一种用于检测精原细胞瘤的试剂盒

摘要

本发明公开了一种与用于检测精原细胞瘤的试剂盒，其含有能能够检测与精原细胞瘤相关的分子标记的检测试剂。本发明的精原细胞瘤的试剂盒具有检测简单、准确、快速，特异性强等优点。

说明书

发明领域

本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种用于检测精原细胞瘤的试剂盒。

背景技术

精原细胞瘤(seminoma)起源于睾丸原始生殖细胞，为睾丸最常见的肿瘤，多发生于中年以后，常为单侧性，右侧略多于左侧。发生于隐睾的机率较正常位睾丸高几十倍。该瘤为低度恶性。肉眼观，睾丸肿大，有时可达正常体积的10倍，少数病例睾丸大小正常。肿瘤体积大小不一，小者仅数毫米，大者可达十余厘米，通常直径为3～5cm。

I期：睾丸切除术后应常规行膈以下包括主动脉旁淋巴结区放射治疗(20-30Gy)。不做预防性纵隔照射，因为该区域复发率极低。一部分病人由于发生放疗并发症的危险性较大及少数T1、T2病变的病人可不做放疗而选择单纯术后随访观察。两种方法对I期精原细胞瘤病人治愈率几乎均为100％。但未行辅助放疗的病人中15-20％会复发，中位复发时间为术后12个月，也有术后5年后复发的。复发后经化疗仍可治愈。

II期：睾丸切除术后应行膈以下包括主动脉旁和同侧髂血管旁淋巴结区放射治疗(35-40Gy)。不做预防性纵隔照射。如患者患有马蹄肾，则不适合放疗，按预后好的GCT给予化疗。

IIC和III期：IIC期患者有巨大腹膜后淋巴结转移，则按预后好的GCT行化疗(见后述危险因素分级)。化疗后根据影像学检查是否有肿瘤残存，分别采取观察随访、手术切除/活检或放射治疗。如选择手术，则不建议行腹膜后淋巴结清扫，因为在精原细胞瘤病人由于广泛纤维化而存在技术上的困难，可能导致严重的并发症。如CT提示病变进展则行解救治疗。III期或性腺外(如纵隔)精原细胞瘤病人则根据预后分级行化疗。除存在肺以外内脏转移者为中度危险以外，其他IIIC病人均为预后好的病人，约90％晚期可通过含顺铂方案治愈。

I期和IIA、IIB的放疗后复发：可按预后好的非精原细胞瘤给予3周期BEP或4周期EP方案化疗。治愈率90％左右。中等预后的病人(有肺以外内脏转移)给予4周期BEP或参加临床试验。化疗后，如果残存病灶大于3cm可考虑手术或放疗或随访观察。

最初关于GCT联合化疗的研究始于上世纪70年代，应用博来霉素(BLM)、长春花碱(VLB)和顺铂(DDP)的BVP方案治疗转移性GCT可使70-80％病人达完全缓解(CR)。但该方案伴随严重的近期和远期不良反应，包括神经毒性、骨髓抑制、肾毒性、耳毒性、BLM相关的肺毒性、VP16可能导致白血病、雷诺氏现象等。由于化疗的高有效性和严重的毒性，人们不断探索将病人进行分层，根据不同的预后特点给予相应的治疗，以避免过度治疗和治疗不足。研究发现疾病分期和血清标记物与预后有紧密关系，因此，曾将病人分为预后好和预后差两组。胃癌的早期症状最近又提出了国际生殖细胞肿瘤会议分类(国际生殖细胞肿瘤合作组，1997)，并将预后分组加入到生殖细胞肿瘤AJCC分期标准中。该分类将病人分为预后好、预后中等和预后差三类(见表1)。并将足叶乙甙(VP16)代替VLB的BEP方案使神经毒性发生率明显降低。

危险分级

精原细胞瘤-临床分期：

精原细胞瘤的病理类型与预后有关，肿瘤扩散的程度和转移的范围也影响着预后。故临床医生不仅要了解肿瘤的病理类型，而且要根据病变范围的不同来制定相应的治疗方案。因此确定每个患者病变分期是有实际意义的。当今最常采用的分期方法为：

Ⅰ期：肿瘤只局限于睾丸及附睾内，而尚未突破包膜或侵入精索，无淋巴结转移。

Ⅱ期：由体格检查、X线检查证实已有转移，可扩散到精索、阴囊、髂腹股沟淋巴结，但未超出腹膜后淋巴区域。转移淋巴结临床未能扪及者为Ⅱa期，临床检查扪及腹腔淋巴结者为Ⅱb期。

Ⅲ期：已有横膈以上淋巴结转移或远处转移。也有研究者把远处转移者归入Ⅳ期。

精原细胞瘤是最常见的纵隔恶性胚细胞瘤，占纵隔肿瘤的2％～4％，占纵隔恶性肿瘤的13％，占纵隔恶性生殖细胞肿瘤的50％。几乎都为青年男性，高峰发病年龄20－40岁，位于前纵隔，80％有症状。20％－30％的病人无症状，有症状的病人症状为胸痛、咳嗽、呼吸困难、咯血等，可以有嗜睡、体重减轻。10％～20％病人出现上腔静脉梗阻综合征。这些临床症状常与肿瘤对纵隔结构的压迫、侵犯有关。一部分精原细胞瘤生长在气管内，并局部扩展至邻近的纵隔和肺。一般纵隔精原细胞瘤经淋巴途径转移播散，亦可发生血行转移，骨骼和肺脏是最常转移的部位。

胸片多见巨大前纵隔肿瘤，有时可以发现肿瘤沿气管内生长。CT多为密度均匀的大包块，50％可见胸内转移或扩展超出前纵隔而不能手术。CT和MRI有助于确定肿瘤的范围、对纵隔结构的侵犯情况。首次就诊切除率低于25％。

应对所有患前纵隔肿瘤的年轻男性测定血α-FP、β-hCG水平。单纯的精原细胞瘤几乎均无AFP、hCG的升高，7％－10％有hCG升高，但常不超过100ng/ml，AFP不升高。CA125也可能为生物学标记。肿瘤组织的染色体分析可发现12号染色体上特征性等臂染色体，这对鉴别生殖细胞肿瘤和其他类型的肿瘤有助。

在精原细胞瘤的诊断上，目前主要通过标本取样的直接检测，该方法具有一定的滞后性，等到发现已经是疾病的后期，对于早期诊断没有意义，耽误了病情。而从分子水平诊断是目前癌症检测的常规方法，具有较早的发现性。但是目前，甲胎蛋白(AFP)，人绒毛膜促性腺激素β-亚基(HCG)和乳酸脱氢酶(LDH)用作TGCTs的诊断肿瘤标记(9)。然而，尚未鉴定出精原细胞瘤特异性肿瘤标记。目前尚未有内质网核信号转导蛋白2(ERN2)与精原细胞瘤相关性的报道。因此，本领域急需进一步开发检测精原细胞瘤高危人群和易感个体的方法及其试剂盒。

发明内容

针对上述现有技术，本申请的发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的进行了测定和分析，首次发现ERN2和精原细胞瘤易感性密切相关，可作为精原细胞瘤易感性检测或者早期诊断的分子标记，因此，本发明提供了一种用于检测精原细胞瘤易感性分子标记的引物及试剂盒，以及体外检测样品是否存在ERN2基因的单核苷酸多态性的方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种与精原细胞瘤易感性相关的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其与正常的ERN2基因相比，区别在于：第61位存在一个单核苷酸多态性：C>T，即第61位的碱基包括碱基C和碱基T两种情形，当为碱基C时，为正常的ERN2基因，当为碱基G时，为突变的ERN2基因。

一种用于检测精原细胞瘤的试剂盒，包括特异性引物，该引物为一对，具有SEQID NO:2和SEQ ID NO:3的序列，能够特异性的扩增ERN2基因的引物，能特异性地扩增出长度241bp。

进一步地，试剂盒还包括PCR反应液，PCR反应液由dNTP、Mg2+、Taq酶和Buffer组成。PCR反应液中各组分的用量关系为常规的，对所属领域技术人员而言是公知常识。

一种体外检测样品是否存在ERN2基因的单核苷酸多态性的方法，步骤如下:

(1)用ERN2基因特异性引物扩增样品的ERN2基因，得到扩增产物；所述引物为一对，具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的序列；

(2)对扩增产物进行序列测定，检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性:61C>T；该突变位置编号基于SEQ ID NO:1的序列。

一种对个体的精原细胞瘤易感性或患病风险进行检测或诊断的方法，步骤如下:

检测该个体的ERN2基因、转录本和/或蛋白，并与正常的ERN2基因、转录本和/或蛋白进行比较，存在差异就表明该个体精原细胞瘤的可能性高于正常人群。所述差异是指是否存在单核苷酸多态性:61C>T；该突变位置编号基于SEQ ID NO:1的序列。

本发明的用于检测精原细胞瘤易感性的分子标记、试剂盒及其方法，以及体外检测样品是否存在ERN2基因的单核苷酸多态性的方法，检测简单、准确、快速，特异性强，对于精原细胞瘤患者实施有效的早诊、早治和个体化防治具有重要意义。

具体实施方式

下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1ERN2基因突变的检测及与精原细胞瘤的关联分析

1.1研究对象

选取精原细胞瘤患者300例，2009年1月～2016年10月于苏州大学附属第一医院确诊治疗，临床资料从病历获得。年龄相似的对照300例，为体检中心体检健康人群。取受试人员外周血1.5ml，于-80℃冷藏保存。所有受试人员均按照苏州大学附属第一医院伦理委员会要求征得同意。

1.2 DNA提取

用常规酚氯仿法提取受试者外周血DNA，具体如下：

1)取1ml外周血，3-6℃1600g离心8-12min，将上清液于:4℃16000g离心8-12min后再取上清液；

2)取步骤1)中经16000g离心得到的上清液于离心管中，加等体积消化液和蛋白酶复合物，55-62℃孵育30min；

3)把步骤2)得到的样品在冰上冷却，然后加入NH₄AC沉淀蛋白，并充分混匀，5000g离心4-6min；

4)转移步骤3)上清液与0.8倍体积磁珠混悬液混合，室温孵育1min；

5)将步骤4)得到样品置于磁力架上静置吸附后，吸取上清；

6)将步骤5)得到的上清液与1.5倍体积磁珠混悬液室温孵育lOmin，置于磁力架上静置吸附后，弃掉上清液，用75％酒精洗涤2次，即得磁珠-目的DNA复合体。

7)采用DNA洗脱液，将步骤6)获得的磁珠-目的DNA复合体在DNA洗脱液中旋涡振荡，置于磁力架上静置，吸取上清液，得到目的DNA。

1.3引物、PCR扩增和测序

从GenBank下载ERN2基因组序列(GeneLocation：XM_011545712.2)，用primer premier5.0设计引物。具体引物详细信息见表2。

表2引物序列表

引物名称序列SEQIDNO：上游引物5'-CCGAACACAGTATACGGTCA-3'2下游引物5'-CAGGCCGTCCTGGTGCCAGG-3'3

PCR扩增条件：94℃3分钟，(94℃30秒，62℃25秒，72℃40秒)×32，72℃10分钟，10℃保温。PCR扩增产物为241bp。

PCR扩增产物送交上海生工生物技术公司测序，测序结果应用软件进行检验和分析，本实施经分析，发现存在以下SNP：61C>T。

1.4 SNP分型和关联分析

应用卡方(X²)检验对受试人员位点的分布进行统计分析；当一个单元格的期望个数少于5个时应用Fisher精确检验进行分析。所有P值均为双侧概率，当P<0.05时认为有显著统计学意义。应用无条件逻辑回归分析对基因型频率、等位基因频率和精原细胞瘤患病之间的相关性进行评估，计算其比值比(Odds>

结果发现SEQ ID NO：1中的61C>T位点与精原细胞瘤发病显著相关，其中加性遗传模型(C vs T)的P值为1.31x10^-8(OR＝2.94,95％CI(2.00,4.31))，显性遗传模型(C/C>-13(OR＝2.96,95％CI(2.92,3.98)),隐性遗传模型(C/C+C/T>-4(OR＝6.21,95％CI(2.14，18.00))。详细结果见表3。

表3 61C>T位点基因型及等位基因在精原细胞瘤组和健康对照组中的分布

实施例2

精原细胞瘤易感性检测试剂盒

由于SEQ ID NO：1中61C>T的突变与精原细胞瘤发表高度相关，因此可基于这个突变设计NER2基因特异性引物再以病人的DNA为模板进行扩展检测。制备一试剂盒(100人次)，试剂盒的组成为：上下游引物，dNTP，Mg2+，Taq酶，PCR buffer，反应体系为20微升。

抽取受试者外周血2ml(其中受试者为10例新鉴定的精原细胞瘤，2例对照健康人群)，常规方法提取DNA。利用精原细胞瘤易感性检测试剂盒进行PCR反应，PCR扩增条件：94℃3分钟，(94℃30秒，62℃25秒，72℃40秒)×32，72℃10分钟，10℃保温。PCR扩增产物为241bp。将反应产物进行测序，将测序结果利用Meglign 7.0和Chromas 2.33软件进行检验和分析。检测结果含有61C>T突变的受试者均为精原细胞瘤患者，2例对照没有检测到所述突变。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明做各种修改或改动，但这些改动或修改的等价形式同样落在本发明所限定的范围内。

序列表

<110> 苏州立豪生物科技有限公司

<120> 一种用于检测精原细胞瘤的试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 241

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

ccgaacacag tatacggtca ccatgcatga cccaagagcc ccagccctgc gctggaacac 60

tacctaccgc cgctactcag cgccccccat ggatggctca cctgggaaat acatgagcca 120

cctggcgtcc tgcgggatgg gcctgctgct cactgtggac ccaggaagcg ggacggtgct 180

gtggacacag gacctgggcg tgcctgtgat gggcgtctac acctggcacc aggacggcct 240

g 241

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

ccgaacacag tatacggtca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

caggccgtcc tggtgccagg 20