一种基于二氧化钛薄膜场效应管的乳酸脱氢酶活性的测定方法

摘要

本发明公开了一种基于二氧化钛薄膜场效应管的乳酸脱氢酶活性的测定方法。包括如下步骤：（1）溶胶凝胶法制备二氧化钛薄膜：清洗硅片，配制溶液，旋涂，退火；（2）镀电极及三电极连接；（3）酶的固定化；（4）酶活性的检测：使用KEITHLEY 4200测试酶活性检测的场效应管的电学特性，先测试不同栅极电压下D‑S之间乳酸脱氢酶的I‑V曲线，然后测试滴加不同浓度乳酸后进行即时检测，随后在多个反应时间点进行检测，观察不同反应时间D‑S之间的I‑V曲线变化。本发明无需试纸、测试周期短、响应快，可以实现酶活性的快速检测。本发明需要的酶浓度低，体积少，并且可以是固定化酶。测试方法简单，为血清中酶活性测量提供一个新方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于二氧化钛薄膜场效应管的乳酸脱氢酶活性的测定技术。

背景技术

人体内许多疾病的发生和酶的异常密切相关，如酪氨酸酶缺失就会引发白化病，苯丙氨酸羟化酶缺失导致苯丙酮酸尿症，乳酸脱氢酶含量偏高，可能是因为白血病、肺梗塞及肿瘤转移所致的胸腹水所引起。许多组织器官的疾病常表现为血液中一些酶活性的异常，酶活性的测定有助于许多疾病的诊断和治疗。正常情况下，组织中发挥作用的酶在血清中含量甚微，只有当组织受损，特异的标志酶会大量释放入血液，引起血清中酶含量增高。血清中酶含量的测定方法主要有速率法（连续监测法）和定时比色测定法。这两种方法均需要用大型专用仪器检测并且消耗的酶量较多（通常需要采集3-4 ml静脉血）。同时，临床上在酶活性的测定之前需要经历血液标本的采集、分离以及储存等多个过程，任何一个过程处理不当均会使得测定值不准确。基于以上因素，有必要发展一种新的测试方法来避免或减少上述方法中出现的问题。考虑到场效应管的电学特性对电荷较为敏感，而不同的酶通常带有不同的电荷和极性。因此，我们基于二氧化钛场效应管，针对其电学特性随酶种类及活性变化而变化的特点，提出了一种酶活性的检测方法。该发明专利中所涉及的检测方法极大简化了酶活性的探测过程，能够极大促进相关疾病的诊断和治疗。

同时，乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶，存在于机体所有组织细胞的胞质内。乳酸脱氢酶含量的偏高或偏低，意味着身体中某些组织的异常,如乳酸脱氢酶检查偏高常见于心肌炎、肝硬化、恶性肿瘤及恶性贫血等病症，其检测对人体健康有极为重要的意义。本发明基于二氧化钛场效应管，建立起乳酸脱氢酶活性的检测方法，从而通过电学手段快速准确的筛查出疾病的根源，从而进行更好的治疗。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于二氧化钛薄膜场效应管的乳酸脱氢酶活性的检测方法的技术。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于二氧化钛薄膜场效应管的乳酸脱氢酶活性的检测方法，包括如下步骤：

1、制备基于酶活性检测的场效应管结构

（1）溶胶凝胶法制备二氧化钛（TiO₂）薄膜

清洗硅片：首先n型硅片（电阻率< 0.1 Ω·cm）的背面滴加少量BOE溶液以去除Si表面自然形成的SiO₂，30s后用超纯水清洗，然后将硅片放置于烧杯中，依次用乙醇、丙酮、超纯水各超声15分钟，用N₂吹干，硅片的背面均匀涂上导电银浆溶液以防止已显露的Si表面再次氧化，等银浆完全干后，再将硅片放置于臭氧清洗机上清洗半个小时，洁净硅片待用。

配制溶液：在N₂手套箱中，取5mL>

旋涂：将洁净硅片置于匀胶机上，匀胶机在低速下旋转，用移液器量取少量滤液滴加到硅片上，然后高速成膜，设置转速为6000r/min，甩膜30s，甩膜后将硅片放置在加热台上110℃加热5min。

退火：将甩膜得到的湿膜置于管式炉中，在5kPa氧气气氛下350℃预烧5min，再在550℃下退火1h完成结晶过程，得到TiO₂薄膜。

（2）镀电极及三电极连接：将条状掩膜版置于硅片表面，采用电子束蒸发法镀金电极，设置蒸镀速率为0.5 Å/s，Au膜厚为60nm。以n-Si为栅电极（gate），源电极（source）和漏电极（drain）为表面镀的金电极。

（3）酶的固定化： 在源-漏电极（S-D）间依次滴加壳聚糖、戊二醛和乳酸脱氢酶，每步滴加完溶液固定一个小时，最后用超纯水洗净，放置冰箱4℃待用。

2、酶活性的检测

电导性能测试：将步骤1中准备好的样品置于四探针台，使用KEITHLEY 4200测试酶活性检测的场效应管的电学特性，先测试不同栅极电压下D-S之间乳酸脱氢酶的I-V曲线，然后测试滴加不同浓度乳酸后进行即时检测，随后在多个反应时间点进行检测，观察不同反应时间D-S之间的I-V曲线变化，测试结果与紫外光谱检测的结果变化趋势十分一致。

本发明基于二氧化钛薄膜场效应管，以壳聚糖和戊二醛作为交联剂，通过测试不同栅极电压下乳酸脱氢酶的D-S之间的I-V曲线及滴加不同浓度乳酸后D-S之间的I-V曲线随时间的变化，实现了乳酸脱氢酶活性的测定。测试结果表明，在0到5V偏压下，TiO₂薄膜上加上乳酸脱氢酶后，电流值增加，同时加上栅极电压后，结果表明，栅电压对此电流具有调控作用。进一步，滴加不同浓度乳酸后，记录D-S之间的I-V曲线及电流随时间的变化。结果表明，同一浓度时，电流随时间下降的趋势和幅度与光谱测量得到的结果十分一致。基于本发明专利，通过电导的测量可以直接得到酶的活性，无需要过多的处理步骤和专用的大型仪器，测量结果能够为一些疾病的诊断提供一定的参考价值。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明无需试纸、测试周期短、响应快，可以实现酶活性的快速检测。

2.本发明需要的酶浓度低，体积少，并且可以是固定化酶。

3.本发明测试方法简单，为血清中酶活性测量提供一个新方法。

附图说明

图1是TiO₂薄膜场效应管的乳酸脱氢酶活性检测方法的示意图，其中壳聚糖简称CHIT,>

图2是TiO₂薄膜的XRD测试结果；

图3是TiO₂薄膜的（a）AFM>

图 4是基于 TiO₂薄膜场效应管的乳酸脱氢酶活性的检测：其中（a）V_g>2薄膜固定化LDH后，V_DS-I_DS曲线图；（b）向LDH上滴加不同浓度的乳酸后，V_DS-I_DS曲线图；（c）滴加LDH>-3M时，最大电流随反应时间的变化图；（d）滴加LDH>

具体实施方式

实施例1：在N₂手套箱中，首先，取5mL>2薄膜进行组分、结构和形貌表征，结果表明TiO₂薄膜均匀、平整、致密。将条状掩膜版置于样品表面，采用电子束蒸发蒸镀金电极，设置蒸镀速率为0.5Å/s，Au膜厚为60nm。以n型硅作为栅电极，表面镀的相邻两个条形金电极为源电极和漏电极。首先通过KEITHLEY>2薄膜具有的电学性能，然后在源-漏电极中间滴加2µL的0.5wt%>g=0.1V时，乳酸浓度越大，电流越大。当乳酸浓度加到最大值10^-3M时，记录5min内每隔1min的I-V曲线，结果如图4（c）。可以看出，一方面，乳酸脱氢酶的加入，使得电导增大，呈现特殊的特征曲线，且栅电压对此电流具有调控作用。另一方面，固定化乳酸脱氢酶后，在其上面滴加不同浓度的乳酸，其活性的变化引起场效应管中电流的改变，能通过电导的测试对其活性进行判断。实验结果表明，乳酸脱氢酶的活性随着时间增加逐渐降低，电导逐渐减小，电学性能测试结果与光谱测试结果十分一致（如图4（c）和4（d））。