DAS在制备预防/或治疗LPS/D-GalN诱导的急性免疫性肝损伤药物中的应用

摘要

本发明提供了二烯丙基一硫(DAS)在制备预防/或治疗LPS/D‑GalN诱导的急性免疫性肝损伤药物中的应用。经试验证明，二烯丙基一硫能够明显改善LPS/D‑GalN诱导的急性免疫性肝损伤出现的炎症细胞浸润、充血和坏死症状，具体的，低剂量的(50～100μmol/kg)的二烯丙基一硫并不会引起明显的肝脏损伤，却能够有效拮抗由LPS/D‑GalN所引起的转氨酶以及总胆红素的升高，且呈现一定的药物浓度效应关系，在肝组织细胞层面上，二烯丙基一硫能够明显改善炎症细胞浸润、充血和坏死，从而明显减轻LPS/D‑GalN所引起的肝细胞损伤。

说明书

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及二烯丙基一硫(DAS)在制备预防/或治疗LPS/D-GalN诱导的急性免疫性肝损伤药物中的应用。

背景技术

急性爆发性肝炎是一种可以由病毒、外源化学物等引发的严重临床病症，且具有较高的死亡率，目前除肝移植以外无有效的预防或治疗手段。

病毒诱发的肝损伤，其发病的机理与机体免疫功能的紊乱有关，在实验研究中常用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)与氨基半乳糖(D-Galactosamine，D-GalN)联合诱发实验动物的急性免疫性肝损伤以模拟与病毒性肝炎的相似的临床病理症状，并通过该模型进一步开发研究对急性免疫性肝损伤具有保护作用的药用成分。

现代研究发现许多由动植物中提取的多种生物活性成分对于急性肝炎具有一定的预防及预防作用。二烯丙基一硫(Diallyl sulfide，DAS)是由大蒜中提取的一种有效生物活性成分，研究显示DAS具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抑制体内多种代谢酶类等多种生物学作用。而且与同样由大蒜中提取的二烯丙基二硫和二烯丙基三硫相比其毒性更低、结构更为简单，因此具有更加广泛的应用前景。目前已有研究显示DAS对于外源化合物、药物、酒精等所引起的急性肝脏损伤具有一定的预防保护作用，但是迄今为止尚未有报道显示DAS对于LPS/D-GalN所引起的急性免疫性肝脏损伤的保护作用。

发明内容

针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，意外发现二烯丙基一硫能够有效拮抗由LPS/D-GalN所引起的转氨酶以及总胆红素的升高，明显减轻肝组织细胞的炎症细胞浸润、充血和坏死，从而对于LPS/D-GalN诱导的急性免疫性肝脏损伤具有良好的预防和治疗作用。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了二烯丙基一硫在制备预防/或治疗急性免疫性肝损伤药物中的应用；

进一步的，所述急性免疫性肝损伤由LPS/D-GalN诱导引发所致；

经试验验证，二烯丙基一硫能够有效抑制LPS/D-GalN诱导的急性免疫性肝损伤中出现的转氨酶以及总胆红素的升高，明显减轻肝组织细胞的炎症细胞浸润、充血和坏死症状；

本发明的另一个方面，提供一种预防/或治疗急性免疫性肝损伤的药物；所述药物包括二烯丙基一硫；

进一步的，所述急性免疫性肝损伤由LPS/D-GalN诱导引发所致；

所述药物用药有效浓度为50μmol/kg及以上，进一步优选为100μmol/kg；

优选的，所述药物还包含一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。所用辅料可为固态或液态。固态形式的制剂包括粉剂、片剂、分散颗粒、胶囊、药丸及栓剂。粉剂及片剂可包含约0.1％至约99.9％的活性成分。适当的固体辅料可以是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或者乳糖。片剂、粉剂、药丸及胶囊为适于口服用的固态剂型。液态形式的制剂包括溶液、悬浮液及乳液，其实施例为非经肠注射用水溶液或水-丙二醇溶液，或添加甜味剂及造影剂的口服溶液。此外，还可制成注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液；

优选的，所述药物组合物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂；

进一步优选的，所述药物组合物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

本发明有益效果：

免疫性肝损伤通常是由生物性因素等引起，常见的原因为病毒感染，如临床上乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等病毒的感染，目前针对其致病机理尚未完全明晰，其最重要的特征即为肝组织内大量的炎症细胞浸润，炎症因子表达量的迅速升高，产生免疫/炎症应答，并进一步活化体内白细胞介素家族、肿瘤坏死因子家族以及趋化因子家族，以上级联反应共同导致体内炎症因子风暴，进而介导了以免疫反应为基础的肝损伤。

本发明首次发现二烯丙基一硫能够明显改善LPS/D-GalN诱导的急性免疫性肝损伤出现的炎症细胞浸润、充血和坏死症状，具体的，低剂量的(50～100μmol/kg)的二烯丙基一硫并不会引起明显的肝脏损伤，却能够有效拮抗由LPS/D-GalN所引起的转氨酶以及总胆红素的升高，且呈现一定的药物浓度效应关系，在肝组织细胞层面上，二烯丙基一硫能够明显改善炎症细胞浸润、充血和坏死，从而明显减轻LPS/D-GalN所引起的肝细胞损伤。

我们的研究表明二烯丙基一硫具有预防/或治疗LPS/D-GalN诱导的急性免疫性肝损伤的能力。我们的研究有助于更好地理解出现以上结果的机制，在LPS/D-GalN引起的组织损伤方面具有重要的临床应用价值，同时为二烯丙基一硫及其他临床上安全的大蒜生物活性成分开辟了新的药物用途。

附图说明

图1为对照组、DAS对照组、LPS/D-GalN模型组、50μmol/kg DAS组和100μmol/kgDAS组中小鼠肝脏HE染色病理结果图(HE×200)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的一种典型实施方式中，提供了二烯丙基一硫在制备预防/或治疗急性免疫性肝损伤药物中的应用；

本发明的又一典型实施方式中，所述急性免疫性肝损伤由LPS/D-GalN诱导引发所致；

本发明的又一典型实施方式中，提供一种预防/或治疗急性免疫性肝损伤的药物；所述药物包括二烯丙基一硫；

本发明的又一典型实施方式中，所述急性免疫性肝损伤由LPS/D-GalN诱导引发所致；

所述药物用药有效浓度为50μmol/kg及以上，进一步优选为100μmol/kg；

本发明的又一典型实施方式中，所述药物还包含一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。所用辅料可为固态或液态。固态形式的制剂包括粉剂、片剂、分散颗粒、胶囊、药丸及栓剂。粉剂及片剂可包含约0.1％至约99.9％的活性成分。适当的固体辅料可以是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或者乳糖。片剂、粉剂、药丸及胶囊为适于口服用的固态剂型。液态形式的制剂包括溶液、悬浮液及乳液，其实施例为非经肠注射用水溶液或水-丙二醇溶液，或添加甜味剂及造影剂的口服溶液。此外，还可制成注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液；

本发明的又一典型实施方式中，所述药物组合物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂；

本发明的又一典型实施方式中，所述药物组合物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

下面通过实施例，对本发明的操作，作进一步具体的说明。

实施例

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂及仪器

DAS购自Sigma(W204218)，LPS购自Sigma(L2630)，D-GalN购自阿拉丁(G115553),ALT、AST、TBIL试剂盒购自宁波美康生物科技股份有限公司，玉米油由市场购买，HE染色液购自碧云天公司，无水乙醇、二甲苯购自天津市富宇精细化工有限公司。贝克曼AU480全自动生化分析仪，多功能冰冻水平离心机(Heraeu Biofuge Stratos)，移液器(Eppendorf)，EC350-1组织包埋机(Microm)，HM 325石蜡切片机(Thermo)，QP切片漂烘温控仪，Milli-Q超纯水系统，光学显微镜(Olympus)。

1.2方法

1.2.1实验动物分组与处理

雄性ICR小鼠75只，体重18～22g，购自济南朋悦实验动物繁育有限责任公司，实验动物生产许可证号为SCXK(鲁)20140007,实验动物使用许可证号为SYXK(鲁)20130001。适应性喂养3d后将动物随机分为5组，分别为对照组、DAS对照组、LPS/D-GalN模型组、50μmol/kgDAS预防组、100μmol/kg DAS预防组，每组15只动物。采用10μg/kg LPS联合500mg/kg D-GalN以10ml/kg体积溶于PBS中腹腔注射构建急性肝损伤模型，其中在LPS/D-GalN给予1h前以20ml/kg体积将DAS溶于玉米油中按50μmol/kg、100μmol/kg灌胃。对照组给予等体积的玉米油，DAS对照组按100μmol/kg剂量溶于玉米油中以等体积灌胃给予。在LPS/D-GalN染毒8h后麻醉小鼠，内眦静脉取血，以3000r/min离心15min分离血清，快速脱颈处死小鼠取肝脏并称重计算肝脏系数(肝重/体重×100％)，取肝左叶置于福尔马林中固定用于制作病理切片。

1.2.2血生化及肝脏病理检测

使用贝克曼AU480全自动生化分析仪测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)水平。取固定好的肝脏石蜡包埋后使用石蜡切片机组织切片，HE染色，显微镜下观察肝脏组织病理变化。

1.3统计学处理

实验数据以表示，使用SPSS 20软件进行方差齐性、One-way ANOVA分析，并进行LSD两两比较,以p<0.05认为具有显著统计学差异。

2结果

2.1动物肝脏系数及血生化结果

结果(表1)显示，DAS对照组血清中ALT、AST、TBIL水平与对照组相比无显著统计学差异(p>0.05),说明在此剂量下的DAS不会引起明显的肝脏损伤。LPS/D-GalN模型组血清中ALT、AST、TBIL(总胆红素)水平与对照组相比显著升高(p<0.05)，说明模型建立成功；与模型组相比DAS预防性给予能够拮抗由LPS/D-GalN所引起的转氨酶以及总胆红素的升高(p<0.05)，说明DAS对于LPS/D-GalN引起的急性肝脏损伤具有保护作用。

表1各组动物肝脏系数及血清中转氨酶和总胆红素结果比较

对照组相比，*p<0.05；与LPS/D-GalN模型组相比，#p<0.05。

2.2肝脏病理结果

如图1各组小鼠肝脏HE染色病理结果显示，对照组肝细胞形态完好，细胞之间界限清楚，细胞核明显，结构清晰，肝小叶内细胞排列整齐，无坏死、变性及炎症细胞浸润；DAS对照组肝脏结构形态与对照组相似，但有轻微的水肿；LPS/D-GalN模型组肝细胞核变小甚至消失，肝细胞明显水肿，细胞间界限模糊，肝小叶结构杂乱，出现大嗜酸性变、炎症细胞浸润且肝窦内充血明显，与模型组相比在DAS的干预下可明显减轻LPS/D-GalN所引起的肝细胞损伤，具体表现为肝小叶内肝细胞排列整齐，细胞核明显，未见明显的坏死灶。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。