低分子量肝素以及肝素用于制备肺纤维化的用途

摘要

本发明涉及低分子量肝素以及肝素用于制备肺纤维化的用途。本发明涉及的低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为3000～12000Da，重均分子量(Mw)的范围为5000～20000Da，优选其数均分子量(Mn)的范围为3500～11000Da，重均分子量(Mw)的范围为5500～17000Da，进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3600～10500Da，重均分子量(Mw)的范围为6000～15000Da，再进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3700～11000Da，重均分子量(Mw)的范围为7000～12000Da。

说明书

技术领域

本发明涉及一种低分子量肝素以及其用于制备预防或治疗肺纤维化的药物的用途，此外本发明还涉及肝素用于制备预防或治疗肺纤维化的药物的用途。

背景技术

纤维化疾病是组织在受到损伤后，因为非正常的、过度修复造成富含胶原蛋白的细胞外基质(ECM)沉积在组织及器官中，使实质细胞丧失原有的功能。纤维化疾病包括累及多系统的疾病，如系统性硬化症、多灶性纤维化、硬皮病、肾源性的多系统纤维化。也包括器官组织特异性疾病，如肺、肝脏、肾脏纤维化等疾病。

因为不同的纤维化病变涉及的器官及组织不同，暴露于不同的环境因素，并且组成的细胞类型不同，但纤维化过程均具有类似的病理过程：上皮细胞发生持续性损伤，分泌过量的细胞因子和生长因子。这些因子进一步刺激间充质细胞前体的招募和激活，形成肌成纤维细胞，随后分泌大量的细胞外基质。在正常的生理条件下，组织经过修复后，纤维化基质将被降解，成纤维细胞将发生凋亡，或逆转成为非活性细胞。但在纤维化疾病条件下，正常的清理及逆转化程序被破坏，实质细胞逐渐被肌成纤维细胞取代，失去了正常功能，导致了纤维化疾病的发生。

在西方世界，纤维化类疾病最终为死亡率贡献了高达45％的百分率，在发展中国家尚缺乏统计数据。尽管纤维化疾病发病者众多，但对于涉及到的分子机制研究是初步的，更缺乏有效的治疗方法。

特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)是一种进展性，以弥漫性肺纤维化，导致肺功能损害和呼吸困难为特征的肺间质性疾病。该病患者的平均生存时间只有3.2年，是慢性非肿瘤呼吸系统疾病中预后最差的一种致命性疾病。IPF目前的发病率是1.25–27.9/10万。该病的发病原因很多，比较明确的病因有吸入粉尘、气体、病毒、细菌、药物及放射性损伤等。在我国，因为工业化进程加快，空气污染日趋严重，患有急性及慢性肺纤维化的病人正在显著增加，从1999到2012年IPF死亡率平均为4-10/10万，每年增长2-3％。IPF的发病机制并不明确，传统认为是由慢性炎症引起，但由于抗炎或者免疫抑制剂在IPF治疗上的治疗效果不明显，目前更多关注在肺上皮细胞、纤维母细胞的变化，导致成纤维细胞活化、肺纤维化和肺组织重构失调。

目前国内外还没有开发出治愈IPF的有效药物，主要是一些延缓IPF进一步恶化的药物，例如吡非尼酮(Pirfenidone,)和尼达尼布(Nintedanib,)。吡非尼酮作用机制通过抑制TGF-β减少纤维母细胞的生成，以及通过TNF-α和IL-1β起到抗炎的作用。尼达尼布是一种细胞内的多重酪氨酸激酶的抑制剂，包括对VEGF、FGF、PDGF的抑制作用。

发明内容

肝素是一类硫酸化、多分散、线性的糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)，是最重要的抗凝药物之一。在临床上广泛应用于防治血栓栓塞性疾病。此外，肝素及其衍生物具有广泛的生物学活性，包括协调细胞黏附、调控细胞生长和增殖、发育过程、细胞表面结合脂蛋白脂肪酶和其它蛋白质、新血管发生、病毒入侵和肿瘤转移等等。已有临床前及临床研究表明，未分级的大分子量肝素对IPF的症状具有显著的减轻作用，能延缓肺纤维化的进程(Gunther,A.,Lubke,N.,Ermert,M.,Schermuly,R.T.,Weissmann,N.,Breithecker,A.,...&Seeger,W.(2003).Prevention of bleomycin-induced lung fibrosis byaerosolization of heparin or urokinase in rabbits.American Journal ofRespiratory and Critical Care Medicine,168(11),1358-1365，以及Gunther,A.,Lubke,N.,Ermert,M.,Schermuly,R.T.,Weissmann,N.,Breithecker,A.,...&Seeger,W.(2003).Prevention of bleomycin-induced lung fibrosis by aerosolization ofheparin or urokinase in rabbits.American Journal of Respiratory and CriticalCare Medicine,168(11),1358-1365.)。

但是，目前常见的大分子量肝素分子本身并不是治疗纤维化疾病的最佳结构。这是因为肝素结构的微不均一性，导致与多种因子均有很强的结合能力，从而“稀释”主要分子序列与靶点的相互作用，并产生副作用。另外，肝素分子本身具有出血较多、血小板减少等比较严重的副作用。

对于经多种降解方法得到的低分子量肝素(Low molecular weight heparins，LMWH)干预纤维化类疾病的作用，目前也已经多有报道。但由于不同的降解方法识别肝素的序列位点不同，对纤维化疾病的干预作用效果也截然不同。例如，采用β-降解方式，即，经成盐、酯化、碱水解工艺得到的依诺肝素(Enoxaparin)，干预Bleomycin造成的肺纤维化小鼠，对于肺纤维化的形成没有任何改善的作用(Laxer,U.,Lossos,I.S.,Gillis,S.,Or,R.,Christensen,T.G.,Goldstein,R.,&Breuer,R.(1999).THE EFFECT OF ENOXAPARIN ONBLEOMYCIN-INDUCED LUNG INJURY IN MICE.Experimental Lung Research,25(6),531-541)。因此，对于治疗纤维化类疾病的LMWH类药物，需要系统性筛选其活性，并进行构效关系研究，才能得到治疗疾病的有效组分，从而提高分子对各类疾病治疗选择性，达到结构功能的最佳匹配状态。

本发明的发明人致力于肝素产业技术的创新研究，利用麦芽糖结合蛋白(MaltoseBinding Protein，MBP)融合表达技术，实现了系列肝素酶的高活性、可溶性表达和工业化生产，系列肝素酶被列为中国药典标准酶(Heparinase，分别为MBP-HepI、MBP-HepII、MBP-HepIII，可以分别参见中国专利ZL200410038098.6、ZL201010259905.2，以及ZL201010259913.7)。并初步建立了组合酶法制备LMWH的新工艺(参见中国专利ZL201210328649.7)。在此基础上，本发明人经过深入地研究，成功获得了本发明的新型低分子量肝素，并发现本发明的低分子量肝素具有预防或治疗肺纤维化的功能。

本发明涉及以下内容：

1.一种低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为3000～12000Da，重均分子量(Mw)的范围为5000～20000Da，优选其数均分子量(Mn)的范围为3500～11000Da，重均分子量(Mw)的范围为5500～17000Da，进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3600～10500Da，重均分子量(Mw)的范围为6000～15000Da，再进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3700～11000Da，重均分子量(Mw)的范围为7000～12000Da。

2.根据项1所述的低分子量肝素，其中，其重均分子量的分子量分布为：分子量小于3000Da的肝素占该低分子量肝素全部的30wt％以下，优选在25wt％以下，分子量大于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的30wt％以上，优选在35wt％以上，进一步优选在40wt％以上。

3.根据项1或2所述的低分子量肝素，其中，其重均分子量的分子量分布为：分子量在3000～5000Da的肝素占该低分子量肝素全部的30wt％以下，优选在25wt％以下。

4.根据项1～3中任一项所述的低分子量肝素，其中，其数均分子量(Mn)的范围为3000～7000Da，重均分子量(Mw)的范围为6000～12000Da，优选其数均分子量(Mn)的范围为3500～6000Da，重均分子量(Mw)的范围为6500～11000Da。

5.根据项1～3中任一项所述的低分子量肝素，其中，其数均分子量(Mn)的范围为7000～10000Da，重均分子量(Mw)的范围为8000～12000Da，优选其数均分子量(Mn)的范围为8000～9800Da，重均分子量(Mw)的范围为9000～11000Da。

6.根据项1所述的低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为4000～11000Da，重均分子量(Mw)的范围为7000～12000Da，并且其不具有抗凝活性。

7.根据项6所述的低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为4000～8000Da，重均分子量(Mw)的范围为7000～12000Da。

8.根据项6所述的低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为9000～11000Da，重均分子量(Mw)的范围为9500～12000Da。

9.根据项1～8中任一项所述的低分子量肝素，其中，所述低分子量肝素是利用肝素酶降解肝素而得到的。

10.根据项1～9中任一项所述的低分子量肝素，其中，所述低分子量肝素是利用肝素酶I或肝素酶III降解肝素而得到的。

11.根据项4或项7所述的低分子量肝素，其中，所述低分子量肝素是利用肝素酶I降解肝素而得到的。

12.根据项5或项8所述的低分子量肝素，其中，所述低分子量肝素是利用肝素酶III降解肝素而得到的。

13.根据项6～8中任一项所述的低分子量肝素，其中，所述低分子量肝素是先对肝素进行去抗凝处理，然后利用肝素酶降解肝素而得到的。

14.肝素在用于制备用于治疗或预防肺纤维化的药物中的用途。

15.根据项14所述的用途，其中，所述肝素是项1～13中任一项所述的低分子量肝素。

16.根据项14所述的用途，其中，所述肝素是数均分子量(Mn)的范围为大于12000Da，重均分子量(Mw)的范围为大于20000Da的未降解的肝素。

17.肝素在用于制备用于缓解肺部胶原蛋白的形成的药物中的用途。

18.根据项17所述的用途，其中，所述肝素是项1～13中任一项所述的低分子量肝素。

19.根据项18所述的用途，其中，所述肝素是数均分子量(Mn)的范围为大于12000Da，重均分子量(Mw)的范围为大于20000Da的未降解的肝素。

20.一种用于治疗或预防肺纤维化的方法，其包括：向有所需要的哺乳动物或人给药肝素。

21.根据项20所述的方法，其中，所述肝素是项1～13中任一项所述的低分子量肝素。

22.根据项20所述的方法，其中，所述肝素是数均分子量(Mn)的范围为大于12000Da，重均分子量(Mw)的范围为大于20000Da的未降解的肝素。

23.一种用于缓解肺部胶原蛋白形成的方法，其包括：向有所需要的哺乳动物或人给药肝素。

24.根据项23所述的方法，其中，所述肝素是项1～13中任一项所述的低分子量肝素。

25根据项23所述的方法，其中，所述肝素是数均分子量(Mn)的范围为大于12000Da，重均分子量(Mw)的范围为大于20000Da的未降解的肝素。

26.一种去抗凝肝素，其数均分子量(Mn)的范围为大于11000Da，重均分子量(Mw)的范围为大于12000Da，优选数均分子量(Mn)的范围为大于12000Da，重均分子量(Mw)的范围为大于13000Da。优选数均分子量(Mn)的范围为大于13000Da，重均分子量(Mw)的范围为大于14000Da。优选数均分子量(Mn)的范围为大于13500Da，重均分子量(Mw)的范围为大于15000Da，其不具有抗凝活性。

27.根据项26所述的去抗凝肝素，其是通过对肝素分子进行N端去除硫酸根并且进行乙酰化得到的去抗凝肝素。

28.项26或27所述的肝素在用于制备用于治疗或预防肺纤维化的药物中的用途。

29.项26或27所述的肝素在用于制备用于缓解肺部胶原蛋白的形成的药物中的用途。

30.一种用于治疗或预防肺纤维化的方法，其包括：向有所需要的哺乳动物或人给药项26或项27所述的去抗凝肝素。

31.一种用于缓解肺部胶原蛋白形成的方法，其包括：向有所需要的哺乳动物或人给药项26或项27所述的去抗凝肝素。

附图说明

图1实验例2中H&E染色表征低分子量肝素对Bleomycin诱导的肺损伤及肺纤维化的影响。(a)阴性对照组；(b)I-2组；(c)I-11组；(d)III-1组；(e)III-2组；(f)健康组；(g)I-16组；(h)NS组；(i)N1组；(j)N2组；(k)N4组；(l)N5组；(m)N3组；(n)H组。

具体实施方式

以下，对本文的实施方式进行具体说明。

<本发明的低分子肝素>

本发明涉及具有治疗和/或预防肺纤维化的低分子量肝素。在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为3000～12000Da，重均分子量(Mw)的范围为5000～20000Da，优选其数均分子量(Mn)的范围为3500～11000Da，重均分子量(Mw)的范围为5500～17000Da，进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3600～10500Da，重均分子量(Mw)的范围为6000～15000Da，再进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3700～11000Da，重均分子量(Mw)的范围为7000～12000Da。即本发明涉及的低分子量肝素其数均分子量(Mn)可以为例如约3100Da，3200Da，3300Da，3400Da，3800Da，3900Da，4000Da，4100Da，4200Da，4300Da，4400Da，4500Da，4600Da，4700Da，4800Da，4900Da，5000Da，5100Da，5200Da，5300Da，5400Da，5500Da，5600Da，5700Da，5800Da，5900Da，6000Da，6100Da，6200Da，6300Da，6400Da，6500Da，6600Da，6700Da，6800Da，6900Da，7000Da，7100Da，7200Da，7300Da，7400Da，7500Da，7600Da，7700Da，7800Da，7900Da，8000Da，8100Da，8200Da，8300Da，8400Da，8500Da，8600Da，8700Da，8800Da，8900Da，9000Da，9100Da，9200Da，9300Da，9400Da，9500Da，9600Da，9700Da，9800Da，9900Da，10100Da，10200Da，10300Da，10400Da，10600Da，10700Da，10800Da，10900Da，11100Da，11200Da，11300Da，11400Da，11500Da，11600Da，11700Da，11800Da，11900Da。本发明涉及的低分子量肝素其重均分子量(Mw)可以为例如约5100Da，5200Da，5300Da，5400Da，5600Da，5700Da，5800Da，5900Da，6100Da，6200Da，6300Da，6400Da，6500Da，6600Da，6700Da，6800Da，6900Da，7000Da，7100Da，7200Da，7300Da，7400Da，7500Da，7600Da，7700Da，7800Da，7900Da，8000Da，8100Da，8200Da，8300Da，8400Da，8500Da，8600Da，8700Da，8800Da，8900Da，9000Da，9100Da，9200Da，9300Da，9400Da，9500Da，9600Da，9700Da，9800Da，9900Da，10000Da，10100Da，10200Da，10300Da，10400Da，10500Da，10600Da，10700Da，10800Da，10900Da，11000Da，11500Da，12000Da，12500Da，13000Da，13500Da，14000Da，14500Da，15500Da，16000Da，16500Da，17500Da，18000Da，18500Da，19000Da，19500Da。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其重均分子量的分子量分布为：分子量小于3000Da的肝素占该低分子量肝素全部的30wt％以下，优选在25wt％以下，优选在24wt％以下，优选在23wt％以下。分子量大于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的30wt％以上，优选在35wt％以上，优选在36wt％以上，进一步优选在38wt％以上，优选在40wt％以上。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其重均分子量的分子量分布为：分子量在3000～5000Da的肝素占该低分子量肝素全部的30wt％以下，优选在25wt％以下，优选在23wt％以下，优选在22wt％以下，分子量在5000～8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的30wt％以下，优选在25wt％以下，优选在22wt％以下。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为3000～10000Da，重均分子量(Mw)的范围为6500～12000Da，优选其数均分子量(Mn)的范围为3500～9500Da，重均分子量(Mw)的范围为7000～11000Da，该低分子量肝素是利用肝素酶III或肝素酶I降解得到的。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其重均分子量的分子量分布为：分子量在3000～5000Da的肝素占该低分子量肝素全部的2wt％以上且25wt％以下，进一步优选在3wt％以上且20wt％以下。分子量在5000～8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的5wt％以上且30wt％以下，进一步优选在8wt％以上且25wt％以下，分子量小于3000Da的肝素占该低分子量肝素全部的30wt％以下，优选25wt％以下，分子量大于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的30wt％以上且90wt％以下，优选在35wt％以上且85wt％以下，上述四种分布的总量为100wt％，该低分子量肝素是利用肝素酶I或肝素酶III降解得到的。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为3000～7000Da，重均分子量(Mw)的范围为6000～12000Da，优选其数均分子量(Mn)的范围为3500～6000Da，重均分子量(Mw)的范围为6500～11000Da，该低分子量肝素是利用肝素酶I降解得到的。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其重均分子量的分子量分布为：分子量在3000～5000Da的肝素占该低分子量肝素全部的5wt％以上且25wt％以下，进一步优选在7wt％以上且20wt％以下。分子量在5000～8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的10wt％以上且30wt％以下，进一步优选在13wt％以上且25wt％以下，分子量小于3000Da的肝素占该低分子量肝素全部的5wt％以上且30wt％以下，优选6wt％以上且25wt％以下，分子量大于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的30wt％以上且80wt％以下，优选在35wt％以上且75wt％以下，上述四种分布的总量为100wt％，该低分子量肝素是利用肝素酶I降解得到的。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为7000～10000Da，重均分子量(Mw)的范围为8000～12000Da，优选其数均分子量(Mn)的范围为8000～9800Da，重均分子量(Mw)的范围为9000～11000Da，该低分子量肝素是利用肝素酶III降解得到的。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其重均分子量的分子量分布为：分子量在3000～5000Da的肝素占该低分子量肝素全部的10wt％以下，进一步优选在2wt％以上且8wt％以下。分子量在5000～8000Da的肝素占该低分子量肝素全部5wt％以上且25wt％以下，进一步优选在8wt％以上且23wt％以下，分子量小于3000Da的肝素占该低分子量肝素全部的10wt％以下，优选5wt％以下，分子量大于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的70wt％以上，优选在90wt％以下，上述四种分布的总量为100wt％，该低分子量肝素是利用肝素酶III降解得到的。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为4000～11000Da，重均分子量(Mw)的范围为7000～12000Da，并且其不具有抗凝活性，该低分子量肝素是先对肝素进行去抗凝处理，然后利用肝素酶III或肝素酶I降解得到的。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其重均分子量的分子量分布为：分子量在3000～5000Da的肝素占该低分子量肝素全部的30wt％以下，进一步优选在2wt％以上且25wt％以下。分子量在5000～8000Da的肝素占该低分子量肝素全部5wt％以上且25wt％以下，进一步优选在8wt％以上且23wt％以下，分子量小于3000Da的肝素占该低分子量肝素全部的15wt％以下，优选12wt％以下，分子量大于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的40wt％以上，优选在90wt％以下，上述四种分布的总量为100wt％，该低分子量肝素是先对肝素进行去抗凝处理，然后利用肝素酶III或肝素酶I降解得到的。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为4000～8000Da，重均分子量(Mw)的范围为7000～12000Da，该低分子量肝素是先对肝素进行去抗凝处理，然后利用肝素酶I降解得到的，并且其不具有抗凝活性。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其重均分子量的分子量分布为：分子量在3000～5000Da的肝素占该低分子量肝素全部的30wt％以下，进一步优选在4wt％以上且25wt％以下。分子量在5000～8000Da的肝素占该低分子量肝素全部5wt％以上且25wt％以下，进一步优选在8wt％以上且23wt％以下，分子量小于3000Da的肝素占该低分子量肝素全部的15wt％以下，优选12wt％以下，分子量大于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的40wt％以上，优选在85wt％以下，上述四种分布的总量为100wt％，该低分子量肝素是先对肝素进行去抗凝处理，然后利用肝素酶I降解得到的，并且其不具有抗凝活性。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为9000～11000Da，重均分子量(Mw)的范围为9500～12000Da，该低分子量肝素是先对肝素进行去抗凝处理，然后利用肝素酶III降解得到的，并且其不具有抗凝活性。

在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其重均分子量的分子量分布为：分子量在3000～5000Da的肝素占该低分子量肝素全部的20wt％以下，进一步优选在1wt％以上且15wt％以下。分子量在5000～8000Da的肝素占该低分子量肝素全部5wt％以上且20wt％以下，进一步优选在8wt％以上且18wt％以下，分子量小于3000Da的肝素占该低分子量肝素全部的10wt％以下，优选8wt％以下，分子量大于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的60wt％以上，优选在90wt％以下，上述四种分布的总量为100wt％，该低分子量肝素是先对肝素进行去抗凝处理，然后利用肝素酶III降解得到的，并且其不具有抗凝活性。

在本发明中，上述重均分子量、数均分子量，以及分子量分布可以采用公知的方法检测，例如按照在Wu,Jingjun等人"Controllable production of low molecular weightheparins by combinations of heparinase I/II/III."Carbohydrate polymers 101(2014):484-492中所记载的方法进行检测，其具体的检测步骤可以参见下述实施例中描述的方法。如果其它公知的检测方法检测的结果与该方法的检测结果不一致时，本发明所涉及的低分子量肝素的重均分子量、数均分子量和分子量分布以本发明实施例中所采用的方法为准。

<低分子肝素用于抑制肺纤维化的效果>

本发明涉及的低分子肝素能够用于治疗或预防肺纤维化。

本发明涉及该低分子肝素在制备治疗或预防肺纤维化的药物中的用途。

在本发明中的肺纤维化是指以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变，也就是正常的肺泡组织被损坏后经过异常修复导致结构异常(疤痕形成)。本发明中的肺纤维化包括特发性肺纤维化、原发性肺纤维化、继发性肺纤维化、肺间质性纤维化。本发明涉及该低分子肝素在制备治疗或预防特发性肺纤维化、原发性肺纤维化、继发性肺纤维化和/或肺间质性纤维化疾病的药物中的用途。

本发明涉及的低分子量肝素可以有效地抑制诱发了肺纤维化的小鼠的死亡率，并且对于给药后的小鼠的肺组织进行切片观察显示，在给药本发明的低分子肝素后，小鼠的肺部呈现基本完整的肺泡结构，大部分肺泡呈现单层细胞结构，细胞形态与正常组类似，无明显的炎性浸润性特征，说明纤维化程度也有不同程度的变轻趋势。

本发明人发现在肺组织改变方面，经给药后本发明涉及的低分子量肝素与通常的大分子量肝素的效果基本一致，但是给药本发明的低分子肝素时不具有大分子量肝素所具有的副作用，即出血风险增加，以及容易诱发血小板减少症。本发明中涉及的几种低分子量肝素虽然抑制肺纤维化效果与大分子量肝素抑制肺纤维化的效果差不多，但是低分子量肝素药物代谢可控，在临床不需要监测病人的出血风险。

此外本发明涉及的低分子量肝素对抑制肺部的水肿均有一定的作用，有效地降低了小鼠肺部组织中的羟脯氨酸的含量，即有效地降低了肺部胶原蛋白的转化率，降低了肺部胶原蛋白含量，由于胶原蛋白的沉积是纤维化病变最明显的特征，因此胶原蛋白含量的降低表明肺纤维化得到了控制。目前常用的依诺肝素，则没有抑制肺纤维化的效果(参见Laxer U,Lossos I S,Gillis S,et al.The effect of enoxaparin on bleomycin-induced lung injury in mice[J].Experimental lung research,1999,25(6):531-541)，可见本发明获得的低分子肝素与依诺肝素的结构不同，其功效也完全不同。

虽然不意在受理论限制，但本发明得到的低分子肝素是通过酶法降解得到的低分子肝素，其降解机理完全不同于通过化学法得到的依诺肝素，根据实施例中对于分子量分布的分析数据也可以明确地看出其区别。

本发明涉及的酶降解法制备的低分子量肝素，能够显著抑制肺损伤的形成，抑制肺损伤过程中的炎症发生，从而从根本上预防和抑制肺纤维化的形成，减少胶原蛋白的沉积。而目前面世的抗肺纤维化类药物，仅能缓解肺纤维化形成的症状，在IPF治疗上的治疗效果并不明显。

本发明还涉及去除了抗凝活性的肝素衍生物，根据下述实施例的数据可以看出，无论是去除了抗凝活性的肝素衍生物，还是对其进一步利用上述酶解方法进行降解后得到的低分子量的去抗凝肝素衍生物，其均有效地抑制诱发了肺纤维化的小鼠的死亡率。

在给药本发明的去除了抗凝活性的肝素衍生物以及低分子量的去抗凝肝素衍生物之后，小鼠的肺部呈现基本完整的肺泡结构，大部分肺泡呈现单层细胞结构，细胞形态与正常组类似，无明显的炎性浸润性特征，说明纤维化程度也有不同程度的变轻趋势。此外，给药此类肝素之后，对抑制肺部的水肿均有一定的作用，有效地降低了小鼠肺部组织中的羟脯氨酸的含量，即有效地降低了肺部胶原蛋白的转化率，降低了肺部胶原蛋白含量，由于胶原蛋白的沉积是纤维化病变最明显的特征，因此胶原蛋白含量的降低表明肺纤维化得到了控制。根据本发明的实验例的结果显示，给药去除了抗凝活性的肝素衍生物和给药对该抗凝活性的低分子肝素衍生物均具有上述效果，但给药本发明的低分子肝素时不具有大分子量肝素所具有的副作用，即出血风险增加，以及容易诱发血小板减少症。本发明中涉及的几种低分子量肝素虽然抑制肺纤维化效果与大分子量肝素抑制肺纤维化的效果差不多，但是低分子量肝素药物代谢可控，在临床不需要监测出病人的血风险。

<本发明中生产去抗凝肝素的方法>

除了普通肝素之外，在本发明中还采用了去抗凝肝素作为原料生产低分子量肝素。

通常来说肝素、低分子量肝素、戊糖都是通过加快抗凝血酶Ⅲ灭活凝血因子的速度而起到抗凝作用，该类药物的主要作用是抗Xa和抗IIa因子活性。通过对肝素类药物抗Xa活性与抗IIa活性的研究发现，抗Xa活性对分子质量不敏感，抗IIa活性则依赖分子质量的大小。分子质量越大，抗IIa活性越强。肝素对IIa因子灭活有赖于肝素-抗凝血酶-IIa因子三联复合物的形成，此时肝素同时结合于抗凝血酶和因子IIa，要实现这种连接肝素至少要含有18个糖单位，其中起“桥梁”作用需要13个单糖，另需5个单糖作为识别片段。每个单糖平均分子质量为300Da，因此分子质量一定要达到5400Da以上才具有抗IIa活性。普通肝素平均分子质量15000-19000Da，绝大多数分子在5400Da以上，其抗Xa与抗IIa活性比值约为1。低分子肝素平均分子质量为4000-5000Da，分子质量在5400Da以上的分子片段所占比例较小，一般情况下其抗Xa:抗IIa活性约1.5:1～5:1。

在本领域中，存在多种方法用于去除肝素的抗凝活性，本发明并不限定用于获得去抗凝肝素的方法。在一个具体的实施方案中，在本发明中采用的去抗凝肝素的制备方法是去除肝素N端的硫酸根然后对其进行乙酰化的方法(这样得到的肝素在下文中也称为N-乙酰化肝素)，具体的制备方法可以参见Lapierre F,Holme K,Lam L,et al.Chemicalmodifications of heparin that diminish its anticoagulant but preserve itsheparanase-inhibitory,angiostatic,anti-tumor and anti-metastatic properties[J].Glycobiology,1996,6(3):355-366所报道的方法。

如下述实施例和对比例所示，在本发明中，具有抗凝活性的肝素原料的抗Xa效价为187±21IU/mg，抗IIa效价为177±6IU/mg。而利用了本发明的去除肝素抗凝活性的方法去除了抗凝活性的肝素的抗Xa效价为15±2IU/mg，抗IIa效价为12±0.6IU/mg。此外，如后续实施例所示，利用肝素酶处理原料肝素之后得到的低分子肝素的抗Xa和抗IIa的效价与未酶解的原料肝素相比会有一定程度降低，但是其仍然是具有抗凝活性的低分子量肝素。

在本发明中定义的不具有抗凝活性的肝素，是指对肝素进行了充分的去抗凝处理之后得到肝素，这种肝素其抗Xa效价和抗IIa效价远低于原料肝素和经过肝素酶降解得到的低分子量肝素，例如抗Xa效价为20IU/mg以下，抗IIa效价为20IU/mg以下。

利用上述去抗凝方法处理得到的去抗凝肝素，数均分子量(Mn)的范围为大于11000Da，重均分子量(Mw)的范围为大于12000Da。优选数均分子量(Mn)的范围为大于12000Da，重均分子量(Mw)的范围为大于13000Da。优选数均分子量(Mn)的范围为大于13000Da，重均分子量(Mw)的范围为大于14000Da。优选数均分子量(Mn)的范围为大于13500Da，重均分子量(Mw)的范围为大于15000Da。

分子量在3000～5000Da的肝素占该低分子量肝素全部的15wt％以下，进一步优选在10wt％以下。分子量在5000～8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的20wt％以下，进一步优选在15wt％以下，分子量小于3000Da的肝素占该低分子量肝素全部的10wt％以下，优选8wt％以下，分子量大于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的80wt％以上，优选在90wt％以上，上述四种分布的总量为100wt％，该肝素不具有抗凝活性。

<本发明的低分子肝素的生产>

在生产本发明涉及的低分子量肝素的过程中使用了不同种类的肝素酶，这些肝素酶可以是通过任何方法获得的肝素酶，包括肝素酶I、II和III，其只要是具有肝素酶的活性即可，其中优选使用肝素酶I、II、III。现有技术中，肝素酶I的E.C.号为E.C.4.2.2.7，肝素酶III的E.C.号为E.C.4.2.2.8。也可以采用购买的肝素酶，例如购自Sigma公司或IBEX公司买到的肝素酶I、II、III。肝素酶也可以是通过分子生物学方法构建的重组肝素酶I、II和III或者肝素酶I、II和III与任何融合伴侣形成的融合蛋白。根据本发明一个优选的实施方案，肝素酶I、II和III是肝素酶I、II和III的融合蛋白，尤其是包含MBP的肝素酶I、II和III的融合蛋白。

肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III也可以是与任何融合伴侣形成的融合蛋白，只要具有肝素酶I、II和III的活性即可。根据本文一个优选的实施方案，肝素酶I、II和III是肝素酶I、II和III和融合伴侣形成的融合蛋白，尤其是麦芽糖结合蛋白(MBP)和肝素酶I、II和III的融合蛋白。肝素酶I和MBP的融合蛋白在下文中有时被称为MBP-HepA(参见中国专利ZL200410038098.6，授权公告号CN1312183C)，肝素酶II和MBP的融合蛋白在下文中有时被称为MBP-HepB(参见中国专利ZL 201010259905.2，授权公告号CN101942024B)，肝素酶III和MBP的融合蛋白在下文中有时被称为MBP-HepC(参见中国专利ZL 201010259913.7，授权公告号CN101942025B)。优选肝素酶I、II和III分别具有中国专利ZL201210328649.7，授权公告号CN103173506B的序列表中SEQ ID NO:1～3所述的序列。

在生产本发明涉及的低分子量肝素时，肝素酶I、II、III或它们的任意组合与底物肝素进行反应的方式可以分批的、连续的或半连续的，本领域普通技术人员可以根据生产的需要适当地选择。对于反应的时间、反应装置而言，只要是可以得到目标的低分子量肝素即可，可以由本领域普通技术人员适当确定。

在一个具体的实施方案中，在生产本发明的低分子量肝素的方法中，向反应器中加入底物肝素溶液，然后加入肝素酶I、II或III中的一种或两种以上，与底物肝素进行反应。随着反应的进行，肝素逐渐被降解，每隔一段时间对反应液进行监测，在适当的时候终止反应。将上述反应终止了的混合溶液用纤维素膜真空初滤装置进行初滤，再利用超滤装置进行超滤得到次滤液。然和加入乙醇混合均匀后，离心弃上清收集沉淀，然后往沉淀中加入丙酮洗涤并用旋转蒸发仪进行减压蒸干即得到低分子量肝素产品粉末。本领域技术人员可以理解上述方法仅仅为示例性的，也可以采用其他方法获得通过酶反应降解后的低分子量肝素。

肝素酶I、II和III各自的用量，本领域普通技术人员可以参考不同酶的活性根据生产所需来适当确定，优选每种酶的用量为肝素酶I在每升反应液10IU～500IU的范围，优选在100IU～250IU的范围。肝素酶II在每升反应液10IU～500IU的范围，优选在100IU～200IU的范围。肝素酶III在每升反应液10IU～500IU的范围，优选25～100IU。其中IU表示：在温度为30℃，pH7.4条件下，每分钟产生1μmol 4,5不饱和末端产物的酶量。

用于生产本发明的低分子量肝素的底物肝素可以商购，也可以从动物中直接提取，例如可以从猪小肠粘膜提取。肝素二糖单位主要为L-艾杜糖醛酸和N-硫酸化的氨基葡萄糖通过α(1→4)糖苷键连接。

用于生产本发明的低分子量肝素的底物可以购买自例如河北常山生化药业股份有限公司的肝素、烟台东诚生化股份有限公司、深圳市海普瑞药业股份有限公司、常州千红生化制药股份有限公司、美药星(南京)制药有限公司等。

本发明中使用底物肝素的浓度可以由本领域技术人员来确定，没有特定地限制，优选为1～100g/L。本发明中使用的底物肝素是大分子量的未分级的肝素，其分子量例如可以是分布在5000～30000，平均分子量为20000。

在进行本发明的生产方法之前，可以将底物肝素添加到缓冲液中，配制到合适的浓度。所使用的缓冲液只要不损害肝素酶I、II、III或它们的组合的酶活即可。在一个具体的生产方法中，采用的是20mM Tris、20mM CaCl₂、50mM>2和200mM>

对肝素酶I、II、III或它们的组合与底物肝素进行反应时的温度没有具体限定，只要是不会使肝素酶I、II、以及III失活的温度即可，例如可以设定为10～45℃，最优选30℃。

对于肝素酶I、II、III或它们的组合与底物肝素进行反应的时间没有具体限定，本领域技术人员可以根据所添加的肝素酶的酶活、底物的浓度和反应的温度可以适当选择，在一个具体的方法中，肝素酶I、II、III或它们的组合与底物反应的时间可以5分钟～10小时，也可以为10分钟～4小时。

在本发明所述的低分子肝素的生产方法中，在肝素酶I、II、III或它们的组合与底物肝素进行反应的过程中，对反应的溶液进行监测的方式可以根据反应体系来适当选择，在一个具体的方法中，利用紫外分光光度计检测231nm处的吸光度的变化，随着反应的进行231nm处的吸光度A₂₃₁不断增加，从而通过吸光度的增加来确定反应进行的程度。

在反应的过程中，当按照上述方法测定反应进行到所期望的程度时，可以终止反应，以进一步分离以获得超低分子量肝素或低分子量肝素。其中对于终止反应的方法，本领域技术人员可以根据其掌握的知识来选择，例如加入终止反应的试剂，或提高温度以使酶失活。在一个具体的实施方式中，终止反应时加盐酸调节pH值至2.0后停留3分钟，再用2.0M的NaOH将pH值调回7.0。从不添加其它的杂质的观点来看，优选提高反应体系的温度使酶失活从而终止反应。在一个具体的实施方式中，将整个反应体系放置在100℃水浴中10分钟，从而使酶降解底物的反应终止。

在本发明所述的生产方法中，如果需要添加两种或以上种类的肝素酶时，可以先添加一种肝素酶与底物肝素反应，在反应进行一段时间后，终止反应，然后再加入其它的肝素酶继续反应，并最终终止反应。也可以同时加入两种或两种以上肝素酶进行反应待反应进行到期望的程度时终止反应。

在上述本发明的生产低分子量肝素的方法中使用的肝素可以是普通的大分子肝素，也可以是如上所述的去抗凝肝素。

实施例

实施例1低分子量肝素1的制备(以下，也称为低分子量肝素I-2)

将5g肝素(购买自常山生化药业，产品名：肝素钠，其分子量分布在5000～30000，平均分子量为20000)与100mLTris缓冲液(20mM Tris，50mM NaCl，20mM CaCl₂)配置成溶液，向该配置的50g/L肝素溶液100mL中一次性添加总酶活为100IU的按照ZL200410038098.6制备的肝素酶I。使用光程差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液在231nm处的光吸收A231。当A231达到反应控制点(A231＝20)时，使反应结束，结束的方法为在100℃沸水浴中对反应溶液中的酶灭活5～10min，然后取出反应体系冷却至室温，向反应溶液中添加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，然后在室温下以4000r/min的速度离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm的膜过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到低分子量肝素1(也命名为：产品I-2)。

然后针对产品I-2进行分子量、以及分子量分布的分析。采用凝胶排阻高效液相色谱法测定低分子量肝素的重均分子量(Mw)，数均分子量(Mn)和分布系数(P)。色谱柱为TSK-GEL G2000SWXL(TOSOH，日本)，控制流速为0.5mL/min，柱温35℃，进样体积为25μL。采用WATERS(1525，美国)色谱系统，紫外检测器和示差检测器以先后次序串联连接于色谱柱的出口，紫外检测器波长为234nm。分子量及其分布测定方法可以参考Wu,Jingjun等人"Controllable production of low molecular weight heparins by combinations ofheparinase I/II/III."Carbohydrate polymers 101(2014):484-492中所记载的方法。

通过上述方法分析的结果显示，产品I-2的数均分子量为5528Da，重均分子量为10219Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品I-2总量的6.189％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品I-2总量的7.757％，重均分子量5K-8K的肝素占产品I-2总量的15.181％，重均分子量大于8K的肝素占产品I-2总量的70.873％。

进一步对上述获得的产品I-2的抗Xa、IIa因子活性进行检测

肝素的抗凝活性需要通过体外试验测定其加速抗凝血酶(以下简称ATIII)抑制Xa因子(以下简称抗Xa因子)和IIa因子(以下简称抗IIa因子)的活性来决定。本发明中采用的抗Xa和抗IIa因子活性检测方法可参照欧洲药典。抗Xa和抗IIa的国际单位(InternationalUnit，IU)是指确定量的肝素或低分子肝素国际标准品所含的活性。待测肝素供试品的抗凝活性是通过与国际标准品相应活性进行对比计算得到的。

(1)溶液配制：

Tris-HCl缓冲液(pH7.4)：取Tris 6.08g和NaCl 8.77g，加水500mL使之溶解，加牛血清蛋白10g，用HCl调节pH值至7.4，加水稀释至1000mL。

Tris-EDTA缓冲液(pH8.4)：取Tris 3.03g、NaCl 5.12g和EDTA·2Na1.4g，加水250mL使之溶解，用HCl调节pH值至8.4，加水稀释至500mL。肝素标准品及供试样品溶液：肝素活性标准品购自EDQM(European Directorate for the Quality of Medicines)的heparin low-molecular-mass for assay BRP(Biological Reference Preparation)(H0185000,for detection of anti-factor Xa activity and anti-factor IIaactivity)。用Tris-HCl缓冲液(pH7.4)分别将标准品(S)和供试品(T)稀释成4个不同浓度的溶液，各剂量间的剂距比控制在1:0.7～1:0.6。该浓度应在剂量对数～反应的线性范围内，检测抗Xa因子时一般为每毫升0.025IU～0.2IU，检测抗IIa因子时一般为每毫升0.015IU～0.075IU。

ATIII溶液：ATIII购自Chromogenix公司(Sweden)。检测抗Xa因子时以Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制成1IU/mL的溶液；检测抗IIa因子时以Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制成0.5IU/mL的溶液。

发色底物溶液：检测抗Xa因子时用发色底物S-2765(N-α-benzyloxycarbonyl

-D-arginyl-L-glycyl-L-arginine-p-nitroaniline-dihydrochloride)，购自Chromogenix公司(Sweden)。检测抗IIa因子时用发色底物S-2238(H-D-phenylalanyl-L-pipecolyl-arginine-p-nitroaniline-dihydrochloride)，购自Chromogenix公司(Sweden)。两种发色底物均用去离子水制成0.003M的溶液储存，临用前用Tris-EDTA缓冲液(pH8.4)稀释至0.0005M。

抗Xa因子溶液：用Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制，调试浓度，使之在用0.9％NaCl替代(超)低分子量肝素的抗Xa实验中，在405nm处的吸光度值处于0.6～0.7之间。

抗IIa因子溶液：用Tris-HCl缓冲液(pH7.4)溶解并稀释成5IU/mL的溶液。

测定方法：

取1.5mL离心管16支，分别标记T₁，T₂，T₃，T₄及S₁，S₂，S₃，S₄。各浓度平行做两管。每管分别加入4种浓度的供试品(T)或标准品(S)稀释液50μl，以及50μl>1，S₂，S₃，S₄，T₁，T₂，T₃，T₄，T₁，T₂，T₃，T₄，S₁，S₂，S₃，S₄顺序排列，37℃水浴平衡1分钟后每管中加入100μl抗Xa(或抗IIa)因子溶液，37℃准确孵育1min后加入发色底物溶液250μl，混合，37℃水浴保温4分钟立即各加30％的醋酸溶液375μl终止反应。用1cm光程的半微量比色皿，以Tris-HCl缓冲液(pH7.4)为空白，测定405nm处的吸光度。以Tris-HCl缓冲液(pH7.4)代替供试品溶液(平行做两管)同法操作作为空白对照管，在16管开始和结尾时，分别测定空白对照管的吸光度。两者吸光度不得有显著性差异。以吸光度为纵坐标，标准品溶液(或供试品溶液)为浓度对数值为横坐标做线性回归，按生物检定统计法中的量反应平行线原理4×4法实验设计，计算效价及实验误差。平均信限率(FL％)不得大于15％。

根据上述方法检测产品I-2的抗Xa效价为74±10IU/mg，抗IIa效价为91±10IU/mg。

实施例2低分子量肝素2的制备(以下，也称为低分子量肝素I-11)

向与实施例1同样方法配置的50g/L肝素溶液100mL中一次性添加总酶活为100IU的按照ZL200410038098.6制备的肝素酶I。使用光程差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液在231nm处的光吸收A231。当A231达到反应控制点(A231＝46.3)时，使反应结束，结束的方法为在100℃沸水浴中对反应溶液中的酶灭活5～10min，然后取出反应体系冷却至室温，向反应溶液中添加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，然后在室温下以4000r/min的速度离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm的膜过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到低分子量肝素2(也命名为：产品I-11)。

然后按照实施例1的方法针对产品I-11进行分子量、以及分子量分布的分析。通过上述方法分析的结果显示，产品I-11的数均分子量为3768Da，重均分子量为7160Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品I-11总量的22.273％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品I-11总量的15.842％，重均分子量5K-8K的肝素占产品I-11总量的21.674％，重均分子量大于8K的肝素占产品I-11总量的40.211％。

然后按照实施例1的方法检测产品I-11的抗Xa效价和抗IIa效价，其中抗Xa效价为86±10IU/mg，抗IIa效价为43±10IU/mg。

实施例3低分子量肝素3的制备(以下，也称为低分子量肝素III-1)

向与实施例1同样方法配置的50g/L肝素溶液100mL中一次性添加总酶活为100IU的按照ZL 201010259913.7制备的肝素酶III。使用光程差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液在231nm处的光吸收A231。当A231达到反应控制点(A231＝7.77)时，使反应结束，结束的方法为在100℃沸水浴中对反应溶液中的酶灭活5～10min，然后取出反应体系冷却至室温，向反应溶液中添加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，然后在室温下以4000r/min的速度离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm的膜过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到低分子量肝素3(也命名为：产品III-1)。

然后按照实施例1的方法针对产品III-1进行分子量、以及分子量分布的分析。通过上述方法分析的结果显示，产品III-1的数均分子量为9476Da，重均分子量为10622Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品III-1总量的1.022％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品III-1总量的3.252％，重均分子量5K-8K的肝素占产品III-1总量的10.810％，重均分子量大于8K的肝素占产品III-1总量的84.916％。

然后按照实施例1的方法检测产品III-1的抗Xa效价和抗IIa效价，其中抗Xa效价为158±10IU/mg，抗IIa效价为155±10IU/mg。

实施例4低分子量肝素4的制备(以下，也称为低分子量肝素III-2)

向与实施例1同样方法配置的50g/L肝素溶液100mL中一次性添加总酶活为100IU的按照ZL 201010259913.7制备的肝素酶III。使用光程差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液在231nm处的光吸收A231。当A231达到反应控制点(A231＝18.56)时，使反应结束，结束的方法为在100℃沸水浴中对反应溶液中的酶灭活5～10min，然后取出反应体系冷却至室温，向反应溶液中添加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，然后在室温下以4000r/min的速度离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm的膜过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到低分子量肝素4(也命名为：产品III-2)。

然后按照实施例1的方法针对产品III-2进行分子量、以及分子量分布的分析。通过上述方法分析的结果显示，产品III-2的数均分子量为8659Da，重均分子量为10151Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品III-2总量的1.848％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品III-2总量的4.963％，重均分子量5K-8K的肝素占产品III-2总量的13.611％，重均分子量大于8K的肝素占产品III-2总量的79.578％。

然后按照实施例1的方法检测产品III-2的抗Xa效价和抗IIa效价，其中抗Xa效价为132±10IU/mg，抗IIa效价为138±10IU/mg。

实施例5N-乙酰化肝素衍生物(NS)的制备

将5g肝素(购买自常山生化药业，产品名：肝素钠，其分子量分布在5000～30000，平均分子量为20000)通过苯乙烯阳离子交换树脂短柱(HL-1200,上海广锐生物科技有限公司)，在4℃，以2.2mL/12min的流速并对紫外区域光吸收变化进行监测，进一步，流出液采用纯吡啶进行中和，并经进一步冻干获得白色粉末形式的肝素吡啶盐。

将上述得到的肝素吡啶盐溶解在300mL的95％的DMSO水溶液中，50℃、加热5h，采用NaOH(1M)调节pH至8.0，经冻干后得到N端去除硫酸根的肝素衍生物。将上一步得到的样品溶解到饱和的NaHCO₃溶液中，在4℃下加入200μL醋酐，并用NaOH溶液调节pH至7.5-8.4。反应液在截留分子量为1kDa的透析袋中透析除盐，冻干得到产物，以下也称为NS肝素(具体制备方法可以参见：Lapierre>

然后针对产品NS进行分子量分析。通过实施例1方法分析的结果显示，产品NS的数均分子量为14071Da，重均分子量为16148Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品NS总量的1.1％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品NS总量的1.28％，重均分子量5K-8K的肝素占产品NS

总量的5.09％，重均分子量大于8K的肝素占产品NS总量的92.53％。

然后按照实施例1的方法检测产品NS的抗Xa效价和抗IIa效价，其中抗Xa效价为15±2IU/mg，抗IIa效价为12±2IU/mg。

实验例6N-乙酰化低分子量肝素衍生物(N1)的制备

按照与实施例1同样方法，配置100mL上述实施例5制备的NS肝素溶液(NS肝素浓度为50g/L，20mM Tris，50mM NaCl，20mM CaCl2，pH 7.6)，向该配置的50g/LNS肝素溶液100mL中一次性添加总酶活为100IU的按照ZL200410038098.6制备的肝素酶I。使用光程差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液在231nm处的光吸收A231。当A231达到反应控制点(A231＝18.9)时，使反应结束，结束的方法为在100℃沸水浴中对反应溶液中的酶灭活5～10min，然后取出反应体系冷却至室温，向反应溶液中添加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，然后在室温下以4000r/min的速度离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm的膜过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到N-乙酰化低分子量肝素衍生物1(也命名为：产品N1)。

然后按照实施例1的方法针对产品N1进行分子量、以及分子量分布的分析。通过上述方法分析的结果显示，产品N1的数均分子量为7534Da，重均分子量为11511Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品N1总量的1.446％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品N1总量的6.291％，重均分子量5K-8K的肝素占产品N1总量的10.635％，重均分子量大于8K的肝素占产品N1总量的81.608％。

实验例7N-乙酰化低分子量肝素衍生物(N2)的制备

与实施例6同样方法配置成100mL NS肝素溶液，向配置的50g/LNS肝素溶液100mL中一次性添加总酶活为100IU的按照ZL200410038098.6制备的肝素酶I。使用光程差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液在231nm处的光吸收A231。当A231达到反应控制点(A231＝40)时，使反应结束，结束的方法为在100℃沸水浴中对反应溶液中的酶灭活5～10min，然后取出反应体系冷却至室温，向反应溶液中添加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，然后在室温下以4000r/min的速度离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm的膜过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到N-乙酰化低分子量肝素衍生物2(也命名为：产品N2)。

然后按照实施例1的方法针对产品N2进行分子量、以及分子量分布的分析。通过上述方法分析的结果显示，产品N2的数均分子量为4022Da，重均分子量为7160Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品N2总量的11.803％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品N2总量的21.342％，重均分子量5K-8K的肝素占产品N2总量的20.776％，重均分子量大于8K的肝素占产品N2总量的46.079％。

实验例8N-乙酰化低分子量肝素衍生物(N4)的制备

与实施例6同样方法配置的100mL NS肝素溶液，向配置的50g/LNS肝素溶液100mL中一次性添加总酶活为100IU的按照ZL 201010259913.7制备的肝素酶III。使用光程差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液在231nm处的光吸收A231。当A231达到反应控制点(A231＝4.92)时，使反应结束，结束的方法为在100℃沸水浴中对反应溶液中的酶灭活5～10min，然后取出反应体系冷却至室温，向反应溶液中添加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，然后在室温下以4000r/min的速度离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm的膜过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到N-乙酰化低分子量肝素衍生物4(也命名为：产品N4)。

然后按照实施例1的方法针对产品N4进行分子量、以及分子量分布的分析。通过上述方法分析的结果显示，产品N4的数均分子量为10001Da，重均分子量为11134Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品N4总量的1.29％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品N4总量的2.909％，重均分子量5K-8K的肝素占产品N4总量的9.943％，重均分子量大于8K的肝素占产品N4总量的85.858％。

实验例9N-乙酰化低分子量肝素衍生物(N5)的制备

与实施例6同样方法配置的100mL NS肝素溶液，向配置的50g/LNS肝素溶液100mL中一次性添加总酶活为100IU的按照ZL201010259913.7制备的肝素酶III。使用光程差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液在231nm处的光吸收A231。当A231达到反应控制点(A231＝14.20)时，使反应结束，结束的方法为在100℃沸水浴中对反应溶液中的酶灭活5～10min，然后取出反应体系冷却至室温，向反应溶液中添加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，然后在室温下以4000r/min的速度离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm的膜过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到N-乙酰化低分子量肝素衍生物5(也命名为：产品N5)。

然后按照实施例1的方法针对产品N5进行分子量、以及分子量分布的分析。通过上述方法分析的结果显示，产品N5的数均分子量为9900Da，重均分子量为10392Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品N5总量的0.37％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品N5总量的5.059％，重均分子量5K-8K的肝素占产品N5总量的12.106％，重均分子量大于8K的肝素占产品N5总量的82.465％。

对比例1

从河北常山生化购买未分级肝素，该肝素(UFH，也称为H组)的数均分子量Mn为14000，重均分子量为24899。

然后按照实施例1的方法检测产品UFH的抗Xa效价和抗IIa效价，其中抗Xa效价为187±21IU/mg，抗IIa效价为177±6IU/mg。

对比例2

从河北常山生化药业购买伊诺肝素，该肝素的数均分子量为4372，重均分子量为5679。采用本发明中描述的方法对伊诺肝素进行分子量分析。

通过上述方法分析的结果显示，伊诺肝素的分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占伊诺肝素总量的20.71％，重均分子量为3K-5K的肝素占伊诺肝素总量的55.42％，重均分子量5K-8K的肝素占伊诺肝素总量的13.16％，重均分子量大于8K的肝素占伊诺肝素总量的10.71％。

对比例3低分子量肝素5(产品I-16)的制备

向与实施例1同样方法配置的50g/L肝素溶液100mL中一次性添加总酶活为100IU的按照ZL200410038098.6制备的肝素酶I。使用光程差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液在231nm处的光吸收A231。当A231达到反应控制点(A231＝98.6)时，使反应结束，结束的方法为在100℃沸水浴中对反应溶液中的酶灭活5～10min，然后取出反应体系冷却至室温，向反应溶液中添加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，然后在室温下以4000r/min的速度离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm的膜过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到低分子量肝素5(也命名为：产品I-16)。

然后按照实施例1的方法针对产品I-16进行分子量、以及分子量分布的分析。通过上述方法分析的结果显示，产品I-16的数均分子量为2523Da，重均分子量为4341Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品I-16总量的34.707％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品I-16总量的34.637％，重均分子量5K-8K的肝素占产品I-16总量的17.908％，重均分子量大于8K的肝素占产品I-16总量的12.748％。

对比例4N-乙酰化低分子量肝素衍生物(N3)的制备

与实施例6同样方法配置的100mL NS肝素溶液，向配置的50g/LNS肝素溶液100mL中一次性添加总酶活为100IU的按照ZL200410038098.6制备的肝素酶I。使用光程差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液在231nm处的光吸收A231。当A231达到反应控制点(A231＝92)时，使反应结束，结束的方法为在100℃沸水浴中对反应溶液中的酶灭活5～10min，然后取出反应体系冷却至室温，向反应溶液中添加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，然后在室温下以4000r/min的速度离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm的过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到N-乙酰化低分子量肝素衍生物3(也命名为：产品N3)。。

然后按照实施例1的方法针对产品N3进行分子量、以及分子量分布的分析。通过上述方法分析的结果显示，产品N3的数均分子量为2033Da，重均分子量为4549Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品N3总量的35.481％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品N3总量的32.363％，重均分子量5K-8K的肝素占产品N3总量的17.69％，重均分子量大于8K的肝素占产品N3总量的14.466％。

表1实施例和对比例中的各肝素产品的分子量及分子量分布汇总

实验例1肺纤维化动物模型建立及肺纤维化药效学评价

C57BL/6小鼠(20-25g，8-12周龄)经1％Averdin(Sigma公司)麻醉固定后，乙醇消毒颈部皮肤，于颈中部做一长为左右的切口，钝性分离皮下组织，暴露气管，以2.8mg/kg剂量于气管内注射Bleomycin(大连美仑生物技术有限公司)，注射后立即直立匀速旋转小鼠，使药物在肺内均匀分布，缝合颈部皮肤。在进行了上述处理后的当天开始给药，并将当天作为第1天，给药方案如下所述。

每隔一天向上述处理过的小鼠喷雾实施例1至9和对比例1和3-4组的肝素以进行给药。除给药组之外，设置阴性控制组，该阴性控制组为按照与上述同样的方法处理的小鼠，每隔一天给予相同量的生理盐水作为阴性对照；设置健康组(也称为阳性对照组)，对正常小鼠每隔一天给予同样剂量的生理盐水建立模型，造模过程中不给予任何药物，每组小鼠5只。喷雾给药给予2mg/mL浓度的上述各实施例和对比例组的药物5mL，给药频次为隔天给药一次，并在给药之后的第21天猝死全部小鼠，取肺部，并按照Cahill,Emer F.等人"Hepatocyte Growth Factor Is Required for Mesenchymal Stromal Cell ProtectionAgainst Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis."Stem Cells TranslationalMedicine(2016):sctm-2015中描述的方法计算小鼠的生存率。

根据上述方法计算的小鼠生存率的结果如表2所示，可以看出与阴性对照组相比，给药实施例1-9组、对比例1组的小鼠的生存率均有大幅提高。而给药对比例3、4组的小鼠的生存率则没有明显地改善。

从上述结果可以看出，本发明实施例中涉及的各组低分子量肝素对于抑制Bleomycin诱导的肺纤维化小鼠的死亡有一定的作用，此外普通肝素也能够抑制此类小鼠的死亡。

表2实施例1中不同肝素及衍生物对Bleomycin诱导的小鼠肺纤维化生存率的影响

组别小鼠生存率(％)组别小鼠生存率(％)空白对照组100NS组100阴性对照组12.5N1组100I-2组100N2组87.5I-11组75N4组87.5III-1组100N5组75III-2组100N3组0I-16组25H组87.5

实验例2肺纤维化动物模型建立及肺纤维化药效学评价

如实验例1的步骤类似，只是将Bleomycin的剂量改为2.5mg/kg。C57BL/6小鼠(20-25g，8-12周龄)经1％Averdin(Sigma公司)麻醉固定后，乙醇消毒颈部皮肤，于颈中部做一长为左右的切口，纯性分离皮下组织，暴露气管，2.5mg/kg剂量于气管内注射Bleomycin(大连美仑生物)，注射后立即直立勾速旋转小鼠，使药物在肺内均匀分布，缝合颈部皮肤。在进行了上述处理后的当天开始给药，并将当天作为第1天，给药方案如下所述。

每隔一天向上述处理过的小鼠喷雾实施例1至9和对比例1、3-4组的肝素给药。除给药组之外，设置阴性控制组，该阴性控制组为按照与上述同样的方法处理的小鼠，每隔一天给予相同量的生理盐水作为阴性对照；设置阳性对照组，对正常小鼠每隔一天给予同样剂量的生理盐水建立模型，造模过程中不给予任何药物，该组以下有时也称为健康组，每组小鼠5只。喷雾给予上述各实施例和对比例组小鼠2mg/mL浓度的药物5mL，给药频次为隔天给药一次，并在给药之后的第15天猝死全部小鼠，取肺部组织。

采取与按照Cahill,Emer F.等人"Hepatocyte Growth Factor Is Required forMesenchymal Stromal Cell Protection Against Bleomycin-Induced PulmonaryFibrosis."Stem Cells Translational Medicine(2016):sctm-2015中描述的方法中相同的方法获得肺组织病理切片染色结果，如图1所示。

显示经过Bleomycin处理15天后，肺组织可见明显的纤维化改变(参见图1中的(a)图)，说明在实验例2中也获得了肺纤维化的小鼠。正常对照组小鼠肺组织表面光滑，具有较好的弹性，外观呈粉红色(参见图1中的(f)图)，阴性对照组肺组织呈现典型蜂窝状性状，呈纤维化病理特征。相比于阴性对照组，实施例1-9、对比例1组呈现基本完整的肺泡结构，大部分肺泡呈现单层细胞结构，细胞形态与正常组类似，无明显的炎性浸润性特征，说明纤维化程度也有不同程度的变轻趋势。而对比例3-4组则呈现了较强的纤维化趋势。

随后，精确称取湿重30～100mg的各小组的小鼠肺组织放入试管中，准确加水解液1ml，混匀。加盖后95℃或者沸水浴水解20分钟(水解10分钟时混匀一次使水解更充分)。然后调pH值至6.0～6.8左右。加蒸馏水至10ml，混匀；取3～4ml稀释的水解液加适量活性炭(约20～30mg左右，以上清液离心后澄清无色为准)，混匀，3500转/分离心10分钟，小心取上清1ml作为检测样品，然后采用购买自南京建成羟脯氨酸测定试剂盒来测定样品中羟脯氨酸的含量，并用以表征肺部中所含有的胶原蛋白的含量。

结果如表3所示。可以看出给药普通肝素的H组(对比例1组)、实施例1-9组均有效地降低了羟脯氨酸的含量，即有效地降低了肺部胶原蛋白的含量，表明给药肝素和实施例中得到的低分子量肝素均能缓解胶原蛋白的形成，证明纤维化程度减轻，而对比例3-4组则纤维化程度没有显著的变化。

表3不同肝素及衍生物对Bleomycin诱导的小鼠肺组织中羟脯氨酸含量的影响，结果表示为(结果±SD)

普遍认为胶原蛋白的沉积是纤维化病变最明显的特征。胶原蛋白-1(ColA-1)是最有特征性的胶原蛋白指标。因此，通过在转录水平上测定ColA-1能够预测胶原蛋白的沉积量，预测纤维化病变的发展。按照Yang等报道的方法(Yang D,Atkins G J,Turner A G,etal.Differential effects of 1,25-dihydroxyvitamin D on mineralisation anddifferentiation in two different types of osteoblast-like cultures[J].TheJournal of steroid biochemistry and molecular biology,2013,136:166-170.)对实验例2中获得的各组小鼠的肺部的胶原蛋白的mRNA进行定量测定，结果如表4所示，发现给药实施例1-9组，对比例1组可以有效地降低胶原蛋白的转化率，从而抑制了肺纤维化的发生。

表4不同肝素及衍生物对Bleomycin诱导的小鼠肺组织中胶原蛋白mRNA的影响，结果表示为(结果±SD)

组别胶原蛋白mRNA组别胶原蛋白mRNA阴性对照组20.04±6.30NS组10.75±1.77I-2组10.20±1.34N1组10.17±3.45I-11组12.27±2.57N2组7.24±2.34III-1组10.25±4.17N4组10.87±1.56III-2组7.72±1.63N5组7.36±5.67I-16组25.16±4.37N3组26.47±1.07H组10.77±3.22

根据上述实验例1和实验例2的结果显示尽管普通肝素，即未利用酶进行降解，或去抗凝活性并进行降解的肝素也有抑制肺纤维化的效果，但是普遍认为大分子量肝素具有明显的副作用，例如，增加出血的风险，容易诱发血小板减少症。而本发明涉及的低分子量肝素或去抗凝之后的低分子量肝素则不但具有抑制肺纤维化形成，提高小鼠的生存率的效果之外，其药物代谢可控，预计在临床不需要检测病人的出血风险。