一种蝉棒束孢及中药材蝉花的人工栽培方法

摘要

本发明提供了一种蝉棒束孢及中药材蝉花的人工栽培方法，该蝉棒束孢菌的保藏号CGMCC No 13684，将该菌株经斜面活化培养、种子培养和固体栽培培养步骤，可获得大量中药材蝉花孢梗束。本发明蝉棒束孢产孢子能力极强，提供的人工栽培方法简单易行，能获得与自然山林采集的中药材蝉花一样的孢梗束，有效解决了野生蝉花药材短缺的问题。

说明书

技术领域

本发明属于中药材栽培与生物工程技术领域，涉及一种人工分离的野生中药蝉花菌种蝉棒束孢，以及采用该菌种进行中药材蝉花的人工栽培方法。

背景技术

中药蝉花是麦角菌科真菌蝉拟青霉寄生竹蝉若虫后的复合体，是与冬虫夏草相类似的虫草；原产于横断山脉、天目山脉感染虫体为竹蝉的野生蝉花，称之为蝉花或大蝉草，主要产地在江苏、浙江一带。我国对蝉花的认识和利用历史源远流长，最早在南北朝雷斅的《雷公炮炙论》就有加工蝉花的记载，比冬草夏草的记载早了800年。宋朝苏颂的《图经本草》、宋姚宽《西溪丛语》和宋代唐慎微的《证类本草》，以及明朝李时珍的《本草纲目》及之后药典都有记载功效。新中国成立后，我国所编纂的众多本草或药典中《中华药物大全》和《中华药海》、《中药大辞典》、《中华本草》等典籍中，对蝉花的药用多有记载。这些中药典籍中记载的虫草只有两个，一个是冬虫夏草，一个是蝉花，而冬虫夏草因花小虫体大而俗称小虫草，蝉花因花大虫体小而被称为大虫草，现在市面上比较热销的蛹虫草也就是虫草花,在中药典籍中根本没有记载，只作为普通食品食用。近年来，随着冬虫夏草资源枯竭，人工栽培因模拟生长条件困难，至今未有成功，价格直线上升，限制了其使用。

在中药药性分类上，蝉花甘；寒；无毒，归肺、肝经，性凉，冬虫夏草甘，平。归肺、肾经，性温。现在常见的疾病如高血脂、高血压、糖尿病、肿瘤等，均为热病，比较而言，蝉花在这些疾病的治疗中要优于冬草夏草。因此，作为古籍中记载的唯一可以替代冬虫夏草的蝉花，有着积极的临床意义和广阔的市场价值，而成为国内外研究的热点。目前市场上对蝉花的需求量为每年400吨以上。然而，由于蝉花生长需要特定的生态环境和寄主昆虫，一年只能在梅雨季节有约20天采摘期，天然的蝉花非常稀少，全国野生蝉花每年的总产量一共只有25吨左右，这限制了蝉花大量使用。

目前，蝉花的人工培养主要分为二种形式：液体深层发酵获得的菌丝体和固体培养的蝉花子实体。蝉花菌丝体采用液体发酵方式完成的，一般只有3-4天左右完成，此法不依赖自然条件、生长周期短、污染少、产量较高，可较大批量生产。但因菌丝体和子实体在营养和药效成分上的明显差异，用菌丝体代替子实体应用存在天然缺陷。用作药材的蝉花必须有与野生蝉花外在形态、组织结构一致的孢梗束，这主要是采用生物固体发酵技术方法栽培，但现有的菌种在人工培养基上不易形成孢梗束，且存在孢子梗无分枝、孢子粉含量低、培养周期较长的缺点，因此栽培不易成功，无法药用。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的是提供一种人工分离的野生中药蝉花菌种蝉棒束孢，以及提供一种中药材蝉花的人工栽培方法。采用本发明方法能形成与野生蝉花外在形态、组织结构一致的孢梗束，有效解决了野生药材短缺的问题。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并探索，最终从江苏省句容天王镇磨盘山区采集野生蝉花中药材，经菌种分离鉴定获得了一株产孢子能力极强的蝉棒束孢菌，发明人将其命名为蝉棒束孢(Isaria cicadae)Y.R.L-3，同时于2017年2月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No 13684。

需要说明的是，本发明涉及的高产蝉棒束孢(Isaria cicadae)Y.R.L-3，具有如下特征和特性：

形态学特征：子实体呈黄褐色到褐色，外被大量白色粉状分生孢子，质地坚硬、脆。

生理特性：菌丝薄壁，透明，光滑，具分隔和分枝，宽1.6～3.7μm。分生孢子梗简单分枝，产孢瓶梗2～4个对生、侧生或在顶端轮生，基部编缩，中部膨大，上端突然变细。5.2～10.5×2.8～4.2μm分生孢子圆柱形，部分微弯，两头稍尖，薄壁，无色，4.4～11.5×1.8～3.9μm。

代谢特性：菌种在马铃薯葡萄糖培养基上生长较快，28℃黑暗条件下培养5天，菌落直径13～15mm，白色，绒状，隆起；菌落背面米色，无水溶性色素。

另外，本发明还提供了一种中药材蝉花的人工栽培方法，该方法包括将上述的蝉棒束孢(Isaria cicadae)Y.R.L-3经斜面活化培养、种子培养和固体栽培培养步骤，获得中药材蝉花孢梗束，其中固体栽培所用的培养基优选以大米作为基质。

进一步优选地，如上所述的中药材蝉花的人工栽培方法，其中的斜面活化培养步骤为：将蝉棒束孢(Isaria cicadae)Y.R.L-3菌种在无菌条件下转接到PDA培养基斜面试管中，在22℃-28℃下培养5-7天，挑选长势好的菌种保存备用。

进一步优选地，如上所述的中药材蝉花的人工栽培方法，其中的种子培养步骤为：将斜面活化培养步骤保存备用的菌种以无菌方式接种到液体PDA培养基中，在20℃-25℃下、振荡频率为110-150r/min的条件下、摇床用锥形瓶或种子罐中培养3-7天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后作为种子液备用。

进一步优选地，如上所述的中药材蝉花的人工栽培方法，其中的固体栽培培养步骤包括：将种子培养步骤得到的种子液接种到固体栽培用的培养基中，在20℃-25℃，相对湿度60％-80％的条件下培养30-50天获得中药材蝉花孢梗束。当培养物的孢梗束高度达3cm以上、表面有大量分生孢子出现、孢梗束弯曲时即可采收。

本发明通过试验摸索发现，固体栽培所用的培养基以大米作为基质易形成孢梗束，在此基础上，发明人进行了改进和优化，并获得了一种上述蝉棒束孢(Isaria cicadae)Y.R.L-3的固体栽培培养基配方，该培养基包含如下用量的组分：

进一步优选地，如上所述的蝉棒束孢(Isaria cicadae)Y.R.L-3的固体栽培培养基，其包含如下用量的组分：

再进一步优选地，如上所述的蝉棒束孢(Isaria cicadae)Y.R.L-3的固体栽培培养基，其由如下用量的组分配制而成：

试验中发现，本发明提供的蝉棒束孢(Isaria cicadae)Y.R.L-3在人工培养基上易形成孢梗束，产量大，因此本发明还提供该蝉棒束孢(Isaria cicadae)Y.R.L-3在制备蝉花孢梗束中的应用。另外，以大米作为人工培养基的主要基质，蝉棒束孢(Isaria cicadae)Y.R.L-3的产孢能力更高。因此，本发明还提供大米在制备蝉棒束孢(Isaria cicadae)Y.R.L-3的固体或液体栽培培养基中的应用；以及大米、蚕蛹粉和米糠或/和麸皮在制备蝉棒束孢(Isaria cicadae)Y.R.L-3的固体或液体栽培培养基中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的蝉棒束孢菌株具有产孢子能力强的优势，提供的人工栽培培养基与昆虫、大(小)麦等人工培养基相比，具有更高的产孢能力，更简洁的栽培与采收条件、更方便的原料获得途径、全程无菌，不容易感染杂菌，因而会获得纯净的蝉花孢梗束。另外，本方法简单易行，能获得与自然山林采集的中药材蝉花一样的孢梗束，极具市场推广价值。

附图说明

图1是人工蝉花栽培工艺流程图；

图2是野生(左)与人工(右)蝉花孢梗束图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

①PDA固体斜面制作：PDA培养基配比为每1000mL培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g，琼脂20g，将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000mL,煮沸20min，过滤，加入葡萄糖与琼脂(液体培养养基不加琼脂)，补足水至1000mL，加热溶解，然后分装至试管内，装量为试管长的1/4，塞上棉塞，置于灭菌锅内0.1MPa压力下灭菌30min，趁热将试管摆放在斜面板上冷却。

②斜面种制备：取冻干的专利保藏菌种，无菌操作在PDA液体培养基中活化，转管后，在22℃下培养3天，挑选长势好的备用；

③PDA锥形瓶种子液制备：每1000mL培养液：马铃薯200g、葡萄糖20g，将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000mL,煮沸30min，过滤，加入葡萄糖，补足水至1000mL，加热溶解，然后分装至锥形瓶内，装量为锥形瓶容量的60％，塞上棉塞，再用牛皮纸包裹，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，取出冷却至20℃以下。

④菌丝体收集：将上述PDA液体培养基在无菌条件下把备用的斜面种接入锥形瓶中，在22℃，振荡频率为100r/min的条件下培养，至锥形瓶内出现大量菌丝球后备用；

当培养物的菌丝球密度达10⁴个/mL以上时10000rpm离心，收获菌丝球，60℃烘干过夜，冷却后用薄膜袋真空包装，置于-20℃贮存。

⑤产量及性质检测：

本实施例中所得的培养产物为菌丝体(球)，产量为干重82.1g(含水率8％以下)/L液体培养基，其中腺苷含量29.1mg/g干重，即2.91％。

实施例2

①PDA固体斜面制作：PDA培养基配比为每1000mL培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g，琼脂20g，将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000mL,煮沸20min，过滤，加入葡萄糖与琼脂(液体培养养基不加琼脂)，补足水至1000mL，加热溶解，然后分装至试管内，装量为试管长的1/4，塞上棉塞，置于灭菌锅内0.1MPa压力下灭菌30min，趁热将试管摆放在斜面板上冷却。

②斜面种制备：取冻干的专利保藏菌种，无菌操作在PDA液体培养基中活化，转管后，在22℃下培养3天，挑选长势好的备用；

③PDA锥形瓶种子液制备：每1000mL培养液：马铃薯200g、葡萄糖20g，将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000mL,煮沸30min，过滤，加入葡萄糖，补足水至1000mL，加热溶解，然后分装至锥形瓶内，装量为锥形瓶容量的60％，塞上棉塞，再用牛皮纸包裹，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，取出冷却至20℃以下。

将上述PDA液体培养基在无菌条件下把备用的斜面种接入锥形瓶中，在22℃，振荡频率为100r/min的条件下培养5天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后备用；

④栽培：

(1)配制大米固体栽培培养基：将配好的培养基装入培养盒(培养盒规格：圆形直径9～10cm×高6～10cm)中，用透气封口膜封口；配比为大米基质10重量份，米糠2重量份，蚕蛹粉3重量份，磷酸二氢钾0.05重量份，蛋白胨0.3重量份，酵母粉0重量份，水为12重量份，将各原料按照比例混合均匀。

(2)灭菌：将培养盒放入灭菌锅中，于0.15MPa压力下灭菌30min；

(3)接种：在固体培养基冷却至20℃以下后，在无菌条件下接种，每300mL种子液接15只培养盒；

(4)栽培：接种后的培养盒移至培养室在20-25℃，相对湿度60-80％下培养30d-50d，且环境温度相较前期菌丝体生长阶段需低2-3℃，每天需适时通气，保持培养室内空气新鲜；

⑤采收：当培养物的孢梗束高度达3cm以上、表面有大量分生孢子出现、孢梗束弯曲时即可采收。采收时，去掉封口膜，用工具将培养物取出分离孢梗束，烘干分级，冷却后用薄膜袋真空包装，菌质置于-20℃贮存。

⑥产量及性质检测：

本实施例中所得的培养产物由孢梗束、分生孢子、菌丝体与固体培养基质组成，产量为孢梗束100-110g(含水率8％以下)/kg固体培养基。经药理学实验证明，本实施例中蝉棒束孢的培养产物具有改善肾功能的作用。

实施例3

①PDA固体斜面制作：PDA培养基配比为每1000mL培养基：马铃薯200g、葡萄糖10g，琼脂20g，将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000mL,煮沸50min，过滤，加入葡萄糖与琼脂，补足水至1000mL，加热溶解，然后分装至试管内，装量为试管长的1/4，塞上棉塞，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，趁热将试管摆放在斜面板上冷却。

②斜面种制备：取冻干的专利保藏菌种，无菌操作在PDA液体培养基中活化，转管后，在22℃下培养5天，挑选长势好的备用；

③PDA锥形瓶种子液制备：每1000mL培养液：马铃薯200g、葡萄糖20g，将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000mL,煮沸50min，过滤，加入葡萄糖，补足水至1000mL，加热溶解，然后分装至锥形瓶内，装量为锥形瓶容量的60％，塞上棉塞，再用牛皮纸包裹，置于灭菌锅内0.20MPa压力下灭菌30min，取出冷却至20℃以下。

将上述PDA液体培养基在无菌条件下把备用的斜面种接入锥形瓶中，在22℃，振荡频率为130r/min的条件下培养7天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后备用；

④栽培：

(1)配制大米固体栽培培养基，将配好的培养基装入培养盒(培养盒规格：圆形直径9～10cm×高6～10cm)中，用透气封口膜封口；配比为大米基质20重量份，麸皮4重量份，蚕蛹粉1重量份，磷酸二氢钾0重量份，蛋白胨1重量份，酵母粉2重量份，水为10重量份，将各原料按照比例混合均匀。

(2)灭菌：将培养盒放入灭菌锅中，于0.15MPa压力下灭菌30min；

(3)接种：在固体培养基冷却至20℃以下后，在无菌条件下接种，每300mL接20只培养盒；

(4)栽培：接种后的培养盒移至培养室在20-25℃，相对湿度60-80％下培养30d-50d，且环境温度相较前期菌丝体生长阶段需低2-3℃，每天需适时通气，保持培养室内空气新鲜；

⑤采收：当培养物的孢梗束高度达3cm以上、表面有大量分生孢子出现、孢梗束弯曲时即可采收。采收时，去掉封口膜，用工具将培养物取出分离孢梗束，烘干分级，冷却后用薄膜袋真空包装，菌质置于-20℃贮存。

⑥产量及性质检测：

本实施例中所得的培养产物由孢梗束、分生孢子、菌丝体与固体培养基质组成，产量为孢梗束90-100g(含水率8％以下)/kg固体培养基。

实施例4

②PDA固体斜面制作：PDA培养基配比为每1000mL培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g，琼脂20g，将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000mL,煮沸350min，过滤，加入葡萄糖与琼脂，补足水至1000mL，加热溶解，然后分装至试管内，装量为试管长的1/4，塞上棉塞，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，趁热将试管摆放在斜面板上冷却。

②斜面种制备：取冻干的专利保藏菌种，无菌操作在PDA液体培养基中活化，转管后，在22℃下培养5天，挑选长势好的备用；

③PDA锥形瓶种子液制备：每1000mL培养液：马铃薯200g、葡萄糖20g，将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000mL,煮沸30min，过滤，加入葡萄糖，补足水至1000mL，加热溶解，然后分装至锥形瓶内，装量为锥形瓶容量的60％，塞上棉塞，再用牛皮纸包裹，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，取出冷却至20℃以下。

将上述PDA液体培养基在无菌条件下把备用的斜面种接入锥形瓶中，在22℃，振荡频率为150r/min的条件下培养5天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后备用；

④10L种子罐培养

将7L PDA培养基装入lOL发酵罐(以70％容积计算)中，123℃灭菌30min后冷却至24℃，接入锥形瓶种子，接种量10％(下同)，控制发酵条件24℃,罐压0.01-0.05Mpa，空气流量约0.5m³/hr，发酵72hr。

⑤栽培：

(1)配制大米固体栽培培养基，将配好的培养基装入培养盒(培养盒规格：方形33cm×高6～10cm)中，用透气封口膜封口；配比为大米基质20重量份，米糠3重量份，蚕蛹粉2重量份，磷酸二氢钾0.01重量份，蛋白胨0重量份，酵母粉1重量份，水为16重量份，将各原料按照比例混合均匀。

(2)灭菌：将培养盒放入灭菌锅中，于0.15MPa压力下灭菌30min；

(3)接种：在固体培养基冷却至20℃以下后，在无菌条件下接种，每300mL接2只培养盒；

(4)栽培：接种后的培养盒移至培养室在25℃，相对湿度80％下培养50d，且环境温度相较前期菌丝体生长阶段需低2-3℃，每天需适时通气，保持培养室内空气新鲜；

⑥采收：当培养物的孢梗束高度达3cm以上、表面有大量分生孢子出现、孢梗束弯曲时即可采收。采收时，去掉封口膜，用工具将培养物取出分离孢梗束，烘干分级，冷却后用薄膜袋真空包装，菌质置于-20℃贮存，孢梗束-45℃贮存.

⑦产量及性质检测：

本实施例中所得的培养产物由孢梗束、分生孢子、菌丝体与固体培养基质组成，产量为孢梗束140-150g(含水率8％以下)/kg固体培养基。

实施例5

①PDA固体斜面制作：PDA培养基配比为每1000mL培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g，琼脂20g，将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000mL,煮沸20min，过滤，加入葡萄糖与琼脂(液体培养养基不加琼脂)，补足水至1000mL，加热溶解，然后分装至试管内，装量为试管长的1/4，塞上棉塞，置于灭菌锅内0.1MPa压力下灭菌30min，趁热将试管摆放在斜面板上冷却。

②斜面种制备：取冻干的专利保藏菌种，无菌操作在PDA液体培养基中活化，转管后，在22℃下培养3天，挑选长势好的备用；

③PDA锥形瓶种子液制备：每1000mL培养液：马铃薯200g、葡萄糖20g，将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000mL,煮沸30min，过滤，加入葡萄糖，补足水至1000mL，加热溶解，然后分装至锥形瓶内，装量为锥形瓶容量的60％，塞上棉塞，再用牛皮纸包裹，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，取出冷却至20℃以下。

将上述PDA液体培养基在无菌条件下把备用的斜面种接入锥形瓶中，在22℃，振荡频率为100r/min的条件下培养5天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后备用；

④栽培：

(1)配制大米固体栽培培养基：将配好的培养基装入培养盒(培养盒规格：圆形直径9～10cm×高6～10cm)中，用透气封口膜封口；配比为小麦基质10重量份，米糠2重量份，蚕蛹粉3重量份，磷酸二氢钾0.05重量份，蛋白胨0.3重量份，酵母粉0重量份，水为12重量份，将各原料按照比例混合均匀。

(2)灭菌：将培养盒放入灭菌锅中，于0.15MPa压力下灭菌30min；

(3)接种：在固体培养基冷却至20℃以下后，在无菌条件下接种，每300mL种子液接15只培养盒；

(4)栽培：接种后的培养盒移至培养室在20-25℃，相对湿度60-80％下培养30d-50d，且环境温度相较前期菌丝体生长阶段需低2-3℃，每天需适时通气，保持培养室内空气新鲜；

⑤采收：当培养物的孢梗束高度达3cm以上、表面有大量分生孢子出现、孢梗束弯曲时即可采收。采收时，去掉封口膜，用工具将培养物取出分离孢梗束，烘干分级，冷却后用薄膜袋真空包装，菌质置于-20℃贮存。

⑥产量及性质检测：

本实施例中所得的培养产物由孢梗束、分生孢子、菌丝体与固体培养基质组成，产量为孢梗束60-70g(含水率8％以下)/kg固体培养基。经药理学实验证明，本实施例中蝉棒束孢的培养产物具有改善肾功能的作用。

实施例6

①PDA固体斜面制作：PDA培养基配比为每1000mL培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g，琼脂20g，将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000mL,煮沸20min，过滤，加入葡萄糖与琼脂(液体培养养基不加琼脂)，补足水至1000mL，加热溶解，然后分装至试管内，装量为试管长的1/4，塞上棉塞，置于灭菌锅内0.1MPa压力下灭菌30min，趁热将试管摆放在斜面板上冷却。

②斜面种制备：取冻干的专利保藏菌种，无菌操作在PDA液体培养基中活化，转管后，在22℃下培养3天，挑选长势好的备用；

③PDA锥形瓶种子液制备：每1000mL培养液：马铃薯200g、葡萄糖20g，将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000mL,煮沸30min，过滤，加入葡萄糖，补足水至1000mL，加热溶解，然后分装至锥形瓶内，装量为锥形瓶容量的60％，塞上棉塞，再用牛皮纸包裹，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，取出冷却至20℃以下。

将上述PDA液体培养基在无菌条件下把备用的斜面种接入锥形瓶中，在22℃，振荡频率为100r/min的条件下培养5天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后备用；

④栽培：

(1)配制大麦固体栽培培养基：将配好的培养基装入培养盒(培养盒规格：圆形直径9～10cm×高6～10cm)中，用透气封口膜封口；配比为大麦基质10重量份，米糠2重量份，蚕蛹粉3重量份，磷酸二氢钾0.05重量份，蛋白胨0.3重量份，酵母粉0重量份，水为12重量份，将各原料按照比例混合均匀。

(2)灭菌：将培养盒放入灭菌锅中，于0.15MPa压力下灭菌30min；

(3)接种：在固体培养基冷却至20℃以下后，在无菌条件下接种，每300mL种子液接15只培养盒；

(4)栽培：接种后的培养盒移至培养室在20-25℃，相对湿度60-80％下培养30d-50d，且环境温度相较前期菌丝体生长阶段需低2-3℃，每天需适时通气，保持培养室内空气新鲜；

⑤采收：当培养物的孢梗束高度达3cm以上、表面有大量分生孢子出现、孢梗束弯曲时即可采收。采收时，去掉封口膜，用工具将培养物取出分离孢梗束，烘干分级，冷却后用薄膜袋真空包装，菌质置于-20℃贮存。

⑥产量及性质检测：

本实施例中所得的培养产物由孢梗束、分生孢子、菌丝体与固体培养基质组成，产量为孢梗束40-50g(含水率8％以下)/kg固体培养基。