人亨廷顿基因敲入用重组载体及其构建方法和在模型猪构建中的应用

摘要

本发明公开了一种人亨廷顿基因敲入用重组载体及其构建方法和在模型猪构建中的应用。本发明首次通过定点基因敲入人突变的亨廷顿外显子基因，且首次利用CRISPR/Cas9技术定点敲入致病基因，通过优化sgRNA，优化供体载体，提高了基因敲入阳性克隆细胞的概率，与猪体细胞核移植技术结合提高了直接获得阳性的基因敲入猪的概率，获得了人亨廷顿疾病基因敲入的小型猪，证明该方法用于构建基因修饰猪的高效可行性。本发明构建的亨廷顿基因敲入模型猪可产生典型的呼吸障碍、运动障碍等与人类亨廷顿疾病相类似的行为学特征并能进行稳定的可遗传的传代，为人类研究亨廷顿疾病提供可靠的模型，并能够确保数量以能用于药物筛选，以及基因治疗干细胞治疗等，可以成为人类良好的疾病模型。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种人亨廷顿基因敲入用重组载体及其构建方法和在模型猪构建中的应用。

背景技术

亨廷顿疾病(Hutington Diseases，HD)是由携带大于37个多聚谷氨酸重复的N末端片段在核内形成包涵体和神经纤维的聚集所产生的(Gusella et al.,Archives ofneurology,1993；Vonsattel et al.,Journal of neuropathology and experimentalneurology 1998)，由位于第四号染色体短臂上的亨廷顿基因(Huntingtin,Htt)发生突变所导致的常染色体显性遗传病，主要表现为变异蛋白在脑神经细胞内累积并造成神经细胞死亡。亨廷顿疾病的发病原因十分清晰，当HTT基因含有37个以上的谷氨酰胺序列时，突变的亨廷顿蛋白便发生错误折叠，在神经元内形成包涵体聚集导致神经元死亡，从而使人产生运动和认知功能障碍。

由于直接对病人进行实验往往受到实验材料及伦理方面的限制，所以制作一个与人类生理功能基本相似的亨廷顿疾病模型，对研究人类亨廷顿及其他神经退行性疾病具有重要的意义，有助于揭示由聚集物和错误折叠蛋白所产生的包涵体形成的机制。现阶段的亨廷顿疾病动物模型主要为果蝇、斑马鱼、小鼠和大鼠等小动物模型，无法真实地反应人类亨廷顿疾病的症状。与这些动物模型相比，猪在进化上与人类更为接近，例如神经、消化系统、皮肤、骨骼发育以及代谢等极其相似于人相比于大鼠、小鼠的无脑沟和脑回；猪的大脑结构有脑沟和脑回，且容量等与人类大脑非常相似；并且猪的基因表达、疾病的发生发展更与人类相似。因此，猪可以作为一种理想的亨廷顿疾病动物模型。

转入变异Huntintin基因的猪中，新生小猪与正常猪比较往往很弱小而且体重增加缓慢，在出生后不久便发生死亡，因此不能很好的模拟人在中年后才发病的神经退行性疾病的症状。经过分析，这是由于基因的多拷贝整合或Huntintin变异蛋白的过度表达导致大动物出生后的立即死亡。

传统基因敲入模型常利用小鼠干细胞同源重组的方法获得，而该传统方法用于猪成纤维细胞所获得基因敲入的概率非常低，只有10^-6而且周期长至6个月到一年。而利用诱导多潜能干细胞(ips)进行基因敲除或敲入仍然存在技术上的难题，通常，耗时、耗力并且价格昂贵。近年来，人工核酸内切酶(Engineered>

Cas9核酸内切酶来源于细菌的CRISPR/Cas9系统，RNA介导的CRISPR-相关的Cas9酶可以通过特定的20碱基对靶向序列进行识别剪切。2013年初，MIT的Feng Zhang研究组首次报道利用CRISPR/Cas9系统对人293T细胞的EMX1和PVALB基因以及小鼠Nero2A细胞的Th基因实现了定点突变(Cong et al.,Science,2013)。将编码Cas9的mRNA和特定sgRNA注射到单细胞斑马鱼胚胎内，10个切割位点中有8个位点都发生了切割(Hruscha et al.,Development,2013)，且其效果远远地高于TALEN，将Cas9RNA和sgRNA注射入胚胎中并未检测到其毒性。因此，利用Cas9技术来进行基因打靶基因修饰是一种高效、方便、快捷的手段。目前Cas9技术已经广泛地应用于小鼠细胞、小鼠(Shen et al.,Cell Res,2013；Wang etal.,Cell,2013)、大鼠(Ma et al.,Cell Res,2014)、人类多种细胞系等动物中，并且通过技术改善得到了非常低的脱靶效率。Tang等通过将Cas9mRNA和sgRNA注入到受精卵的胞质中，直接获得敲除vWF基因猪的血友病模型(Hai et al.,Cell Res,2014)。Zhou等利用Cas9通过体细胞核移植的方式通过敲除版纳小型猪(黑色的)上的酪氨酸酶TYR^-/-成功的获得了白化病模型的并且没有嵌合的模型猪，通过PARK2^-/-/PINK1^-/-双敲除基因猪获得了帕金森疾病模型猪(Zhou>

发明内容

基于此，有必要提供一种基因敲入效率高并可稳定传代的人亨廷顿基因敲入用重组载体及其构建方法和在模型猪构建中的应用。

一种人亨廷顿基因敲入用的重组载体，所述重组载体中插入有敲入片段，所述敲入片段包括人突变的亨廷顿基因片段以及分别位于所述人突变的亨廷顿基因片段的上游和下游的与小型猪的亨廷顿基因同源的同源臂，所述人突变的亨廷顿基因片段为含人亨廷顿基因第一外显子中CAG重复序列突变的序列片段。

在其中一个实施例中，所述人突变的亨廷顿基因片段中的CAG重复序列的数量超过36个，优选为150个，更优选人突变的亨廷顿基因片段的序列如SEQ ID No.13所示。

一种重组载体的构建方法，包括如下步骤：构建含有人突变的亨廷顿基因片段的敲入片段，所述人突变的亨廷顿基因片段为含人亨廷顿基因第一外显子中CAG重复序列突变的序列片段，且在该敲入片段中，所述人突变的亨廷顿基因片段的上游和下游分别连接有与小型猪的亨廷顿基因同源的同源臂，将所述敲入片段连接至载体上，得到所述重组载体。

在其中一个实施例中，所述将所述敲入片段连接至载体上还包括如下步骤：以序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的DNA片段为上、下游引物，以小型猪的基因组DNA为模板扩增得到小型猪的两条同源臂以及位于该两条同源臂中间的猪亨廷顿基因第一外显子片段，将该扩增产物经EcoRI和KpnI酶切后连接至经同样内切酶切割制得的pBluescriptKS(-)载体上，形成pBS-HD质粒，然后将所述人突变的亨廷顿基因片段插入该两条同源臂的中间替换猪亨廷顿基因第一外显子片段，得到pBS-HD-KI重组载体。

在其中一个实施例中，所述将所述人突变的亨廷顿基因片段插入该两条同源臂的中间替换猪亨廷顿基因第一外显子片段包括如下步骤：

以人突变的亨廷顿基因片段为模版，并在其两端设计NcoI和ApaI酶切位点，PCR扩增出连接有酶切位点的人突变的亨廷顿基因片段；

将pBS-HD质粒与接有酶切位点的人突变的亨廷顿基因片段分别进行NcoI和ApaI双酶切；

利用T4DNA连接酶将人突变的亨廷顿基因片段连接至pBS-HD质粒中，得到所述pBS-HD-KI重组载体。

一种人亨廷顿基因敲入模型猪的重构卵的构建方法，包括如下步骤：

步骤一：针对小型猪的亨廷顿基因的第一外显子后的内含子序列满足G(N)₁₆NGG序列模式的正链序列部分分别设计两个序列分别如SEQ>16一致，N为A、T、C或G，下标16表示N的个数；

步骤二：分别对所述第一sgRNA识别序列和第二sgRNA识别序列设计互补序列，所述第一sgRNA识别序列及其互补序列构成第一双链DNA，所述第二sgRNA识别序列及其互补序列构成第二双链DNA；

步骤三：分别根据所述第一双链DNA和所述第二双链DNA设计sgRNA转录载体，记为第一sgRNA载体和第二sgRNA载体，其中，所述第一sgRNA载体中含有所述第一双链DNA，所述第二sgRNA载体中含有所述第二双链DNA；

步骤四：将第一sgRNA载体、第二sgRNA载体、供体载体以及含有Cas9切口酶基因的载体共转染小型猪的成纤维细胞，筛选出人亨廷顿基因敲入的阳性单细胞克隆，所述供体载体为上述任一实施例所述的人亨廷顿基因敲入用的重组载体，或者所述供体载体采用上述任一实施例所述的重组载体的构建方法构建得到；

步骤五：将所述阳性单细胞克隆消化成单个细胞，注射入小型猪的去核卵母细胞中，形成重构卵。

在其中一个实施例中，在所述步骤三中，所述第一sgRNA载体和第二sgRNA载体均为U6启动子启动的转录载体。

在其中一个实施例中，在所述步骤四中，所述共转染是使用电转染的方法，电转染的参数：1400V、10ms、1pulse。

在其中一个实施例中，在所述步骤四中，共转染之后的小型猪的成纤维细胞是培养在添加有浓度为25μg/ml的维生素C的培养基中。

一种采用上述任一实施例所述的人亨廷顿基因敲入模型猪的重构卵的构建方法构建得到的重构卵。

一种人基因敲入模型猪的构建方法，包括如下步骤：

按照上述任一实施例所述的人亨廷顿基因敲入模型猪的重构卵的构建方法构建重构卵；

对所述重构卵进行细胞融合和激活，得到激活的重构卵；

将所述激活的重构卵至于代孕母猪的输卵管中，或者将所述激活的重构卵在体外进行培养，形成重构胚，然后再将所述重构胚移植到代孕母猪的子宫内；

饲养所述代孕母猪，产生人亨廷顿基因敲入模型猪。

在其中一个实施例中，所述对所述重构卵进行细胞融合和激活，得到激活的重构卵，具体包括如下步骤：

将所述重构卵从去核操作液中转至胚胎培养液中待融合与激活；

将所述重构卵转移至融合液激活液进行平衡，将平衡好的重构卵移入融合容器内，轻轻拨动重构卵，使卵母细胞与注入的细胞的接触面平行于两条电极，两条电极之间间隔为1mm，然后进行电脉冲刺激，电融合参数为：120volts/mm、30μs、2次；

电脉冲刺激后将重构卵移入胚胎操作液中，筛选出融合成功的重构卵。

上述人亨廷顿基因敲入用重组载体及其构建方法、模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法，首次通过定点基因敲入人突变的亨廷顿第一外显子基因(HTT基因)，且首次利用CRISPR/Cas9技术定点敲入致病基因，通过优化sgRNA，优化供体载体，提高了基因敲入阳性克隆细胞的概率，与猪体细胞核移植技术结合提高了直接获得阳性的基因敲入猪的概率，获得了人亨廷顿疾病基因敲入的小型猪，证明该方法用于构建基因修饰猪的高效可行性。因亨廷顿疾病为单基因常染色体显性遗传病，致病基因单一且典型，并且所获得的亨廷顿基因敲入模型猪表现出典型地亨廷顿病理及行为学特征，最为重要的是亨廷顿基因敲入模型猪可进行稳定的可遗传的传代，可为人类研究亨廷顿疾病提供可靠的模型，并能够确保数量以能用于药物筛选，以及基因治疗干细胞治疗等，可以成为人类良好的疾病模型动物。

附图说明

图1为一实施例的人亨廷顿基因敲入模型猪的构建方法原理示意图；

图2为阳性基因敲入成纤维细胞PCR鉴定图以及体细胞核移植怀孕率结果；

图3为怀孕猪生产后阳性基因敲入猪的检测及观察结果；

图4为KI猪与WT猪的形体、运动能力、生存曲线及体重变化结果；

图5为突变的HD基因敲入猪蛋白表达结果图；

图6为突变的亨廷顿基因敲入猪的遗传结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

如图1所示，一实施方式的人亨廷顿基因敲入模型猪的构建方法，包括如下步骤：

步骤S110：针对小型猪的亨廷顿基因的第一外显子(Exon 1)后的内含子序列满足G(N)₁₆NGG序列模式的正链序列部分分别设计两个不同的sgRNA的识别序列，分别记为第一sgRNA识别序列(sgRNA-1)和第二sgRNA(sgRNA-2)识别序列，第一sgRNA识别序列和第二sgRNA识别序列均与相应内含子正链序列G(N)₁₆一致，N为A、T、C或G，下标16表示N的个数。

小型猪即minipig(Sus scrofa，HTT Gene ID：397014)，可以是但不限于如中国广西融水小型猪。

在本实施方式中，第一sgRNA识别序列(GCACCGACCGTGAGTGC)如SEQ ID No.1所示，第二sgRNA识别序列(GCGGTGACGTCATGCCT)如SEQ ID No.2所示。内含子正链上满足G(N)₁₆NGG序列模式的序列分别如SEQ>

步骤S120：分别对第一sgRNA识别序列和第二sgRNA识别序列设计互补序列，第一sgRNA识别序列及其互补序列构成第一双链DNA，第二sgRNA识别序列及其互补序列构成第二双链DNA。

具体在本实施方式中，第一双链DNA和第二双链DNA的构建过程包括如下步骤：

分别对第一sgRNA识别序列和第二sgRNA识别序列设计互补序列；

在第一sgRNA识别序列的5’端加上ATA，3’端加上GT序列片段，形成如SEQ ID No.9所示的序列片段(ATA GCACCGACCGTGAGTGC GT)，并在第一sgRNA识别序列的互补序列的5’端加上TAAAAC序列片段，形成如SEQ ID No.10所示的序列片段(TAAAACGCACTCACGGTCGGTGC)，将加有粘性末端的第一sgRNA识别序列及加有粘性末端的其互补序列进行退火处理即得到带有粘性末端的第一双链DNA；

在第二sgRNA识别序列的5’端加上ATA，3’端加上GT序列片段，形成如SEQ IDNo.11所示的序列片段(ATA GCGGTGACGTCATGCCT GT)，并在第二sgRNA识别序列的互补序列的5’端加上TAAAAC序列片段，形成如SEQ ID No.12所示的序列片段(TAAAACAGGCATGACGTCACCGC)，将加有粘性末端的第二sgRNA识别序列及加有粘性末端的其互补序列进行退火处理，得到带有粘性末端的第二双链DNA。

形成的第一双链DNA与第二双链DNA的粘性末端，可用于连接至相应的转录载体上。

步骤S130：分别根据第一双链DNA和第二双链DNA设计sgRNA转录载体，记为第一sgRNA载体和第二sgRNA载体，其中，第一sgRNA载体中含有第一双链DNA，第二sgRNA载体中含有第二双链DNA。

本步骤是将第一双链DNA和第二双链DNA对应连接到含有sgRNA编码序列的质粒中，如连接在含有U6启动子的质粒载体，该过程具体可以包括如下步骤：在含有sgRNA编码序列的质粒载体中引入相应的酶切位点，如BbsI酶切位点，得到中间体质粒，再将第一双链DNA和第二双链DNA通过引入的酶切位点(即粘性末端)连接到酶切后的中间体质粒的对应位置得到所需的质粒。其中，酶切位点可以但不限于BbsI酶切位点，当酶切位点为BbsI酶切位点时，该第一双链DNA与该第二双链DNA均连接有上述粘性末端，且克隆载体经BbsI酶切处理。

步骤S140：构建含有人突变的亨廷顿基因片段的敲入片段，该人突变的亨廷顿基因片段为含人亨廷顿基因第一外显子中CAG重复序列突变的序列片段，且在该敲入片段中，人突变的亨廷顿基因片段的上游和下游分别连接有与小型猪的亨廷顿基因同源的同源臂，将敲入片段连接至载体上，得到的重组载体作为供体载体。

在一个实施例中，具体是以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列的DNA片段为上、下游引物，以小型猪的基因组DNA为模板扩增得到小型猪的两条同源臂以及位于该两条同源臂中间的猪亨廷顿基因第一外显子片段，将该扩增产物经EcoRI和KpnI酶切后连接至经同样内切酶切割的pBluescript KS(-)载体上，形成pBS-HD质粒，然后将人突变的亨廷顿基因片段插入该两条同源臂的中间替换猪亨廷顿基因第一外显子片段，得到pBS-HD-KI重组载体。在其他实施例中，不限于使用pBluescript KS(-)载体。

更具体地，人突变的亨廷顿基因片段为人亨廷顿基因第一外显子中CAG重复序列数量大于36个的突变的序列片段，将人突变的亨廷顿基因片段插入该两条同源臂的中间替换猪亨廷顿基因第一外显子片段包括如下步骤：

以人突变的亨廷顿基因片段为模版，并在其两端设计NcoI和ApaI酶切位点，PCR扩增出连接有酶切位点的人突变的亨廷顿基因片段；

将pBS-HD质粒与接有酶切位点的人突变的亨廷顿基因片段分别进行NcoI和ApaI双酶切；

利用T4DNA连接酶等将人突变的亨廷顿基因片段连接至pBS-HD质粒中，得到所述pBS-HD-KI重组载体。

本实施方式所述的人突变的亨廷顿基因片段中的CAG重复序列的数量超过36个，优选为150个，更优选人突变的亨廷顿基因片段的序列如SEQ ID No.13所示。

步骤S150：将第一sgRNA载体、第二sgRNA载体、供体载体以及含有Cas9切口酶基因的载体共转染小型猪的成纤维细胞，筛选出人亨廷顿基因敲入的阳性单细胞克隆。

所述含有Cas9切口酶基因的载体可以是但不限于为含有CMV-Cas9-neo基因的载体。

在本步骤中，共转染是使用电转染的方法，电转染的参数：1400V、10ms、1pulse。

进一步，在本步骤中，共转染之后的小型猪的成纤维细胞是培养在添加有浓度为25μg/ml的维生素C的培养基中。

筛选出人亨廷顿基因敲入的阳性单细胞克隆包括如下步骤：

对部分培养的克隆细胞进行裂解，提取裂解液；

对裂解液进行PCR处理，其中，PCR的引物序列分别如SEQ ID No.5(5’-GGAGAGCTGGGAGAGAATGCCAGTGTGACAGT-3’)及SEQ ID No.6(5’-GCGGCTGAGGCAGCAGCGGCTGTGCCTG-3’)所示，PCR条件为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸90秒，共30个循环；最后72℃延伸2分钟；

取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测和/或测序分析，挑选阳性克隆细胞。

此外，在本实施方式中，在将第一sgRNA载体、第二sgRNA载体、供体载体以及含有Cas9切口酶基因的载体共转染进成纤维细胞之前，还包括分别对第一sgRNA载体、第二sgRNA载体、供体载体以及含有Cas9切口酶基因的载体经转化处理后扩大培养，再分别提取第一sgRNA载体、第二sgRNA载体、供体载体以及含有Cas9切口酶基因的载体的步骤。

步骤S160：将阳性单细胞克隆消化成单个细胞，注射入小型猪的去核卵母细胞中，形成重构卵。

具体在本实施方式中，可以采用如下步骤进行：

将阳性克隆细胞使用胰蛋白酶进行消化之后进行离心处理，弃上清，重悬细胞；

在去核操作液中对卵母细胞用盲吸法去核后，吸取上步重悬的细胞直接注射于去核的卵母细胞的卵周隙中，轻轻挤压卵母细胞，使卵母细胞的细胞膜与注入的细胞的细胞膜接触。

步骤S170：对重构卵进行细胞融合和激活，得到激活的重构卵。

具体地，所述对重构卵进行细胞融合和激活，得到激活的重构卵，具体包括如下步骤：

将重构卵从去核操作液中转至胚胎培养液中待融合与激活；

将重构卵转移至融合液激活液进行平衡，将平衡好的重构卵移入融合容器内，轻轻拨动重构卵，使卵母细胞与注入的细胞的接触面平行于两条电极，两条电极之间间隔为1mm，然后进行电脉冲刺激，电融合参数为：120volts/mm、30μs、2次；

电脉冲刺激后将重构卵移入胚胎操作液中，筛选出融合成功的重构卵。

步骤S180：将激活的重构卵至于代孕母猪的输卵管中，或者将激活的重构卵在体外进行培养，形成重构胚，然后再将重构胚移植到代孕母猪的子宫内，饲养代孕母猪，产生人亨廷顿基因敲入模型猪。

进一步，还可以包括对人亨廷顿基因敲入模型猪的鉴定步骤：以从代孕母猪生产的猪仔的组织获取的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列的DNA片段为上、下游引物进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和/或测序检测，PCR条件为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸90秒，共30个循环；最后72℃延伸2分钟。

上述人类亨廷顿基因敲入模型猪的构建方法，首次通过定点基因敲入人突变的亨廷顿第一外显子基因(HTT基因)，且首次利用CRISPR/Cas9技术定点敲入致病基因，通过优化sgRNA序列，优化供体同源重组质粒，优化转染时细胞比例，以及在细胞筛选过程中加入维生素C，提高了基因敲入阳性克隆细胞的概率，与猪体细胞核移植技术结合提高了直接获得阳性的基因敲入模型猪的概率，获得了亨廷顿疾病基因敲入小型猪，证明该方法用于构建基因修饰猪的高效可行性。因为亨廷顿疾病为单基因常染色体显性遗传病，致病基因单一且典型，并且所获得的HD基因敲入模型猪表现出典型地亨廷顿病理及行为学特征，最为重要的是HD基因敲入模型猪可进行稳定的可遗传的传代，可为人类研究亨廷顿疾病提供可靠的模型，确保了数量并能用于药物筛选，以及基因治疗干细胞治疗等，可以成为人类良好的疾病模型动物。

以下为具体实施例部分。

材料：细胞：广西融水小型猪原代成纤维细胞。

动物：所有的实验动物均按照中国科学院广州生物医药与健康研究院标准和要求进行操作，遵守动物伦理道德。本实验所采用的是小型猪，因其体形较小，更接近于人类，便于操作及行为学测定。

猪卵巢：购自屠宰场。

菌株：Top10感受态细胞(北京天根生化科技公司)

其它试剂，除非特别说明，均购自Sigma公司，括弧后面为对应的中文名称和/或商品目录号。

(1)CRISPR/Cas9打靶系统的构建：

根据NCBI数据库中小型猪的HTT基因的序列(Gene ID：397014)，以内含子序列按照G(N)₁₆NGG原则，分别对第一外显子(exon1)后的内含子正链(部分序列如SEQ>

提取用于待转染细胞的基因组，在sgRNA的识别序列识别的靶序列两端设计一对引物，其中上游引物序列为：5’-GGAGAGCTGGGAGAGAATGCCAGTGTGACAGT-3’(如SEQ ID No.5所示)，下游引物序列为：5’-GCGGCTGAGGCAGCAGCGGCTGTGCCTG-3’(如SEQ ID No.6所示)，PCR扩增含有靶序列的DNA片段，片段大小为388bp。PCR扩增条件为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸90秒，共30个循环；最后72℃延伸2分钟。扩增的靶序列片段经测序后与GenBank上的序列比对，确定序列正确。

在质粒sgRNA-GFP-T1(购自Addgene公司，产品目录号为41819)质粒引入2个BbsⅠ酶切位点，得到U6-sgRNA克隆载体。分别对第一sgRNA识别序列和第二sgRNA识别序列设计互补序列，并在第一sgRNA识别序列和第二sgRNA识别序列及对应的互补序列两端加上粘性末端，再退火处理形成第一双链DNA和第二双链DNA。其中，第一双链DNA中两条链的序列分别如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，第二双链DNA中两条链的序列分别如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。

分别将第一双链DNA和第二双链DNA对应连接到经BbsI酶切的U6-sgRNA克隆载体中，得到第一sgRNA载体和第二sgRNA载体，经测序确定序列连接正确。

(2)构建待敲入基因的供体载体

以SEQ ID No.3(ACGAATTCTGCATGAAGGCTGGCAT(EcoRI))和SEQ ID No.4(TTGGTACCCTCCCGCAGCATATGG(Kpn1))所示序列的DNA片段为上、下游引物，以小型猪的基因组DNA为模板扩增得到小型猪的两个同源臂及连接在两个同源臂之间的目标序列18Q(18CAG重复序列)，将该扩增产物连接至pBluescript KS(-)载体上，然后将第一外显子上PolyQ为150Q的人突变的亨廷顿基因插入同源臂的中间替换目标序列18Q，得到pBS-HD-KI质粒作为供体载体。

具体地，所述将PolyQ为150Q的人突变的亨廷顿基因插入同源臂的中间替换目标序列包括如下步骤：

以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列的DNA片段为上、下游引物，以小型猪的基因组DNA为模板扩增得到小型猪的两条同源臂以及位于该两条同源臂中间的猪亨廷顿基因第一外显子片段，将该扩增产物经EcoRI和KpnI酶切后连接至经同样内切酶切割的pBluescript KS(-)载体上，形成pBS-HD质粒；

以突变的含有人150CAG重复序列的DNA为模版，并在其两端设计NcoI和ApaI酶切位点进行PCR扩增，扩增出人突变的且包含有150个CAG重复序列的外显子1DNA片段，扩增出约600bp的含有150个CAG的人亨廷顿外显子1基因；

将pBS-HD质粒与人突变的含有150CAG重复序列的外显子1PCR回收产物分别进行NcoI和ApaI酶切，片段回收后，利用T4DNA连接酶将其连接至pBS-HD质粒中，得到pBS-HD-KI质粒基因敲入供体质粒。

(3)细胞转染和筛选

所述含有Cas9切口酶基因的载体可以是但不限于为含有CMV-Cas9-neo基因的载体。

分别对第一sgRNA载体、第二sgRNA载体、供体载体以及含有Cas9切口酶基因的载体(如含有CMV-Cas9-neo基因的载体，购自Addgene公司，产品目录号为MLM3613)经转化处理后扩大培养，再分别提取第一sgRNA载体、第二sgRNA载体、供体载体以及含有Cas9切口酶基因的载体，第一sgRNA载体及第二sgRNA载体各2.5μg，供体载体以及含有Cas9切口酶基因的载体各10μg。

转染前一天复苏融水小型猪的胎儿原代成纤维细胞，在10cm细胞培养皿中加入10ml 15％FBS DMEM培养基，置于37℃培养箱培养；待细胞长满90％培养皿后，胰酶消化重悬细胞，使用Transfection kit中的buffer R(MPK10096，invitorgen)重悬细胞100μl，再加入第一sgRNA载体2.5μg，、第二sgRNA载体2.5μg，、供体载体10μg以及含有Cas9切口酶基因的载体10μg，使用NeonTMTransfection System电转仪(MPK5000，invitorgen)进行电转染，电转仪内预先加入有3ml的E2buffer，电转参数：1400V、10ms、1pulse。电转后，通过稀释法稀释到不同培养皿中，经G418筛选细胞克隆后，待单个细胞长成克隆状，用克隆环将其挑选出来，并且少量进行PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定。

鉴定步骤为：离心收集取出用于鉴定的单克隆细胞，加15μl NP40裂解液(含0.45％NP-40和0.6％蛋白酶K)，依次在56℃裂解1h、在95℃裂解10分钟，得到的裂解液于-20℃保存备用；对裂解液进行PCR处理，其中，PCR的引物序列分别如SEQ ID No.5(5’-GGAGAGCTGGGAGAGAATGCCAGTGTGACAGT-3’)及SEQ ID No.6(5’-GCGGCTGAGGCAGCAGCGGCTGTGCCTG-3’)所示，PCR条件为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸90秒，共30个循环；最后72℃延伸2分钟；

取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。得到单一明亮一条带的PCR产物以正向引物送广州艾基基因测序。测序结果与原供体质粒pBS-HD-KI序列比对一致，获得人突变的HD基因敲入阳性细胞克隆。

挑选阳性的单克隆细胞作为核移植供体细胞，进行体细胞核移植。

为提高基因敲入的效率及细胞培养的状态，转染时使细胞处于活跃分裂增长状态，在培养基中添加维生素C，浓度为25μg/ml，用以维持较好的细胞状态。待挑取克隆扩增传代时，取出少量进行PCR鉴定。首先，将待鉴定细胞置于烘箱，56℃1小时后升温至96℃变性10分钟，通过上述PCR方法PCR鉴定阳性克隆，含有同源臂的为阳性HD基因敲入成纤维细胞克隆。

(4)体细胞核移植

1)猪卵母细胞的分离及成熟

从屠宰场取卵巢，将卵巢放于39℃含青霉素和链霉素的生理盐水中，用注射器将卵泡中的抽取卵泡抽出，39℃静置30分钟，去上清，使用TL-HEPES重悬沉淀，再静置最后将重悬液放入60mm平皿中，在体视镜下，挑选包裹卵丘2层以上，胞质均匀的卵丘细胞-卵母细胞，用成熟液清洗3遍，转入培养液中培养，42小时后，用含0.5％透明质酸酶的DPBS脱卵丘，挑出含有极体的卵细胞进行体细胞核移植。

具体的，将所收集的猪卵巢置于39℃加有青霉素、链霉素的生理盐水中。吸出卵泡液并在39℃水浴保温。静置5分钟后去除上清，加入洗卵液PVA-TL-HEPES(称取6.6633gNaCl、0.2386g KCl、0.1680g NaHCO₃、0.0408g>2PO4、0.1017g>2·6H₂O、2.3830gHepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，H3784)，0.0650g>2·2H₂O，0.1000g>2O(超纯水)后再加1.868ml>2、饱和湿度、39℃条件下培养。12孔板每孔放置40-70枚卵丘卵母细胞复合物。体外成熟培养42-44h后，将卵丘卵母细胞复合物转移入39℃去卵丘操作液(0.030g>2O)，涡旋震荡5分钟，至卵丘细胞脱落。将消化后的卵母细胞转移入盛有胚胎操作液(9.500g>3，0.750g>2O，溶解后调节pH为7.2-7.4溶解后调节pH为7.2-7.4，渗透压为295-310mOsm)的35mm培养皿中，体式镜下挑取排放第一极体的卵母细胞于另一盛有胚胎操作液的35mm培养皿中，39℃保存，待用。

2)体细胞核移植

阳性克隆细胞消化成单个细胞，利用显微操作系统将成熟卵母细胞去核，然后在其卵周隙注入供体细胞，电融合激活重构胚胎，继续培养。

具体地，培养的阳性克隆细胞用0.25％胰蛋白酶进行消化处理4分钟，之后以1300转/分钟的速率离心5分钟，弃上清，用培养基重悬细胞。卵母细胞使用盲吸法去核，将一个供体细胞注射于去核卵母细胞的卵周隙中，使卵母细胞与供体细胞轻轻接触。将重构卵放入平衡好的胚胎培养液PZM3中，38.5℃培养箱中放置，待融合与激活。

将重构卵从胚胎培养液中转至融合激活液(0.3M Mannitol(M9647)，1.0mMCaCl₂·2H₂O，0.1mM>2·6H₂O，0.5mM>3，0.750g>2O，溶解后调节pH为7.2-7.4溶解后调节pH为7.2-7.4，渗透压为295-310mOsm)中，置39℃半小时后，检查供体细胞是否融合，去除未融合重构卵并统计融合率。经PZM-3洗三遍后，将重构卵放于PZM-3中置于5％CO₂、饱和湿度、39℃条件下培养。

3)胚胎移植

胚胎发育至2细胞期。挑选当天自然发情或2天前发情的太湖猪。通过外科手术，将2细胞期的胚胎植入输卵管中，114天后便可以产出基因敲入小型猪。

(5)鉴定阳性基因敲入细胞及基因敲入猪的方法

鉴定阳性基因敲入细胞及基因敲入猪引物序列：

HD S:5’-GGAGAGCTGGGAGAGAATGCCAGTGTGACAGT-3’(SEQ ID No.5)

HD A:5’-GCGGCTGAGGCAGCAGCGGCTGTGCCTG-3’(SEQ ID No.6)

PCR条件为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸90秒，共30个循环；最后72℃延伸2分钟。

1)克隆猪基因型鉴定：在新生克隆猪出生后打耳号，并取下小块耳组织提取基因组鉴定，具体步骤如下：

A.耳组织剪碎，加入200μl GA溶液与20μl(20mg/ml)蛋白酶K，置于56℃消化3小时；

B.加入200μl GB溶液，7℃水浴10分钟至澄清；

C.加入200μl乙醇，混匀；

D.液体移入吸附柱CB3中，12000转/分钟，离心30-60秒。

E.用500μl GD清洗柱子，再用600μl PW洗柱子两遍；

F.最后在柱子中间滴加100μl 65℃水浴预热的洗脱液TE，静置3分钟，12000转，离心2分钟。

以提取的基因组为模板，进行商户PCR，琼脂糖凝胶电泳观察到条带后送测序。

2)基因敲入猪蛋白表达的鉴定

分别取出HD KI猪(以下简称KI猪)和WT野生型猪的大脑，通过4％的多聚甲醇的固定，组织经历脱水、石蜡包埋、切片等，具体步骤如下：

a.取材：首先切下2cm×1.5cm，厚度不超过3mm的组织块，置于浸泡盒中；

b.脱水(提前配制好梯度酒精)：70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇I、95％乙醇II各2小时；无水乙醇I、无水乙醇II中1小时；无水乙醇与二甲苯混合液(体积比1：1)中30分钟；

c.组织透明：二甲苯I，30分钟；二甲苯II中30分钟；

d.浸蜡：石蜡58℃1h，59℃1h，60℃1h；

e.包埋：将烘箱温度升至63℃，将组织放于包埋盒中。

免疫组化和免疫荧光染色步骤如下：a.熔蜡；b.脱蜡；c.水化；d.修复；e.封闭；f.一抗孵育；g.清洗；h.二抗孵育。

3)蛋白提取和Western blotting

放入bio-rad转膜仪中，200mA，Huntingtin蛋白转移120分钟，选用0.4μm的PVDF膜。转膜后用TBST(即含0.05％的tween 20)清洗，加入5％的脱脂牛奶，室温封闭1h，加1C2抗体4℃过夜，用TBST清洗3次，加入2抗室温孵育1h，清洗3次，即可检测。

(6)通过细胞水平鉴定阳性克隆进行核移植后所得的基因敲入猪的动物的概率大幅度提高

利用所筛选的阳性细胞克隆进行核移植，核移植前将复苏的猪胎儿成纤维细胞添加VC可以提高克隆效率，最终所产生的阳性小猪高达86.7％的基因敲入阳性率，节约了经济成本，缩短了时间，提高了基因敲入模型阳性动物的效率。

(7)实验结果及分析

通过优化供体载体质粒pBS-HD-KI、第一sgRNA载体、第二sgRNA载体、CMV-Cas9-neo质粒的比例：10μg、2.5μg、2.5μg、10μg，优化电转仪的参数以优化最高效率的基因敲入概率。按筛选后的sgRNA序列，构建的同源打靶质粒、以及电转质粒的优化后的最优比例，经G418筛选细胞克隆后，参图2，通过对两个同源臂检测，优化后的效率为15个细胞克隆中有13个阳性克隆，成功率高达87％，远远高于传统的基因敲入的10^-6以及Talen、ZFN等基因敲入的概率。

继续参图2，利用所筛选的细胞克隆进行核移植生产HD基因敲入猪，其中怀孕率为62.5％。

如图3所示，生产后鉴定阳性的基因敲入猪为7只中有6只阳性基因敲入猪，概率高达85.7％。因此，利用优化的基因敲入细胞筛选及体细胞核移植的方法，将基因敲入的猪的阳性率显著提高，节约了成本、提高了效率。

传统的HD转基因猪通常在出生后就立即死亡(Yang et al.,2010)，而本实施例的新生的HD基因敲入模型猪在出生时均与野生型猪表现一致正常，在5个月时，基因敲入猪几乎差不多时间点开始出现明显的运动障碍，体重下降等，产生了渐进的表型，以往的转基因猪往往由于过表达毒性蛋白而立即死亡，或是随机插入的位点不活跃表达量较低。如图4中A和B图所示，可以看出这些猪表现出后腿交叉、滑步等不正常的运动障碍，尤其5号产生了剧烈的运动，即运动痉挛。当把这些猪放在跑步机上，以1.5km/h的速度持续一段时间后，从图4中C图可以看出KI的猪均不能正常的跑步前进，停留在后面不动。图4中D图显示，KI-2，KI-3，KI-4，KI-6最终均死于呼吸障碍。图4中E图示出了KI猪的生存曲线及体重变化。

HD基因敲入模型猪为检测突变的Htt蛋白表达提供了良好的材料。通过WesternBlot分析利用1C2抗体可以显示出PolyQ重复片段的出现，可以看出全长的突变的Htt在不同脑区中表达(大脑皮层、纹状体)和其他外周组织例如肝脏和肌肉，如图5中A图所示。正如所期待的一样，也观察到了降解的突变的Htt蛋白，并且这些降解的仅仅表现在KI猪中，野生型猪并没有表现出来，1C2染色也揭示了Htt的聚集在神经元，并且产生神经纤维聚集等如图5中B图所示。这些结果与之前小鼠一致，表明N端的Htt片段形成聚集。

如图6所示，经过自然交配，其中5号猪怀孕，经过PCR鉴定，其中3只为阳性的F1小猪，经过Western Blot鉴定可以看出其均表达突变的Htt蛋白。

突变的亨廷顿基因敲入猪可以稳定遗传至F1代并稳定表现出突变的蛋白表达及行为学变化，由此说明是一个成功的模型。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>暨南大学

中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120>人亨廷顿基因敲入用重组载体及其构建方法和在模型猪构建中的应用

<160>13

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

gcaccgaccg tgagtgc 17

<210>2

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<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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<210>3

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<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

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<210>5

<211>32

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<213>人工序列(Artificial Sequence)

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<210>6

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<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

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<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>7

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<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>8

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<210>9

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<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

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<211>665

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>13

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