一种固定化酶催化剂生物合成D‑塔格糖的方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化酶催化剂生物合成D‑塔格糖的方法。本发明利用固定化酶催化剂生物合成D‑塔格糖的方法具体如下：首先制备重组枯草芽孢杆菌，构建L‑阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂；将重组枯草芽孢杆菌芽孢加入到D‑半乳糖反应液中，一定条件下振荡转化，得到D‑塔格糖。本发明构建一种新型的食品安全的固定化酶催化剂，并优化固定化酶合成D‑塔格糖的生物转化工艺，提高其转化率；其中，固定化酶催化剂的比活力高达2.10×10

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化酶催化剂生物合成D-塔格糖的方法，特别涉及一种L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂转化D-半乳糖合成D-塔格糖的方法。

背景技术

D-塔格糖是自然界存在的一种稀有己酮糖，它与蔗糖有相同的口感，甜度为蔗糖的92％，美国食品药品监督管理局(FDA)已经确认了其食品安全性(GRAS)。D-塔格糖作为低热量甜味益生元，代替蔗糖广泛应用于果汁、饮料、口香糖等食品领域，并且具有改善肠道菌群、治疗Ⅱ型糖尿病、降低胆固醇、预防结肠癌等功效；此外，D-塔格糖对于治疗贫血症等疾病有潜在的效果，也可用于抗氧化剂和细胞保护方面，在医药行业也具有广泛的应用。

D-塔格糖在欧洲市场的份额逐年增加，据预测D-塔格糖将会以每年20％-50％的稳定速度增长。而国内D-塔格糖的生产消费市场还是空白。由于中国人口基数大，糖尿病患者高居世界首位，功能性甜味剂市场广阔，D-塔格糖在中国市场上的发展潜力极大。目前，D-塔格糖的生产有化学法和生物酶法两种，两种方法的底物均为D-半乳糖，而D-半乳糖可以通过水解乳清(脱蛋白乳清)或乳糖获得，而乳清或脱蛋白乳清作为乳制品工业的副产物，资源丰富且价格低廉。化学法生产D-塔格糖存在产物纯化复杂、废物处理成本高等问题，因而近来利用L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)，通过生物酶法制备D-塔格糖并实现工业化生产成为研究的热点。另外，枯草芽孢杆菌作为一种食品安全菌株，在表达外源蛋白方面具有突出优势。依靠枯草芽孢杆菌在营养缺乏或环境胁迫下产生的芽孢的独特抗逆性，通过芽孢表面展示技术将具有催化活性的外源蛋白酶展示在芽孢表面，可以大大增加酶制剂的应用条件和范围。

利用L-阿拉伯糖异构酶可以比较方便的将D-半乳糖转化D-塔格糖，所用的酶一般均为重组的基因工程酶。文献报道了利用固定化L-阿拉伯糖异构酶转化D-半乳糖生成D-塔格糖的研究。如2014年有研究学者利用CotX作为锚定蛋白，通过枯草芽孢杆菌芽孢表面展示固定化来自Lactobacillus fermentum的L-阿拉伯糖异构酶，固定化活力为2.02×10^-10U/芽孢，以100g/L>

发明内容

本发明的目的在于克服现有固定化酶生物合成D-塔格糖技术中存在的缺陷，如从底物D-半乳糖到D-塔格糖转化率低，L-阿拉伯糖异构酶活力低、稳定性差等，本发明提供了一种L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂生物合成D-塔格糖的方法，优化固定化酶合成D-塔格糖的生物转化工艺，实现食品级D-塔格糖的稳定高效生产。

本发明提供了一种固定化酶催化剂生物合成D-塔格糖的方法，具体按照以下步骤进行：

(1)将重组枯草芽孢杆菌(B.subtilis-pHS)在DSM培养基中37℃，160rpm条件下培养36h，8000rpm离心并将将沉淀物重悬于pH 6.5的磷酸缓冲液中，加入0.5％的溶菌酶，37℃处理1h；8000rpm离心收集沉淀物，用1M NaCl和1M KCl洗涤后，8000rpm离心收集，得重组枯草芽孢杆菌芽孢；将重组枯草芽孢杆菌芽孢重悬在pH 6.5的磷酸缓冲液中，配成浓度为0.78×10⁹芽孢/mL的重组枯草芽孢杆菌芽孢溶液备用；

所述重组枯草芽孢杆菌芽孢表面含有L-阿拉伯糖异构酶固定化酶；重组枯草芽孢杆菌芽孢即为构建的L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂。

(2)将重组枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液加入到反应液中，得到混合液；其中，重组枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液与反应液的体积比为5-15:100；反应液组成为：D-半乳糖20-150g/L，MnCl₂>

(3)将步骤(2)的混合液置于65-75℃，220rpm条件下振荡转化16-24h，得到含有D-塔格糖的转化液。

(4)8000rpm离心并收集(3)中重组芽孢加入400mL反应液中；

(5)依次重复(3)和(4)4次，计算转化率和L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂的残留活力。

其中步骤(5)所述酶活力测定方法如下：在1mL反应体积中含有500mM D-半乳糖，1mM MnCl₂，适量重组芽孢，100mM>

本发明制备的重组枯草芽孢杆菌芽孢，L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂的比活力高达2.10×10^-9U/芽孢；D-塔格糖的转化率达95％。

与现有技术相比较，本发明的有益效果体现如下：

(1)本发明将购自于中国工业微生物菌种保藏中心菌株编号为CCICC 6239的益生菌-短乳杆菌的L-AI，并通过益生菌-枯草芽孢杆菌168的CotB锚定蛋白，并利用设计的Linker序列，通过来源于益生菌的没有抗生素基因的穿梭质粒pHS构建重组质粒，展示于食品安全的枯草芽孢杆菌的芽孢表面；构建一种新型的食品安全的固定化酶催化剂，提高该固定化酶的活力与稳定性；并优化固定化酶合成D-塔格糖的生物转化工艺，提高其转化率，从而开发一套绿色、安全、高效、经济的D-塔格糖的全新合成技术与方法，实现食品级D-塔格糖的高效生产。

(2)另外，通过以上方法制备的固定化L-AI具有以D-半乳糖为底物生物合成D-塔格糖的高转化率。以20-150g/L的D-半乳糖为底物70℃转化生产D-塔格糖，其转化率可达95.0％(图1)。重复利用5次后，L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂残留活力仍在95％以上，重复利用10次后，固定化酶催化剂残留活力仍在92％以上，重复利用20次后，固定化酶催化剂残留活力仍在85％以上。制备的固定化L-AI具有较高的活力和较高稳定性特点，固定化酶催化剂的比活力高达2.10×10^-9U/芽孢。通过本发明方法制备D-塔格糖具有操作简单、成本低廉，绿色安全、高效率等特点，具有一定的实际意义。

附图说明

图1为本发明中L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂转化不同浓度D-半乳糖生成D-塔格糖的转化率，其中横坐标为D-半乳糖的不同浓度，纵坐标为D-塔格糖的转化率。

具体实施方式

本发明的短乳杆菌购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号：CCICC 6239。本发明所述L-AI的编码基因araA序列与GenBank中短乳杆菌ATCC 367的L-AI基因序列具有100％相似性，其GenBank接收号为CP000416.1。本发明CotB基因克隆自枯草芽孢杆菌168，CotB基因测序结果显示与GenBank中的枯草芽孢杆菌168的CotB基因具有100％相似性，其GenBank接收号为NC_000964.3。

本发明通过基因整合试剂盒将上述CotB基因和araA基因利用设计的Linker构建融合重组质粒pHS-cotB-Linker-araA，并导入枯草芽孢杆菌DB403得到含有融合CotB、Linker和L-AI的重组芽孢，从而使L-AI展示于枯草芽孢杆菌DB403的芽孢表面，获得新型固定化酶。

包括以下步骤：

1、培养短乳杆菌，提取菌株的总DNA，通过PCR扩增出目的片段araA；

2、培养枯草芽孢杆菌168，提取菌株的总DNA，通过PCR扩增出CotB基因片段

3、目的片段和表达载体pHS通过融合技术构建融合重组质粒，将融合重组质粒导入宿主菌枯草芽孢杆菌DB403，获得B.subtilis-pHS；

4、培养B.subtilis-pHS，制备重组枯草芽孢杆菌芽孢，获得L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂；

5、将固定化酶催化剂加入反应液中，转化制得D-塔格糖；

6、测定转化率和固定化酶催化剂的残存酶活力。

其中反应液组成如下：D-半乳糖20-150g/L，MnCl₂>

实施例1：

芽孢展示L-AI重组载体与重组芽孢构建

1、根据短乳杆菌的araA基因序列和载体pHS(无抗生素基因)上多克隆位点的特征，利用生物信息学软件设计合成引物：引物1，5’-GGTGGCGGCGGTTCTGGTGGCGGCGGTTCTCTAAAGGAGTGCTCAATTATG-3’；引物2，5'-CGCTCTAGAACTAGTCCATTTTAAATGTTTAGC。引物1中的下划曲线部分的序列编码Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(Linker)，引物2中的下划线部分序列与经EcoRI和BamHI双酶切线性化的pHS质粒一端互补。

2、以短乳杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因。

3、PCR反应参数：预变性，95℃5min；变性94℃2min，退火，55℃30s，延伸，72℃90s，35个循环后72℃保温10min。最后16℃保温。

4、所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为1.5Kb的电泳条带，将PCR产物进行PCR纯化用于融合表达。

5、结果显示该基因序列长1461bp，测序结果与GenBank中短乳杆菌ATCC 367的L-AI基因序列具有100％相似性，其GenBank接收号为CP000416.1。

6、根据枯草芽孢杆菌168的CotB基因序列和载体pHS上多克隆位点以及araA基因序列特征，利用生物信息学软件设计合成引物：引物3，5'-5'-GGTCTGACGCTCAGTGCGTGAAAATGGGTATTCGCG-3'；引物4：5’-AGAACCGCCGCCACCAGAACCGCCGCCACCAATTTACGTTTCCAGTGATAG-3’；引物3中的下划线部分序列与经EcoRI和BamHI双酶切线性化的pHS质粒一端互补。引物4中的下划线部分的序列编码Linker，与引物1下划线部分互补。

7、以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因。

8、PCR反应参数：预变性，95℃5min；变性94℃2min，退火，55℃30s，延伸，72℃70s，35个循环后72℃保温10min。最后16℃保温。

9、所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为1.3Kb的电泳条带，将PCR产物进行PCR纯化用于融合表达。

10、测序结果显示该基因与GenBank中的枯草芽孢杆菌168的CotB基因具有100％相似性，其GenBank接收号为NC_000964.3。

11、通过多个基因与质粒的融合技术构建重组载体pHS-cotB-Linker-araA。pHS经EcoRI和BamHI双酶切线性化并与CotB基因、Linker序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)和araA基因通过基因融合试剂盒进行重组质粒构建。

12、重组载体pHS-cotB-Linker-araA转化于枯草芽孢杆菌DB403细胞，获得重组枯草芽孢杆菌(B.subtilis-pHS)；

13、重组枯草芽孢杆菌芽孢制备，将B.subtilis-pHS在DSM培养基中37℃，160rpm条件下培养36h，8000rpm离心收集芽孢，并生悬于100mM pH 6.5的磷酸缓冲液中，0.5％的溶菌酶37℃处理1h。8000rpm离心收集沉淀并用1M NaCl和1M KCl洗涤两次，8000rpm离心收集重组枯草芽孢杆菌芽孢。固定化酶的比活力高达2.10×10^-9U/芽孢。

实施例2：

L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂转化20g/L的D-半乳糖制备D-塔格糖

1、将重组枯草芽孢杆菌芽孢重悬在pH 6.5的磷酸缓冲液中，配成浓度为0.78×10⁹芽孢/mL的重组枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液备用；然后将40mL(0.78×10⁹芽孢/mL)重组枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液加入400mL反应液中；

2、70℃，220rpm条件下于2L摇瓶振荡转化24h，不定时取样，转化液中得到D-塔格糖；

3、8000rpm离心并收集步骤2中重组枯草芽孢杆菌芽孢加入400mL反应液中；

4、依次重复步骤2和3 4次，计算转化率和固定化酶催化剂残留活力。

其中步骤1所述反应液组成如下：D-半乳糖20g/L，MnCl₂>

其中步骤4所述酶活力测定方法如下：在1mL反应体积中含有500mM D-半乳糖，1mMMnCl₂，适量重组枯草芽孢杆菌芽孢，100mM>

利用构建的L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂，以20g/L的D-半乳糖为底物转化生产D-塔格糖，其转化率可达95.0％(图1)。重复利用5次后，L-阿拉伯糖异构酶固定化酶残留活力仍在95％以上，重复利用10次后，L-阿拉伯糖异构酶固定化酶残留活力仍在92％以上，重复利用20次后，该固定化酶残留活力仍在85％以上。

实施例3：

L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂转化150g/L的D-半乳糖制备D-塔格糖

1、将40mL(0.78×10⁹芽孢/mL)重组枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液加入400mL反应液中；

2、70℃，220rpm条件下于2L摇瓶振荡转化24h，不定时取样，转化液中得到D-塔格糖；

3、8000rpm离心并收集步骤2中重组枯草芽孢杆菌芽孢加入400mL反应液中；

4、依次重复步骤2和34次，计算转化率和固定化酶残留活力。

其中步骤1所述反应液组成如下：D-半乳糖150g/L，MnCl₂>

其中步骤4所述酶活力测定方法如下：在1mL反应体积中含有500mM D-半乳糖，1mMMnCl₂，适量重组枯草芽孢杆菌芽孢，100mM>

利用构建的L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂，以150g/L的D-半乳糖为底物转化生产D-塔格糖，其转化率可达86％(图1)。重复利用5次后，L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂残留活力仍在95％以上，重复利用10次后，固定化酶残留活力仍在92％以上，重复利用20次后，固定化酶残留活力仍在85％以上。

实施例4：

L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂转化100g/L的D-半乳糖制备D-塔格糖

1、将40mL(0.78×10⁹芽孢/mL)重组枯草芽孢杆菌芽孢悬浮液加入400mL反应液中；

2、70℃，220rpm条件下于2L摇瓶振荡转化24h，不定时取样，转化液中得到D-塔格糖；

3、8000rpm离心并收集步骤2中重组枯草芽孢杆菌芽孢加入400mL反应液中；

4、依次重复步骤2和34次，计算转化率和固定化酶残留活力。

其中步骤1所述反应液组成如下：D-半乳糖100g/L，MnCl₂>

其中步骤4所述酶活力测定方法如下：在1mL反应体积中含有500mM D-半乳糖，1mMMnCl₂，适量重组枯草芽孢杆菌芽孢，100mM>

利用构建的L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂，以100g/L的D-半乳糖为底物转化生产D-塔格糖，其转化率可达90％(图1)。重复利用5次后，固定化酶催化剂残留活力仍在95％以上，重复利用10次后，固定化酶残留活力仍在92％以上，重复利用20次后，固定化酶残留活力仍在85％以上。

实施例5：

全细胞方法制备D-塔格糖

1、将培养的短乳杆菌6000rpm离心收集细胞，100mM pH6.5磷酸钾缓冲液洗涤2次，6000rpm离心制备全细胞。

2、将适量全细胞(10％，w/v)加入400mL反应液中；

2、70℃，220rpm条件下于2L摇瓶振荡转化24h，不定时取样，转化液中得到D-塔格糖；

3、8000rpm离心并收集步骤2中全细胞加入400mL反应液中；

4、依次重复步骤2和34次，计算转化率和残留酶活力。

其中步骤1所述反应液组成如下：D-半乳糖20-150g/L，MnCl₂>

其中步骤4所述酶活力测定方法如下：在1mL反应体积中含有500mM D-半乳糖，1mMMnCl₂，适量全细胞，100mM>

5、利用构建的新型固定化酶催化剂，以20-150g/L的D-半乳糖为底物转化生产D-塔格糖，其转化率最高为37.0％。重复利用5次后，酶残留活力仅有20％。

实施例6：

Lactobacillus fermentum的L-AI芽孢展示固定化制备D-塔格糖

参考文献(Liu Li et al.2014,Efficient Production of D-Tagatose Using aFood-Grade Surface Display System.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62,6756-6762)报道了Lactobacillus fermentum的L-AI芽孢展示固定化制备D-塔格糖的方法，其步骤如下：

1、将枯草芽孢杆菌的锚定蛋白CotX的编码基因以及Lactobacillus fermentum的L-AI基因克隆到质粒pJS700a上，该质粒含有抗生素基因。

2、通过同源重组将CotX基因与L-AI基因整合到枯草芽孢杆菌168的基因组上。

3、制备重组芽孢，L-AI展示于芽孢表面，其固定化酶比活力为2.02×10^-10U/芽孢。

4、以25-200g/L D-半乳糖为底物时，固定化酶生成D-塔格糖的转化率在35-84％之间，当D-半乳糖为150g/L时转化率在40％左右。

5、固定化酶重复利用5次后，残余酶活力仅为19％。

实施例7：

构建来源于Lactobacillus plantarum的L-AI的重组Lactococcus lactis并通过全细胞转化制备D-塔格糖

参考文献(Yao Zhang,et al.2017,D-Tagatose production by Lactococcuslactis NZ9000Cells Harboring Lactobacillus plantarum L-arabinoseIsomerase.Indian Journal of Pharmaceutical Education and Research,2014,62,6756-6762)报道了构建来源于Lactobacillus plantarum的L-AI的重组Lactococcuslactis并通过全细胞转化制备D-塔格糖的方法，其步骤如下：

1、将Lactobacillus plantarum的L-AI基因克隆到质粒pCYT上，该质粒含有抗生素基因。

2、将重组质粒转化到Lactococcus lactis，获得含有重组L-AI的重组Lactococcus lactis菌株。

3、制备全细胞用于D-半乳糖生物合成D-塔格糖，在优化的50℃、pH 7.0、300mmol/LMn²⁺条件下，转化20-100g/L的D-半乳糖生成D-塔格糖的转化率最高为69.4％，当D-半乳糖为100g/L时转化率最高仅有28.2％。

实施例8：

将实施例2中的转化时间改为16h或20h，其它转化20g/L的D-半乳糖制备D-塔格糖的条件及转化率和固定化酶残留活力测试方法与实施例2完全相同。

利用构建的L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂，转化时间为16h时，以20g/L的D-半乳糖为底物转化生产D-塔格糖，其转化率可达93％。重复利用5次后，固定化酶残留活力仍在95％以上，重复利用10次后，固定化酶残留活力仍在92％以上，重复利用20次后，固定化酶残留活力仍在85％以上。

利用构建的L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂，转化时间为20h时，以20g/L的D-半乳糖为底物转化生产D-塔格糖，其转化率可达94％。重复利用5次后，固定化酶残留活力仍在95％以上，重复利用10次后，固定化酶残留活力仍在92％以上，重复利用20次后，固定化酶残留活力仍在85％以上。

实施例9：

将实施例3中的转化时间改为16h或20h，其它转化150g/L的D-半乳糖制备D-塔格糖的条件及转化率和固定化酶残留活力测试方法与实施例3完全相同。

利用构建的L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂，转化时间为16h时，以150g/L的D-半乳糖为底物转化生产D-塔格糖，其转化率可达84％。重复利用5次后，固定化酶残留活力仍在95％以上，重复利用10次后，固定化酶残留活力仍在92％以上，重复利用20次后，固定化酶残留活力仍在85％以上。

利用构建的L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂，转化时间为20h时，以150g/L的D-半乳糖为底物转化生产D-塔格糖，其转化率可达85％。重复利用5次后，固定化酶残留活力仍在95％以上，重复利用10次后，固定化酶残留活力仍在92％以上，重复利用20次后，固定化酶残留活力仍在85％以上。

实施例10：

将实施例4中的转化时间改为16h或20h，其它转化100g/L的D-半乳糖制备D-塔格糖的条件及转化率和固定化酶残留活力测试方法与实施例4完全相同。

利用构建的L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂，转化时间为16h时，以100g/L的D-半乳糖为底物转化生产D-塔格糖，其转化率可达88％。重复利用5次后，固定化酶残留活力仍在95％以上，重复利用10次后，固定化酶残留活力仍在92％以上，重复利用20次后，固定化酶残留活力仍在85％以上。

利用构建的L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂，转化时间为20h时，以100g/L的D-半乳糖为底物转化生产D-塔格糖，其转化率可达89％。重复利用5次后，固定化酶残留活力仍在95％以上，重复利用10次后，固定化酶残留活力仍在92％以上，重复利用20次后，新型化酶残留活力仍在85％以上。

实施例11：

将实施例2中重组枯草芽孢杆菌芽孢的添加量改为20mL，转化温度改为75℃，其它转化20g/L的D-半乳糖制备D-塔格糖的条件及转化率和固定化酶残留活力测试方法与实施例4完全相同。

利用构建的L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂，以100g/L的D-半乳糖为底物转化生产D-塔格糖，其转化率可达86％。重复利用5次后，固定化酶残留活力仍在95％以上，重复利用10次后，固定化酶残留活力仍在92％以上，重复利用20次后，固定化酶残留活力仍在85％以上。

实施例12：

将实施例2中重组枯草芽孢杆菌芽孢的添加量改为60mL，转化温度改为65℃，其它转化20g/L的D-半乳糖制备D-塔格糖的条件及转化率和固定化酶残留活力测试方法与实施例4完全相同。

利用构建的L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂，以100g/L的D-半乳糖为底物转化生产D-塔格糖，其转化率可达87％。重复利用5次后，固定化酶残留活力仍在95％以上，重复利用10次后，固定化酶残留活力仍在92％以上，重复利用20次后，固定化酶残留活力仍在85％以上。

图1为本发明中L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂转化不同浓度D-半乳糖生成D-塔格糖的转化率，其中横坐标为D-半乳糖的不同浓度，纵坐标为D-塔格糖的转化率。转化温度为70℃，转化时间为24h时，以20-150g/L的D-半乳糖为底物转化生产D-塔格糖，其转化率均在86％以上，最高可达95％，重复利用5次后，固定化酶残留活力仍在95％以上，重复利用10次后，固定化酶残留活力仍在92％以上，重复利用20次后，固定化酶残留活力仍在85％以上。

本发明的实施例表明，本发明构建的L-阿拉伯糖异构酶固定化酶催化剂具有较高的L-AI活力，比活力可达2.10×10^-9U/芽孢，转化率较高，可达95％，并且重复利用20次后，固定化酶残留活力仍在85％以上，适合于塔格糖的工业化生产。