼠心脏组织中A20的表达变化。结果发现，与正常饮食(NC)的小鼠相比，HFD 24W 的小鼠心脏组织中A20的蛋白表达水平显著下调，表明A20很可能参与了糖尿病心肌病的发生发展。

2、A20基因过表达显著减轻高水平脂肪酸刺激对心肌细胞的毒性

本发明通过构建过表达A20的重组腺病毒载体(AdA20)，感染原代大鼠心肌细胞，并以高水平脂肪酸刺激，建立糖尿病心肌病的体外细胞模型，从而探讨 A20对糖尿病心肌病的作用。实验结果表明，与对照组(AdVector)相比，过表达A20显著提高了高水平脂肪酸刺激下心肌细胞的存活率，减轻了高脂诱导的心肌细胞损伤。表明A20能够显著减轻高水平脂肪酸刺激对心肌细胞的毒性。

3、心脏特异性A20基因敲除促进了高脂饮食诱导小鼠心肌肥厚和心功能恶化。

本发明以WT小鼠和心脏特异性A20基因敲除小鼠(A20-CKO)为实验对象，通过HFD诱导建立小鼠糖尿病心肌病模型，研究A20基因在糖尿病心肌病中的功能。结果发现，与对照组WT小鼠相比，A20-CKO小鼠显著加重了HFD 所导致的心肌肥厚和心功能恶化。表明A20能够抑制糖尿病心肌病的发生发展。

本发明人的研究证明了：在高脂饮食所诱导的小鼠糖尿病心肌病模型中， A20具有抑制心肌肥厚，改善心功能，阻碍糖尿病心肌病进展的作用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现A20基因的新功能，即A20基因具有抑制糖尿病心肌病所引起的心肌肥厚，改善心功能的作用。

(2)基于A20抑制糖尿病心肌病发生的作用，其可以用于制备预防、缓解和/或治疗糖尿病心肌病的药物，由于A20是机体内源性蛋白质，因此作为药物的安全性很高。

附图说明

附图1是构建心脏特异性A20基因敲除小鼠的打靶策略图。

附图2是WT小鼠HFD模型24W后心脏组织中A20的蛋白表达水平变化结果图(*：p＜0.05)。

附图3是SD乳鼠原代心肌细胞感染AdVector和AdA20腺病毒后，心肌细胞活力百分比和心肌细胞损伤百分比柱状统计图(*：p＜0.05)。

附图4是WT和A20-CKO小鼠HFD模型24周后心脏大体图、心脏重量和胫骨长度比值(HW/TL)柱状统计图(*：p＜0.05)。

附图5是WT和A20-CKO小鼠HFD模型24周后心脏组织切片的HE染色代表性图片和心肌细胞面积柱状统计图(*：p＜0.05)。

附图6是WT和A20-CKO小鼠HFD模型24周后心脏组织中Anp，Bnp， Myh7等心肌肥厚标志物的mRNA表达水平柱状统计图(*：p＜0.05)。

附图7是WT和A20-CKO小鼠HFD模型24周后心脏超声指标左心室舒张末期内径(LVEDd)和短轴缩短率(LVFS)的柱状统计图(*：p＜0.05)。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实验用动物及饲养

实验动物：选用8-10周龄、体重在23.5-27.5g，背景为雄性C57BL/6的野生型小鼠(WT)和A20心脏特异性敲除基因小鼠(A20-CKO)为实验对象。

动物饲料配方：高脂饲料(HFD)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12942)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，总的热量质量比:5.24kcal/g。低脂饲料(NC)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12450B)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，总的热量质量比:3.85kcal/g。

动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所 SPF级动物房(许可证号：SYXK(鄂)：2009-0053)。每12小时交替照明，温度24±2℃，湿度40％-70％，小鼠自由饮水进食。

心脏特异性A20敲除基因小鼠的构建：

利用CRISPR-Cas9技术构建心脏特异性A20基因敲除小鼠。其原理图见图 1。首先，通过在线CRISPR设计工具(http://crispr.mit.edu)分别在小鼠A20基因内含子2和3中各设计一个CRISPR的打靶位点，靶序列分别为：

A20sgRNA1：TCAGACCAGCCCTATCAAGT AGG，

A20sgRNA2：GCTTGTGGCTGAAGATTACG AGG。

此外还设计了一个用于同源修复的供体载体(Donor Vector)，它包括两侧同源臂、中间的外显子3以及两个同向的loxp序列。

(1)打靶载体的构建：分别将sgRNA1和sgRNA2对应的两条引物融合成双链DNA，然后用T4DNA连接酶连入经过限制性内切酶BsaI处理过的 pUC57-sgRNA载体中。该载体上游有一个T7启动子，可以用于后续的体外转录实验。

(2)条件性敲除骨架载体pBluescript SK(+)-2loxp的构建：

分别合成4条寡聚单链核苷酸序列：

loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，

loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；

loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，

loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；

上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2两条双链。将pBluescript II SK(+)载体用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)双酶切后连接入loxp1 退火双链，再将测序正确的载体用BamHI(NEB，R0136L)和SpeI(NEB，R0133L) 双酶切，连接入loxp2退火双链，得到条件性敲除骨架载体，命名为pBluescript SK(+)-2loxp。

(3)供体载体的构建：根据引物设计原则，设计如下引物(表1)用于扩增供体载体的左右同源臂(LA和RA)以及中间的外显子部分(M)。扩增得到的产物经表1中所示限制性内切酶酶切后得到3个片段，将其分别连入条件性敲除骨架载体pBluescript SK(+)-2loxp中，得到Donor Vector。

表1构建供体载体所需引物序列及对应酶切位点

(4)打靶载体的转录：对CRIPR/Cas9系统包含的两个部分(负责切割作用的Cas9蛋白和引导Cas9蛋白定位到靶位点的gRNA)分别进行转录。对于 Cas9蛋白，将其表达载体pST1374-Cas9(Addgene 44758)用PmeI进行酶切，以纯化后回收线性化质粒为转录模板，用T7mMESSAGE mMACHINE试剂盒 (AM1345，Ambion)进行体外转录，获得加帽的mRNA产物。并用Poly(A)Tailing 试剂盒(Ambion)对上述产物加尾，获得成熟的mRNA产物；对于sgRNA，使用MEGAshortscript^TM>

(5)A20-flox条件性敲除小鼠的制作

将上述成熟的mRNA产物与供体载体一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠体内进行培育。得到的小鼠进行鉴定。取出生一周后的小鼠脚趾或尾部组织，提取基因组，并通过PCR方法筛选阳性首建鼠。从确定发生同源重组的小鼠中随机挑选一只作为F0代进行后续的繁殖，最终获得A20-flox纯合小鼠。

(6)心脏特异性A20基因敲除小鼠的制作

将上述A20-flox小鼠与心脏特异性α-MHC-Cre(购自Jackson Laboratory，货号005650)转基因小鼠交配，筛选得到A20^flox/flox/α-MHC-Cre小鼠，待该小鼠长至6周龄左右后，腹腔注射Tamoxifen，诱导Cre酶的表达，Cre酶特异性的识别两个同向的loxp，并切除两者之间的序列及其中的一个loxp，最后得到心脏细胞特异性A20基因敲除小鼠。

【实施例1】检测A20蛋白水平在高脂喂养的情况下的变化

1.高脂喂养诱导的糖尿病心肌病模型的建立

(1)实验动物分组：

选用8周龄，雄性，C57小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(High fatdiet，HFD)和D12450B普通饲料(Normal chow，NC)饲养。

(2)小鼠心脏取材：

饲养24周后，分别取出HFD和NC饮食的小鼠心脏，称重，液氮速冻保存于-80℃冰箱，用于分子生物学实验。

2.免疫印迹法检测(WB)两组小鼠心脏中的A20蛋白水平

2.1提取蛋白样本：

(1)将提取蛋白的器材包括眼科剪、眼科直镊、钢珠等高压灭菌。

(2)快速取出所需提取蛋白样本，置于干冰上。将EP管做好标记，并向每个EP管中放入4颗钢珠，置于干冰上预冷。用眼科剪迅速将样本剪碎后放入对应的EP管中，称重并记录样本的重量。

(3)依据样本重量加入相应量的RIPA裂解液(10mg/100μl)，为避免温度过低使裂解液凝固冻住钢珠，加入裂解液后迅速摇匀。液氮预冷研磨盒5-8min 后将样品对称放置于研磨盒中，放入研磨仪。设置研磨参数：频率30Hz/s，时间90s。

(4)待研磨结束，取出钢珠放入无水乙醇漂洗，样本置于冰上静置10min，充分裂解。使用超声裂解仪裂解样本5KHz/次重复10-15次，每次1s，间隔1s。为避免产生大量气泡，裂解时应将探头深入液面下2/3。超声裂解结束后冰上放置10min。样本放入4℃预冷离心机中离心，12000rpm离心30min。小心吸取上清液并定量，记录样本的裂解体积。

2.2BCA法测量蛋白浓度

2.3蛋白质缓冲处理及保存：

(1)依据所测蛋白浓度加入相应量的4×LB和10×DTT裂解液，将总蛋白校准到相同浓度，LB为终体积的1/4，DTT为终体积的1/10。将蛋白样品混匀后于12000rpm瞬离，分装样本。

(2)将样本100℃水浴10min变性，待样品冷却后置于-80℃冰箱保存。

2.4蛋白质凝胶电泳：将预制SDS-PAGE凝胶板架在电泳槽中，加入适量电泳外液和电泳内液。每个蛋白样品取50μg，依次上样到SDS-PAGE胶泳道，上样完毕后恒压120V电泳。当溴酚蓝染料到达分离胶底部时判定电泳完毕并关闭电源。

2.5转膜：

(1)将PVDF膜按8×5.9cm大小裁剪，并在一角剪个缺口做好方向标记，使用前在甲醇中浸泡15s后置于转膜液中备用。

(2)将夹板左右摆开，负极向右，白色为正极，黑色的一边为负极。两块夹板各铺上预先用转膜缓冲液浸湿的4-5张滤纸和1-2张海绵。

(3)取出凝胶板中的凝胶，用转膜液润湿凝胶，将凝胶平铺在滤纸上，赶尽气泡，将PVDF膜覆盖其上，标记的地方应与大分子量Marker的一角对齐，赶尽气泡后覆盖上左边的滤纸及海绵，盖上夹板。将夹板放入转膜槽中，转膜槽的负极应与夹板的负极放在一起，灌满转膜液淹没凝胶。

(4)转膜槽接通电源，25V转印2h，用考马斯亮蓝染液染胶，判断蛋白质转移是否完全。转印结束后，取出PVDF膜。

2.6抗体孵育及曝光：

(1)将转印含有蛋白的PVDF膜置于预先准备好的TBST中，洗脱膜上的转膜液。

(2)将膜置于5％的脱脂奶粉封闭液封闭，室温封闭1.5h，在摇床上缓慢摇动进行。待封闭结束，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次洗5min。

(3)将PVDF膜放入杂交袋中，加上适量一抗(A20(#5630，CST)，GAPDH (#2118，CST))，赶出气泡后使用封口机封口。将杂交袋置于4℃摇床上缓慢摇动，过夜。

(4)将过夜的PVDF膜取出，使用TBST洗涤3次，每次约5min，同时回收一抗。

(5)向8ml二抗稀释液中应加入0.6μl的二抗(Peroxidase AffiniPure goatanti-rabbit-IgG(H+L)(#111-035-003)，Jackson ImmunoResearch)，混匀，将PVDF 膜放入加有相应二抗溶液中，避光孵育1h。

(6)二抗孵育完毕后用TBST洗涤3次，每次5min。将膜按顺序置于Bio-RadChemiDoc^TM>

图2是WT小鼠在NC和HFD两种饮食饲养24W后，心脏组织中A20的表达水平检测结果。实验结果表明在HFD诱导的糖尿病心肌病模型中，A20的蛋白水平显著下调。表明A20很可能参与糖尿病心肌病的发生发展机制。

【实施例2】腺病毒介导的A20过表达(AdA20)对高水平脂肪酸刺激原代心肌细胞的毒性的影响

2.1.原代新生SD大鼠心肌细胞培养

(1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，颈部以下75％酒精消毒，用眼科剪和显微镊取下心脏，放入盛有10mL DMEM/F12液的玻璃平皿中。再取另一只，重复以上过程。

(2)用DMEM/F12培养基清洗心脏，并将心脏剪成1-2mm的碎片。转入到放有转子的血清瓶中，吸去DMEM/F12，加入胰酶消化液。转速为120r/min，消化15min，静止数秒钟，弃去上清液。

(3)加入胰酶消化液，转速为120r/min，消化15min。静止数秒钟，吸取上清液，用20％小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，并置于4℃冰箱保存。重复该步骤，循环若干次。取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。

(4)将收集好的心肌细胞悬液，以1500rpm转速离心8min，弃去上清液。在离心管中加入适量培养基，轻柔吹打重悬细胞，集中至1个50mL离心管中，细胞悬液用细胞40μm过滤网过滤。

(5)将细胞接种在100mm的培养皿中，差时贴壁90min，吸取未贴壁的细胞悬液过滤。根据细胞悬液的总量加入Brdu(终浓度0.1mM)，混匀之后，加入到用0.1％明胶包被的器皿中。

(6)轻摇分散细胞，勿漩涡摇晃。37℃、5％CO2孵育48小时用PBS清洗 1次，更换培养基。

2.A20过表达腺病毒的转染

(1)重组腺病毒构建：

构建A20(CCDS23715.1)的表达载体，应用腺病毒表达系统AdenoVec构建重组AdA20；表达空载体的腺病毒(AdVector)用于对照。

(2)重组腺病毒的鉴定：

取病毒粗提液加入裂解液，经混匀、离心后取上清液作为模板进行PCR扩增，产物通过凝胶电泳鉴定。

(3)重组腺病毒的扩增：

转染前接种HEK293细胞，待细胞达到50-70％汇合时换液，加入含有重组腺病毒载体的新鲜培养液，培养90分钟后再填加新鲜培养液，培养至大约有50％的细胞从培养板上脱落时，收集细胞悬液。反复冻融以制备病毒粗提液，通过CsCl密度梯度超速离心法纯化病毒液。

(4)重组腺病毒滴度测定：

在96孔板中接种HEK293细胞，24小时后加入倍比稀释的病毒液，1-10列加入稀释的病毒液，每个浓度8个重复孔，11-12列加入无病毒完全培养液，培养10天后在显微镜下观察细胞病变效应(CPE)，计算每个浓度的阳性率。病毒滴度采用Spearman-Karber Method计算：滴度(pfu/ml)＝10(x+0.8)，x＝各浓度阳性率总和。前提条件：阴性对照无CPE和生长抑制现象；最小稀释浓度组均有CPE；最大稀释浓度组均无CPE。

(5)重组腺病毒作用的鉴定：

用2×10⁸pfu/virus浓度的AdA20和AdVector感染6孔培养板中培养心肌细胞(约80％汇合度)，24小时后收集细胞，加入蛋白裂解液裂解50分钟后收集上清，取50μg样品经10％SDS-PAGE电泳分离后，用A20特异性抗体做Western>

腺病毒10MOIs分别感染培养3天的原代心肌细胞，12h后用500μM棕榈酸(Palmitate)刺激48h，然后使用非放射性CCK-8试剂盒(CK04；Dojindo, Kumamoto,Japan)检测细胞活性，使用LDH细胞毒性比色测试试剂盒(G1782, Promega,Madison,WI,USA)检测LDH的释放量。

检测结果如图3所示，在高水平脂肪酸的条件下，AdA20腺病毒感染的原代心肌细胞生存率显著上升，心肌细胞损伤明显下调。说明A20过表达腺病毒抑制高水平脂肪酸刺激引起的心肌细胞毒性。

【实施例3】A20基因敲除促进小鼠糖尿病心肌病的发生发展

1.动物分组：

选用8周龄，雄性，WT小鼠和A20-CKO小鼠，分别给与两种特殊饲料 D12942高脂饲料(High fat diet，HFD)和D12450B正常饲料(Normal chow， NC)饲养，即WT NC组，CKO NC组，WT HFD组，CKO HFD组共4个组别, 第24周终末取材，取出小鼠心脏拍照，然后分别置于甲醛溶液中固定或-80℃冻存，作为病理分析分子生物学检测用。

2.取材：

(1)前期工作：

预先准备装有20mL的体积分数10％甲醛的尿杯，并贴好标签(小鼠编号、组别、手术类型及取材日期)。将倒满质量分数10％KCl溶液的培养皿置于取材处。打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。

(2)取材：

眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10％KCl 溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测或至于液氮速冻，然后储存于-80℃备用，用于分子生物学检测。

(3)相关测量及计算：

剪开小鼠后肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与胫骨长度的比值(HW/TL)，评价心脏重量的增大程度。

3.病理学检测：

(1)制备石蜡标本切片

主要操作程序包括修剪心脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。

(2)苏木精-伊红(HE)染色

主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021) 5min→水洗1min→1％盐酸酒精(取3mL浓盐酸与297mL 70％酒精充分混合均匀)1-3s→水洗1min→Scott液(碳酸氢钠0.35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL 蒸馏水)1min→水洗1min→伊红溶液(珠海贝索，BA-4024)3-5min→蒸馏水洗去浮色→70％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。

(3)HE染色图片统计：每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用Image-Pro Plus 6.0软件圈细胞面积。

3.分子生物学检测

实时定量PCR检测心肌肥厚相关指标：

3.1提取RNA

(1)预冷离心机，自-80℃冰箱将待提取RNA的样本取出，液氮充分预冷冻存管后，使用显微剪将冻存管中组织样本剪碎并转移至1.5ml EP管。向每管心脏组织样品中加入1ml Trizol，静置10min。

(2)按照200μl/1ml Trizol的量向每个EP管加入三氯甲烷，上下颠倒混 15-30s后室温静置5min。4℃离心15min(12000g)。

(3)RNA沉淀：将上层水相小心转移至新的EP管中(一般300-400μl)，加入等量体积的异丙醇，混匀后，室温静置10min，12000g的转速4℃离心 10min。配制75％乙醇(用25％DEPC处理过的去离子水配制)。

(4)离心后管底及管壁可见白色絮状沉淀(RNA)，去掉上清，加入1ml 的75％乙醇，使用振荡器使RNA沉淀重悬，并颠倒EP管，充分漂洗RNA沉淀。并用7500g的转速4℃离心5min。

(5)RNA沉淀的溶解：去除上清，室温干燥10min直至白色沉淀变为无色即可。提前解冻RT-buffer、dT primer、一支PCR等级水、dNTP。用适量体积(20μl)的DEPC水溶解RNA沉淀，将EP管放至55℃水浴，持续10min促进RNA溶解。

3.2测定RNA浓度：使用NanoDrop 2000测定每个样品的RNA浓度。

3.3反转录(PCR)：

(1)逆转录反应体系(总体积13μl)，1μl的dT primer、2μl的Random primer、根据测定的RNA浓度通过加不同量的PCR等级的水将总RNA浓度校正至2μg。

(2)混匀后将上述反应体系置于PCR仪中(70℃，10min)，反应结束后将PCR反应管取出后冰浴5min。

(3)将以上PCR反应管置于冰盒上并加以下试剂，最终体积为20ul。4μl 的5×RT-buffer、2μl的dNTP、0.5μl的inhibitor、0.5μl的RTase。

(4)按以下程序进行反转录：a 25℃，10min；b 50℃，60min；c 90℃， 5min；d 4℃，1min，待程序结束，取出反应管，保存于-80℃冰箱。

3.4实时荧光定量PCR：

(1)PCR反应体系，总体积20μl：10μl的480SYBR Green I Maste(2X)、1μl的primer(10μm)、8μl的PCR等级的水、1μl的cDNA模板。

(2)按照上述体系配混合液(每个基因三复孔)：25.6μl的PCR等级的水，32μl的480SYBR Green I Maste(2X)，3.2μl的引物。

(3)向上述混合液中加入cDNA模板：每管3.2μl。

(4)混匀后在96孔板上点样，每管点三个复孔，将96孔板3,000rpm离心2min。

(5)将离心的96孔板置于检测仪上，按设定程序检测。

引物序列如表2所示：

基因正向引物反向引物AnpACCTGCTAGACCACCTGGAGACCTGCTAGACCACCTGGAGBnpGAGGTCACTCCTATCCTCTGGGAGGTCACTCCTATCCTCTGGMyh7CCGAGTCCCAGGTCAACAACCGAGTCCCAGGTCAACAA

WT和A20-CKO小鼠糖尿病心肌病模型后表型结果见图3、图4、图5。NC 组中WT小鼠和A20-CKO小鼠的HW/TL之间的差异无统计学意义；WT小鼠HFD 24W后的HW/TL显著高于其NC组；HFD 24周，A20-CKO小鼠的HW/TL 显著高于WT小鼠(图4)。HE染色可观察到：NC组心脏大小和心肌细胞面积均无统计学上差异，HFD组较NC组的心脏和心肌细胞面积均增大，HFD组A20-CKO小鼠的心脏和心肌细胞横截面积均显著大于WT组小鼠(图5)。心肌肥厚标志物RT-PCR的结果显示，与高脂饲料的WT小鼠相比，A20基因敲除小鼠心脏组织中Anp，Bnp，Myh7的mRNA水平在高脂饲养的条件下明显上升 (图6)。心脏特异性的A20基因敲除显著加重高脂饮食所诱导的心肌肥大。

【实施例4】糖尿病心肌病模型小鼠超声检测心脏功能

1.前期准备

(1)麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋钮，出气压力维持在0.2-0.3mPa。

(2)待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5-2.0％异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。

2.心功能检测

小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂(天津成信公司)。采用高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVESd)及短轴缩短率 (FS)。

本实施例运用M型超声心动图检测评价心肌肥厚和心功能。图7是WT和 A20-CKO小鼠HFD模型24W后心脏超声指标左心室舒张末期内径(LVEDd) 和短轴缩短率(LVFS)的统计柱状图。结果表明，心脏特异性的A20基因敲除显著恶化高脂喂养诱导的小鼠心腔扩张和心功能。

由以上结果可知，在高水平脂肪酸刺激的心肌细胞模型中，A20基因过表达显著抑制了心肌细胞的死亡，减轻了心肌细胞的损伤。而在高脂饮食所诱导的糖尿病心肌病的模型中，A20基因缺陷显著促进了心肌肥厚和心功能恶化。因此 A20基因具有抑制糖尿病心肌病所引起的心肌肥厚，保护心功能的作用，特别是 A20基因能够抑制糖尿病心肌病的发生发展。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>武汉大学

<120>肿瘤坏死因子α诱导蛋白3在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用

<160>12

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

tcagaccagc cctatcaagt agg23

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

gcttgtggct gaagattacg agg23

<210>3

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

agcttgacgt cataacttcg tatagcatac attatagcaa tttataccgg tgat54

<210>4

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

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<210>5

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

gatcccttaa gataacttcg tatagcatac attatagcaa tttatacgcg ta52

<210>6

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

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<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>7

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<210>8

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>8

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<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>9

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<210>10

<211>30

<212>DNA

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<400>10

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<210>11

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>11

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<210>12

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>12

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