猪、牛体细胞α-1,3-半乳糖基转移酶基因的敲除以及人白细胞抗原HLA-G1基因的敲入

摘要

本实验中利用已克隆到pMD-3arm载体上4.5kb的猪α-1,3-半乳糖基转移酶基因片段，该片段包括了大部分第8内含子和一部分第9外显子。运用PCR的方法，从猪的基因组中获得约1.9kb的猪α-1,3-GT的第9外显子序列的扩增产物，将片段克隆于pGEM-Teasy载体。将4.5kb和1.9kb片段分别作为打靶载体的5’、3’同源臂，以Neor为正选择标记基因，以GFP为负选择标记基因，构建敲除猪α-1,3-半乳糖基转移酶基因并同时能表达人白细胞抗原HLA-Gl基因的的打靶载体pZJ。以线性化打靶载体DNA pZJ(带有报告基因GFP和Neor)为打靶的外源基因，通过脂质体介导的方法将线性化载体pZJ分别转染牛、猪的成纤维细胞，经G418筛选出阳性细胞克隆，并进行扩大培养，提取阳性克隆的基因组DNA进行PCR检测。