JNK在化学治疗药物与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导的癌细胞凋亡中的作用及耐药逆转

摘要

目前，恶性肿瘤的治疗主要采取手术治疗、化学药物治疗、放射治疗及生物治疗等综合性治疗措施。化学药物治疗在卵巢癌的临床治疗中占有重要地位，它能使癌灶缩小，并能消除术后散在的癌组织，防止肿瘤的复发和转移。但是，由于肿瘤细胞耐药性的产生，导致化学药物治疗的失败。因此，对耐药产生机制的研究及如何逆转耐药是当前肿瘤治疗研究工作的重点。顺铂和阿霉素是临床上治疗恶性肿瘤常用的化学治疗药物，耐药性的产生严重影响了其治疗效果。细胞功能的正常运行是凋亡与存活信号之间平衡的结果，存活信号增强是肿瘤细胞的特性之一，本研究主要通过卵巢癌顺铂耐药模型和乳腺癌阿霉素耐药模型，在体外探讨耐药产生的机理、及如何从基因水平促进肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤细胞耐药。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)是调控真核细胞反应的重要信号系统，通过磷酸化不同特异性底物而发挥特定的生物学功能，参与了细胞对外界刺激的多种反应，包括细胞的生长、分化、存活和死亡。转录因子是MAPK的重要作用目标，其主要作用是调节细胞的增殖、分化和凋亡。c-Jun氨基末端激酶(c-JunNH2-terminalkinase，JNK)属MAPK亚族成员之一，为跨核膜蛋白激酶，细胞外刺激可通过激活Ras、RhoGTP酶通路激活MAPKKKs，使MAPKK4和7磷酸化，JNK(Thr183/Tyrl85)激酶依次被激活。活化的JNK激活转录因子c-Jun(Ser63/Ser73)，c-Jun结合到AP-1元件启动转录。其主要作用是参与各种压力刺激，包括肿瘤坏死因子，紫外线等，引起的细胞凋亡和炎症反应。研究表明，泰素可通过激活JNK诱导肿瘤细胞凋亡，JNK信号系统是否参与顺铂、阿霉素等化学治疗药物诱导的细胞凋亡以及其激活与否是否与肿瘤细胞对化学治疗药物的耐受性有关，目前尚无人研究。 肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(tumornecrosisfactor-relatedapoptosisinducingligand，TRAIL)是肿瘤坏死因子(TNF)家族成员之一。研究发现，TRAIL可迅速诱导乳腺癌，直肠癌，肺癌，和前列腺癌等多种肿瘤细胞凋亡，而对大多数正常细胞无毒副作用。TRAIL是否可诱导对化学治疗药物耐药的肿瘤细胞凋亡、其与化学治疗药物联合应用是否可增强化学治疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，其机制如何，是否可使肿瘤细胞的耐药性得到逆转，TRAIL与JNK通路之间的联系如何，目前尚无研究。 本研究就以上问题进行探讨并研究TRAIL与JNK信号转导通路之间的联系及逆转耐药的可行性。 1.通过比较人卵巢癌细胞敏感株A2780及耐药株A2780/DDP顺铂作用后JNK活性的变化、细胞的凋亡情况，明确阻断JNK(c-JunNH2-terminalkinase)活化在顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡中的作用，及以野生型逆转录病毒介导的MSCV-IRES-JNK1-GFP(JNK-wt)基因转染后对细胞耐药的逆转。将含有JNK显性突变体的质粒pcDNA3(FLAG)-JNK-dn转染A2780细胞，全长野生型JNK1的逆转录病毒表达载体MSCV-IRES-JNK1-GFP和逆转录病毒空载体质粒MSCV-IRES-GFP分别导入BOSC-23细胞中，以病毒上清感染A2780/DDP细胞中。采用免疫印迹，免疫荧光显微镜，观察顺铂作用后卵巢癌细胞A2780和A2780/DDP中p-JNK、及下游p-c-Jun的表达，流式细胞术及免疫荧光显微镜观察细胞的凋亡情况。RT-PCR检测Fas/FasL的表达。20μMDDP作用后A2780细胞p-JNK、及下游p-c-Jun持续表达，而A2780/DDP细胞仅有短暂表达。JNK-dn基因转染可抑制顺铂诱导的JNK的活性，阻断顺铂诱导的细胞凋亡。JNK1-wt基因转染可使JNK持续活化，使下游的转录因子c-Jun磷酸化，使Fas/FasL上调，细胞凋亡率著增加。我们的研究表明，JNK信号转导通路在顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡中起重要作用。JNK活化时间是决定细胞存亡的关键。野生型JNK1基因能逆转A2780/DDP细胞的耐药性。 2.研究肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TNF-relatedapoptosis-inducingligand，TRAIL/APO-2L)在体外表达及其杀伤肿瘤细胞的生物学活性，探讨重组的TRAIL用于肿瘤基因治疗的应用前景，及其与化学治疗药物联合应用持续激活JNK通路从而逆转耐药的机理。我们通过构建TRAIL全长序列的pcDNA3表达载体pcDNA3-TRAIL，转染人卵巢癌OVCAR3，宫颈癌Hela和乳腺癌MCF-7/ADM等细胞株，以免疫印记法测蛋白的表达，MTT法测定pcDNA3-TRAIL杀伤肿瘤细胞的生物学活性，TUNEL检测细胞的凋亡情况。结果，成功获得了pcDNA3-TRAIL的表达载体，并可显著诱导Hela细胞的凋亡。表达pcDNA3-TRAIL的Hela细胞对顺铂的耐药性得到逆转，其IC50由35μM降至16.5μM。阿霉素对MCF-7、MCF-7/ADM和TRAIL-MCF-7/ADM细胞的IC50分别为0.65、52和12.7μM。MCF-7/ADM细胞的耐药倍数为80倍，TRAIL-MCF-7/ADM细胞的耐药倍数为19.5倍，二者相比有显著性差异。我们的研究表明，重组pcDNA3-TRAIL可用于妇科肿瘤的基因治疗且具有较好的应用前景。同时，研究重组可溶性TRAIL蛋白与ADM共同作用后，肿瘤细胞凋亡的机制，探讨TRAIL逆转肿瘤细胞耐药的可行性。

目录

课题一中文摘要

课题一英文摘要

课题一实验流程图

课题一第一部分 逆转录病毒介导的卵巢癌细胞JNK1的表达及耐药逆转

论文一 逆转录病毒介导卵巢癌细胞JNK1的表达及耐药逆转

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图1

附图2

论文二 Reversing Chemoresistance in Cisplatin-resistant Human Ovarian Cancer Cells:A Role of c-Jun NH2-terminal Kinase 1.

Introduction

Results

Discussion

Materials and methods

ACKNOWLEDGEMENTS

References

附图

课题一第二部分 JNK在肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体联合化学治疗药物诱导的乳腺癌细胞凋亡中的作用

Paper1 c-Jun-NH2-Terminal Kinase is essential for the Apoptoticsynergy Induced by Tumor necrosis Factor-related Apoptosis-inducing Ligand plus ADM in MCF-7/ADM cells

INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

RESULTS

Discussion

REFERENCE

附图

论文二 pcDNA3介导的肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体的表达及其体外抗肿瘤活性的研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

课题一第二部分 新城鸡瘟病毒修饰的自体肿瘤细胞疫苗的临床应用研究

引言

论文 卵巢癌患者术后NDV-ATV与化疗对免疫功能的影响

摘要

前言

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

参考文献

课题一第三部分 卵巢癌细胞迁移机制的研究

引言

论文 趋化因子受体及配体在卵巢癌细胞迁移中的作用

摘要

前言

1 资料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

附图

综述 妇科肿瘤的特异性主动免疫治疗进展

攻读博士学位期间完成的学术论文

致谢