对多种食物抗原的IgG和IgA抗体和C1Q食物蛋白免疫复合物的同时表征

摘要

已经研发了用于精确地表征对食物过敏原的免疫反应性的组合物和方法，其中提供了测试表面，其将源自相同食物的不同食物抗原制品并入单独测试位点。这样涂覆的表面可以使用未加工的和烹饪的食物产生。使用一组这样的测试表面来表征特异性的IgG、IgA和/或C1q结合在测定对特定食物的免疫反应性和应答中提供了改进的灵敏度和精确性。

说明书

技术领域

本发明的领域是对食物过敏的分析，具体而言是对食物抗原的延迟的超敏反应。

背景技术

下面的描述包括在理解本发明中可能有用的信息。这不是承认本文提供的任何信息是现有技术或者与本要求保护的发明相关，或者明确或隐含引用的任何出版物是现有技术。

包括神经自身免疫性疾病在内的自身免疫性紊乱影响7-10％的世界人口。越来越多地，这些紊乱变得与通常消费食物的免疫反应性相关联。通常地，肠粘膜免疫系统通过对在膳食蛋白质和肽中发现的抗原以及共生菌诱导耐受性同时针对病原体运用免疫防御来维持免疫稳态。但是，“友好的”抗原物质的身体的正常耐受性可以被许多因素破坏。肠道屏障功能紊乱和与肠相关的屏障的破坏可以允许未消化的蛋白和肽进入循环。在这些情况下，这些食品物质的摄入可以导致IgG和IgA抗体的产生，其不仅针对各种食物抗原而且针对身体的自身组织(称为食物自身免疫反应性的现象)。这是由于在许多通常消费食物的氨基酸序列与在包括神经细胞在内的人组织中天然存在的许多蛋白质的氨基酸序列之间的同源性(其以不同程度存在)。作为在这些各种食物蛋白和不同靶组织抗原之间的这种抗原相似性或分子模拟的结果，未能检测食物免疫反应性可以最初导致自身免疫反应性的发展并可能导致自身免疫性(例如神经自身免疫性)疾病(Vojdani,2014a；Vojdani,2014b)。结果，食物免疫反应性受到越来越多的关注，这是由于它们增加的患病率和它们对健康和生活质量的副作用二者(Johnson等，2014；Vojdani等，2014c)。

本文指出的所有出版物通过引用被并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请具体地或单独地被指示通过引用并入。在并入的参考文献中的术语的限定或用途与本文提供的那个术语的限定不一致或相反的情况下，应用本文提供的那个术语的限定并且不应用参考文献中那个术语的限定。

免疫反应性的机制通常是双相的：急性反应在过敏原暴露之后立刻发生，然后是几个小时之后的晚期反应。在急性反应期间，由于IgE和/或IgG结合至各种细胞和介质——比如组胺和血小板活化因子(PAF)——由肥大细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞的释放，症状发生。晚期涉及炎性细胞因子——比如IL-4、IL-9、IL-33和TNF-α——和细胞——比如中性粒细胞和嗜酸性粒细胞——的流入(Ho等，2012)。在经典的延迟型食物免疫反应性中，针对各种食物抗原的高水平IgG、IgM或IgA的产生导致C1q结合至抗体，伴随在各种组织部位中形成免疫复合物和沉积免疫复合物。在对这些食物抗原的初始免疫反应之后，症状可以继续数天或甚至数周。

IgE、IgG、IgA或IgM在食物免疫反应性中起到各种作用(Mijayima等，1997)。IgE经由在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上高度表达的其高亲和力受体FcεRI起作用。IgG具有数种受体，其包括高亲和力FcγRI和FcγRIV受体以及低亲和力FcγRIIB和FcγRIII受体。所有这些受体在涉及过敏反应的数种类型的细胞上表达，所述细胞包括肥大细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。

在食物免疫反应性中涉及五种不同的途径(Mancardi等，2013；Smit等，2011；Strait等，2002)：

1.经典途径–包括IgE和其受体FcεRI、肥大细胞和组胺

2.旁路途径–由IgG1、FcγRIII、巨噬细胞和PAF途径介导

3.IgG-嗜碱性粒细胞-PAF途径

4.经由FcγRIV的IgG-中性粒细胞-PAF途径

5.IgG、IgM或IgA-免疫复合物中性粒细胞途径。

所有针对膳食成分的这些反应可以起因于口服耐受性的失败。

如上面所指出，肠粘膜免疫系统正常地维持免疫稳态，其由如下组成：维持对肠中无害或甚至有益分子的耐受性同时针对有害的病原体形成(mount)有效的和适合的免疫应答(Lim and Rowley,1982)。缺乏对食物抗原的应答以及随后下调全身免疫应答为口服耐受性所表征的。口服耐受性的失败可以导致对摄入食物的免疫反应性，具有可能地威胁生命的后果，比如过敏和自身免疫性(Tsuji and Kosaka,2008)。

当这些不同的作用机制未能控制摄入的抗原时，结果可以最初是对可溶性抗原的耐受的破坏，其活化针对食物抗原的分泌性和全身性免疫应答。免疫排斥机制不起作用的个体可以经历大分子的慢性吸收过多和发展自身抗体并且甚至自身免疫性疾病的倾向(Maul and Dichmann,2008)。出于该原因，诱导对实际食物抗原的IgG、IgM和IgA抗体以及免疫复合物形成并且甚至针对旁观抗原的交叉敏化可以具有临床意义。体外和体内实验研究二者都已经证明不被粘膜IgA应答平衡的IgG抗体可以增强旁观蛋白的上皮渗透(Brandtzaeg and Tolo,1997)。细菌毒素和各种食物抗原通过上皮细胞可以导致许多免疫性紊乱，包括自身免疫性。

针对膳食蛋白和肽的全身免疫反应的类型取决于抗原结构(例如，蛋白抗原、颗粒抗原、多糖、糖蛋白、糖脂或酶)和个体的基因组成。例如，针对膳食成分，一个人可以产生IgG而另一个人可以产生IgA或IgM抗体(Barnes,1995)。如果这些针对膳食抗原的IgG、IgM和IgA抗体没有被检测到，则结果可以是自身免疫性的发展，然后是自身免疫性疾病。

结果，在近几十年来，鉴定食物抗原中的目标肽已经取得了显著的进步，这些食物抗原与在自身免疫性疾病中涉及的自身抗原享有相似性(Baboonian等，1989；Baboonian等，1991；Lunardi等，1992；Lunardi等，2000；Ostenstad等，1995；Schrander等，1997)。富含甘氨酸的细胞壁蛋白肽(GRP)代表抗原肽序列的实例，该抗原肽序列能够在完全不同的和不相关的疾病中引起(prime)T和B细胞免疫应答。GRP是在豆类、水果、蔬菜和明胶中发现的遍在食物蛋白。其与核糖核蛋白、纤维胶原、细胞角蛋白和EBV核抗原-1(EBNA-1)——这些是与自身免疫性紊乱相关联的常见抗原——具有高度抗原相似性/同源性。

在富含甘氨酸的食物抗原和埃巴病毒以及自身免疫性疾病中涉及的各种组织抗原之间的这种抗原相似性可以导致交叉反应性抗体的产生。能够在患有食物免疫反应性和不同自身免疫性紊乱的患者中引发免疫应答的共同肽表位的发现导致在食物抗原、肠粘膜和全身免疫应答之间的可能关联的问题(Lunardi等，1992；Schrander等，1997)。针对GRP肽的血清IgG抗体在数种自身免疫性紊乱中和在食物过敏性患者中被检测到，并且能够与包括角蛋白、胶原和EBNA-1在内的自身抗原交叉反应(Lunardi等，2000)。该数据暗示在植物病毒和人中的高度系统发育地保守表位可以是易受感染的个体中自身免疫应答的原因。而且，这表明在明显趋异的(divergent)蛋白质之间的特定序列的抗原扩展(spreading)可以参与开始或扩增免疫应答中涉及，导致易受感染的个体的自身免疫性。

由特异于特定食物抗原表位的T细胞克隆介导的自身免疫应答可以在肠粘膜中发生。这样的T细胞可以被募集至特定部位，比如关节，在那里它们响应于源自滑膜蛋白的同源肽而增殖。在局部炎症和上调MHC分子之后，释放额外的自体抗原和/或表位扩展可以导致引起自身免疫性的器官炎症和破坏的慢性的自身延续的过程(Lunardi等，1992；Vojdani,2014a)。

识别食物免疫反应性和相关的健康问题——特别是对于小麦和牛奶，已经在过去的二十年内发展(Bousquet等，1998；Lack,2008；Zuidmeer等，2008)。许多具有刺激肠道T辅助细胞能力的谷蛋白肽已经在腹部疾病(CD)患者中被鉴定(Arentz-Hansen等，2000；Arentz-Hansen等，2002；Camarca等，2009；Tollefsen等，2006)。近来研究显示具有非腹腔谷蛋白敏感性(NCGS)和克罗恩疾病的患者对小麦抗原的所有组成成分(repertoire)反应并且产生针对它们的IgG和IgA。该所有组成成分包括各种肽，α-、γ-、ω-麦醇溶蛋白，麦谷蛋白，谷啡肽(gluteomorphin)和麦胚凝集素(Vojdani,2011)。连续暴露于环境因素，比如小麦不仅引起NCGS和腹部疾病，而且如果保持不治疗可以导致炎症和自身免疫性(Counsell等，1994；De Freitas等，2002；Gillett等，2001)。实际上，腹部疾病已经与多种自身免疫性紊乱相关联。在患有CD或NCGS的患者中检测到的自身免疫相关联的抗体的谱系表明交叉反应性和分子模拟在麦醇溶蛋白和各种组织抗原之间发生(Alaedini等，2007；Collin等，2002；Frustaci等，2002；Hadjivassiliou等，2004；Jacob等，2005；Natter等，2001；Pratesi等，1998；Reinke等，2011；Vojdani等，2004)。

许多研究已经专注于多发性硬化(MS)的患病率与乳制品消耗之间的关联，并且已经发现MS的发病率与牛奶的消耗相应(parallel)(Agranoff and Goldberg,1974；Butcher,1976；Kahana等，1994；Knox,1977；Malosse等，1992)。显著地，在被称为嗜乳脂蛋白(BTN)的乳脂肪球膜的主要蛋白与髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)之间发现高度序列同源性(Gardinier等，1992；Henry等，1999；Jack and Mather,1990)。

MOG(髓鞘少突胶质细胞糖蛋白)是在MS和其动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)——的致病性自身免疫应答中的主要抗原(Vojdani等，2002)。MOG是已知为诱导患有EAE的动物中的脱髓鞘自身抗体应答和致脑炎的(ecephalitogenic)CD4+T细胞应答二者的仅有的髓鞘自身抗原(Amor等，1994)。已经发现，作为与牛奶蛋白嗜乳脂蛋白(BTN)的细胞外IgV样结构域的免疫学交叉反应性(或“分子模拟”)的结果，对MOG的致脑炎的T细胞应答可以被诱导或者可选地被抑制。在大鼠中，利用天然BTN的主动免疫引起中枢神经系统中的炎性应答，其特征在于形成T细胞和巨噬细胞的分散的脑膜和血管周浸润物(Vojdani等，2002)。也已经发现该病理学由BTN——其与MOG肽序列交叉反应——的MHC II类限制性T细胞应答介导(Muthukumar M,等，2009)。

视神经脊髓炎(NMO)是影响脑和脊髓中灰质和白质的严重的神经自身免疫性紊乱，其导致脱髓鞘、轴突损伤和坏死，并最终导致受影响个体中的麻痹和感觉缺失(Jarius等，2008)。在75％的病例中，NMO与选择性地结合至水通道蛋白-4(AQP4)的IgG1抗体的存在相关联，水通道蛋白-4(AQP4)是属于水通道蛋白家族的水通道(Jarius等，2010；Kim等，2012)。AQP4在血脑屏障处的星形细胞足突中表达，这些星形细胞足突与脑微血管或蛛网膜下隙接触，影响溶质浓度、电活动以及神经传输和兴奋性的调节(Kinoshita等，2010)。在结合之后，AQP4特异性IgG1抗体具有如下能力：首先破坏星形细胞，然后引起脊髓和视神经的脱髓鞘(Bradl and Lassmann,2008)。IgG1与AQP4的结合还诱导补体级联系统和炎性浸润物——其在诱导星形细胞细胞毒性之后引起脱髓鞘和组织破坏——的活化。

近来已经暗示了AQP4的致病性抗体可以通过暴露于与AQP4的特异性表位具有相似性或分子模拟的环境蛋白而引起(Vaishnav等，2013)。有趣的是，菠菜叶表达表达两种热稳定的水通道蛋白，其组成20％的膜内在蛋白(Plasencia等，2011)。类似地，大豆在发芽种子中以及根瘤中表达水通道蛋白(Fleurat-Lassard等，2005)。还已经发现人AQP4可以与番茄和玉米液泡膜内在蛋白交叉反应(Vaishnav等，2013)。

也已经指出与NMO中的主要(primary)T细胞表位具有显著同一性的氨基酸序列在欧洲防风黄点病毒的潜在地免疫原性外壳蛋白中出现，其感染欧洲防风草、芹菜、胡萝卜、欧芹、香菜、山萝卜和莳萝。该表位也与存在于豆科苜蓿(legume M.truncatula)中的丝氨酸蛋白酶抑制剂中的序列共享显著的序列同一性(Vaishnav等，2013)。

显而易见的是还未被表征的食物的许多成分也可以具有引起自身免疫性的潜能。迄今为止，与食物免疫反应性相关联的大多数研究已经仅表征了研究的食物中存在的蛋白质和肽的水溶性群体。对此的一个例外是小麦，因为谷蛋白(小麦的醇溶性成分)已经在食物免疫反应性、交叉反应性和自身免疫性研究中使用。此外，补体的作用尚不清楚。

如上面所指出的，迄今为止，食物过敏原研究已经主要专注于检测对特异性抗原的免疫球蛋白的存在，并且尚未解决补体活化的问题。美国专利申请号2009/0010937(Chauhan)讨论了包括补体成分比如C1q的循环免疫复合物的检测，但是，讨论的方法利用免疫复合物的细胞受体来提供对于使用抗补体抗体的检测必需的固定化。因此，它们对这些复合物的抗原特异性提供很少至没有见解(insight)。美国专利号8,309,318(Dorval和Dantini)讨论了使用固定化抗原的包含结合C3b的过敏原特异性免疫复合物的检测。但是，已经证明了所谓的“无辜旁观者”IgG-C3b加合物可以在补体活化期间形成，这严重地限制了这样的方法在测定抗原特异性复合物的存在中的应用(Fries等，1984)。

因此，存在对于表征结合在食物中发现的更宽范围的抗原分子——与由在它们的天然状态下的水可提取(water-extractable)蛋白和肽所代表的相比——的抗体(例如，IgG、IgA、IgM和其它抗体类别)的系统、设备和方法的需要。此外，存在对表征与这样的抗体相关联的补体成分(例如C1q)的存在的系统、设备和方法的需要。

发明内容

本发明主题提供了装置、系统和方法，其中不同组的抗原分子使用多种独特的物理/化学方法从食物提取，包括碱溶性蛋白、醇溶性蛋白、水溶性蛋白、多糖、糖脂和糖蛋白。这些提取物中的每一种以规定的顺序被应用至相同的测试表面以提供多重涂覆的测试表面，其包括来自这些不同的提取物中的每一种的抗原。结合至这些抗原的IgG、IgA和C1q(以天然免疫球蛋白-C1q复合物的形式)通过如下鉴定：将测试表面暴露于样品，洗涤以去除多余的样品，和使暴露的测试表面与携带可检测标签比如酶的IgG和/或IgA的物种特异性抗体和C1q的抗体接触。结合的标签的表征表明IgG、IgA和/或C1q结合至存在于测试表面上的多种食物抗原中的至少一种的程度。

根据优选实施方式的下列详细描述连同附图，本发明主题的各个目标、特征、方面和优势将变得显而易见，在附图中相同的数字代表相同的成分。

附图描述

图1显示了使用本发明构思的测试表面生成的免疫应答的校准曲线。

图2显示了对本发明构思的测试表面进行IgG结合研究的结果。使用测试表面对第一个体表征IgG抗体结合，所述测试表面包括来自180种测试食物的不同的含抗原提取物。在0.5OD的分析截止之上的结果表明针对香蕉、菠萝、姜、香草、朝鲜蓟、芦笋、卷心菜、玉米、茄子、橄榄、咸菜、油炸土豆、海藻、小扁豆外源凝集素、美洲山核桃、蛋清和人造蟹肉，IgG显著升高。针对剩余的163种食物提取物的IgG免疫反应性低于0.4OD并且被视为阴性。

图3显示了C1q结合(经由天然免疫球蛋白-C1q复合物)至本发明构思的测试表面的分析的结果。使用测试表面对第一个体表征免疫球蛋白-C1q结合，所述测试表面包括来自180种测试食物的不同的含抗原提取物。在该实例中注意到，当C1q结合(经由天然免疫球蛋白-C1q复合物)被测量时，该复合物的水平针对当测量IgG时不为阳性的12种不同的新食物提取物显著升高。这些提取物是乳胶橡胶蛋白、大蒜、洋葱、豌豆外源凝集素、萝卜、水稻内切几丁质酶、食用色素、金枪鱼、虾、树胶和绿茶。还值得注意的是当如图2中所显示测量IgG的水平时，这些相同的12种食物的光密度低于0.5并且被视为阴性。

图4显示了IgG和C1q二者结合(经由天然免疫球蛋白-C1q复合物)至本发明构思的相同测试表面的分析的结果。使用测试表面对第一个体表征IgG和C1q结合，所述测试表面包括来自180种测试食物的不同的含抗原提取物。当测量IgG或C1q时为反应性的所有食物提取物(如图2和3中所示)变得高度反应性。对于剩余的151种食物，光密度低于0.5并且被视为阴性。

图5显示了对本发明构思的测试表面进行IgG结合研究的结果。使用测试表面对第二个体表征IgG抗体结合，所述测试表面包括来自180种测试食物的不同的含抗原提取物。在0.5OD的分析截止之上的结果表明IgG的显著升高。鉴定出对180种食物抗原提取物中的10种的显著IgG结合。

图6显示了来自第二个体的C1q结合(经由天然免疫球蛋白-C1q复合物)至本发明构思的测试表面的分析的结果。使用测试表面表征C1q结合，所述测试表面包括来自180种测试食物的不同的含抗原提取物。在0.5OD的分析截止之上的结果表明C1q的显著升高。对14种食物抗原提取物，鉴定出显著的C1q结合(经由天然免疫球蛋白-C1q复合物)，其中的11种对C1q是唯一的。

图7显示了来自第二个体的IgG和C1q二者结合(经由天然免疫球蛋白-C1q复合物)至本发明构思的相同测试表面的分析的结果。使用测试表面对第二个体表征IgG和C1q结合，所述测试表面包括来自180种测试食物的不同的含抗原提取物。在组合中，对21种食物抗原提取物，鉴定出显著的IgG和C1q结合，这代表在该个体的单独IgG和C1q研究中鉴定出该食物抗原提取物。

图8描绘了一个表格，其显示来自个体的血清IgG和IgA结合至使用商业可得的食物抗原制品由不同的食物制备的一组测试表面和使用本发明构思的方法制备的测试表面。显示了每种食物的单独抗原制品、顺序涂覆有来自食物的所有食物抗原制品的测试表面、和顺序涂覆有源自相同食物的所有食物抗原制品在热处理之后的测试表面的结果。

图9描绘了一个表格，其显示在图8中示出的食物抗原组的延伸。

图10描绘了一个表格，其显示在图8和9中示出的食物抗原组的延伸。

图11描绘了一个表格，其显示在图8、9和10中示出的食物抗原组的延伸。

具体实施方式

提供了用于表征对食物抗原的抗体的存在和结合至食物抗原的C1q-抗体复合物的存在的系统、设备和方法。使用提取来自各种食物的水溶性蛋白、醇溶性蛋白、碱溶性蛋白、糖脂、多糖和糖蛋白以及它们的热变性形式的方法制备食物食物抗原提取物。当以顺序方式应用至共同的测试表面时，提供了测试表面，该测试表面与现有技术方法相比提供远远更多种的食物抗原。出人意料地，发现使用顺序添加和抗原提取物被应用的顺序为对产生这样的复合测试表面是必要的。

此外，已经发现，当暴露于多个测试表面——其每个包含来自不同食物来源的食物抗原提取物——时，IgG和天然免疫球蛋白-C1q复合物(即，在个体内形成的免疫球蛋白-C1q复合物)显示了不同的结合概况(profile)。还发现，表征同时结合至相同测试表面的IgG/IgA和C1q二者(以天然免疫球蛋白-C1q复合物的形式)提供了与由单独测试IgG和C1q结合获得的结果相应的概况，有利地，使用减少数目的测试表面和分析步骤提供了食物抗原的更完整的免疫反应性概况。

在一些实施方式中，用于描述和要求保护本发明的某些实施方式的数字——其表达成分的数量，性质比如浓度、反应条件等——应当被理解为在一些情况下通过术语“大约”修饰。因此，在一些实施方式中，在书面描述和所附权利要求书中陈述的数值参数是近似值，其可以根据由具体实施方式寻求获得的期望性质而改变。在一些实施方式中，数值参数应当鉴于报道的有效数字的数目并通过应用普通的四舍五入技术来解释。虽然陈述本发明的一些实施方式的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在特定实施例中陈述的数值尽可能精确地被报道。在本发明的一些实施方式中呈现的数值可以包含由在它们各自的测试测量中发现的标准偏差造成的不可避免的某些误差。

如在本文说明书和整个所附权利要求书中所使用的，“一个(a,an)”和“所述(the)”的含义包括复数参考对象，除非上下文另外明确规定。而且，如在本文说明书中所使用的，“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”，除非上下文另外明确规定。

除非上下文规定相反，本文陈述的所有范围应当被解释为包含它们的端点，并且开放式范围应当被解释为仅包含商业实际值。类似地，值的所有列举应当被视为包含中间值，除非上下文规定相反。

叙述本文值的范围仅仅意欲充当单独引用落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非在本文中另有规定，范围内的每个单独值被并入本说明书，如同其单独地在本文中被叙述一样。本文描述的所有方法可以以任何适合的顺序执行，除非本文另有规定或者上下文另外明确地矛盾。关于本文的某些实施方式提供的任何和所有实例，或示例性语言(例如，“比如”)的使用仅仅意欲更好地阐明本发明并且不对在另外要求保护的本发明的范围造成限制。在说明书中的语言不被解释为指明对实践本发明必不可少的任何非要求保护的要素。

如本文所使用，并且除非上下文另有规定，术语“连接至”意欲包括直接连接(其中彼此连接的两个元件彼此接触)和间接连接(其中至少一个额外的元件位于这两个元件之间)二者。因此，术语“连接至”和“与……连接”同义地使用。

本文公开的发明的可选要素或实施方式的分组不被解释为限制。每个组成员可以单独或与该组的其它成员或者本文发现的其它要素任意组合进行引用并要求保护。出于便利和/或可专利性的原因，组的一个或多个成员可以包含在组中或者从组中删除。当任何这样的包含或删除发生时，说明书在本文中被认为包含被修改而因此满足在所附权利要求书中所使用的所有马库什组的书面描述的组。

下面的讨论提供了本发明主题的许多实例实施方式。虽然每个实施方式代表发明要素的单一组合，但是发明主题被视为包含所公开的要素的所有可能的组合。因而，如果一个实施方式包括要素A、B和C，且第二实施方式包括要素B和D，则发明主题也被视为包括A、B、C或D的其它剩余的组合，即使其没有被明确公开。

在本发明构思的一些实施方式中，食物成分可以被分类为常规组，其包括乳制品和蛋类(改性的)、谷物(未加工的和改性的)、豆类和豆科植物(改性的)、坚果和种子(未加工的和改性的)、蔬菜(未加工的和改性的)、水果(未加工的和改性的)、鱼和海鲜(未加工的和改性的)、肉(改性的)、草本植物(未加工的)、调味料(未加工的)、树胶、以及酿造饮料和添加剂。改性的食物可以反映通常在消费之前实施的制备步骤，例如煮沸、烘焙和/或油炸。

“乳制品和蛋类”可以包括蛋清，烹饪的(煮熟的)；蛋黄，烹饪的(煮熟的)；山羊奶；软质奶酪和硬质奶酪；和酸乳。“谷物，未加工的和改性的”可以包括水稻，白色的和褐色的，烹饪的(煮熟的)；米糕；米蛋白；水稻内切几丁质酶；野生稻，烹饪的(煮熟的)；和小麦+α-麦醇溶蛋白。

“豆类和豆科植物，改性的”可以包括黑豆，烹饪的；豆凝集素；黑巧克力和可可；蚕豆，烹饪的(煮熟的)；鹰嘴豆，烹饪的(煮熟的)；云豆，烹饪的(煮熟的)；小扁豆，烹饪的(煮熟的)；小扁豆外源凝集素，(煮熟的)；利马豆，烹饪的(煮熟的)；斑豆，烹饪的(煮熟的)；大豆凝集素；大豆油质蛋白+水通道蛋白；酱油，不含谷蛋白；和豆腐。

“坚果和种子，未加工的和改性的”可以包括杏仁；杏仁，烤的；巴西坚果，未加工的和烤的；腰果；腰果，烤的；腰果，豌豆球蛋白；奇异子；亚麻子；榛子，未加工的和烤的；澳洲坚果，未加工的和烤的；芥末子；美洲山核桃，未加工的和烤的；花生，烤的；花生酱；花生凝集素；花生油质蛋白；开心果，未加工的和烤的；南瓜子，烤的；芝麻白蛋白；芝麻油质蛋白；葵花子，烤的；和核桃。

“蔬菜，未加工的和改性的”可以包括朝鲜蓟，烹饪的(煮熟的)；芦笋；芦笋，烹饪的(煮熟的)；甜菜，烹饪的(煮熟的)；灯笼椒；西兰花；西兰花，烹饪的(煮熟的)；球芽甘蓝，烹饪的(煮熟的)；卷心菜，红色的+绿色的；卷心菜，红色的+绿色的(煮熟的)；油菜油质蛋白；胡萝卜；胡萝卜，烹饪的(煮熟的)；菜花，烹饪的(煮熟的)；芹菜；红辣椒；玉米，烹饪的(煮熟的)；玉米水通道蛋白；爆粒玉米；玉米油质蛋白；黄瓜，腌制的；茄子，烹饪的(煮熟的)；大蒜；大蒜，烹饪的(煮熟的)；青豆，烹饪的(煮熟的)；生菜；蘑菇，未加工的和烹饪的(煮熟的)；秋葵，烹饪的(煮熟的)；橄榄，绿色的和黑色的，腌制的；洋葱和/或青葱；洋葱和/或青葱，烹饪的(煮熟的)；豌豆，烹饪的(煮熟的)；豌豆蛋白；豌豆外源凝集素；土豆，白色的，烹饪的(烘焙的)；土豆，白色的，烹饪的(油炸的)；南瓜和/或南瓜属植物，烹饪的(烘焙的)；萝卜；红花和/或向日葵油质蛋白；海藻；菠菜；菠菜水通道蛋白；番茄；番茄水通道蛋白；番茄酱；山药和/或甘薯，烹饪的(烘焙的)；和西葫芦，烹饪的(煮熟的)。

“水果，未加工的和改性的”可以包括苹果；苹果汁；杏；鳄梨；香蕉；香蕉，烹饪的(煮熟的)；乳胶橡胶蛋白；蓝莓；哈密瓜和/或甜瓜；樱桃；椰子，肉和/或水和/或奶；蔓越橘；枣椰子；无花果；葡萄，红色的+和绿色的；红葡萄酒；白葡萄酒；葡萄柚；猕猴桃；柠檬和/或青柠；芒果；橘子；橘子汁；木瓜；桃子和/或油桃；梨；菠萝；菠萝蛋白酶；李子；石榴；草莓；和西瓜。

“鱼和海鲜，未加工的和改性的”可以包括鳕鱼，烹饪的(烘焙的)；大比目鱼，烹饪的(烘焙的)；鲭，烹饪的(烘焙的)；红鲷鱼，烹饪的(烘焙的)；大马哈鱼；大马哈鱼，烹饪的(烘焙的)；沙丁鱼+凤尾鱼，烹饪的(烘焙的)；海鲈鱼，烹饪的(烘焙的)；罗非鱼，烹饪的(烘焙的)；鳟鱼，烹饪的(烘焙的)；金枪鱼；金枪鱼，烹饪的(煮熟的)；白鱼，烹饪的(烘焙的)；螃蟹+龙虾，烹饪的(煮熟的)；人造蟹肉，烹饪的(煮熟的)；蛤，烹饪的(煮熟的)；牡蛎，烹饪的(煮熟的)；扇贝，烹饪的(煮熟的)；乌贼(鱿鱼)，烹饪的(煮熟的)；虾，烹饪的(煮熟的)；虾原肌球蛋白；和小清蛋白。

“肉，改性的”可以包括牛肉，烹饪半熟的(煮熟的)；鸡肉，烹饪的(煮熟的)；羔羊肉，烹饪的(煮熟的)；猪肉，烹饪的(煮熟的)；火鸡肉，烹饪的(煮熟的)；明胶；和肉胶(煮熟的)。

“草本植物，未加工的”可以包括罗勒属植物、香菜、小茴香、莳萝、薄荷、牛至、欧芹、迷迭香和百里香。

“调味料，未加工的”可以包括肉桂、丁香、姜、肉豆蔻、辣椒粉、姜黄(姜黄色素)和香草。

“树胶”可以包括β-葡聚糖、角叉菜胶、瓜尔胶、黄蓍胶、槐树豆胶、乳香胶+阿拉伯树胶和黄原胶。

“酿造饮料和添加剂”可以包括咖啡豆蛋白，酿造的；红茶，酿造的；绿茶，酿造的；蜂蜜，未加工的和加工的；和食用色素，人造的。

在提取之前，食物可以被处理以增加提取工艺可利用的表面积。例如，食品物质可以通过浸解、切碎、研磨、磨碎、超声处理和/或挤出减小为微粒。在本发明构思的优选实施方式中，待要被提取的食物最初被冷冻，例如使用液氮进行。冷冻的食物然后被研磨或磨碎，例如使用商业搅拌器或研磨机进行。

除了在减小食物颗粒大小中具有应用之外，超声处理还可以被采用来溶解细胞和提高提取期间食物抗原的释放。这样的超声处理可以使用超声波浴实施：通过将超声变幅杆(horn)或者探针插入提取悬浮液，或者通过经过流通型超声处理设备。

多种方法适合于从食物提取水溶性蛋白(例如，白蛋白)。在利用水或基本上中性的(即，pH为6.5到7.5)缓冲液提取之前，食物可以如上面所指出的被减小为微粒。然后，食物可以在适合温度的水或者基本上中性的缓冲溶液中悬浮。在一些实施方式中，抑制蛋白酶活性的化合物，比如EDTA、PMSF和/或胃酶抑制剂可以包含在用于提取的溶液中。在其它实施方式中，用于提取的溶液中可以包含表面活性剂，比如4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、聚乙二醇失水山梨糖醇单月桂酸酯、正十二烷基-β-D-麦芽甙(maltoside)、烷基酚乙氧基化物和十二烷基硫酸钠。适合的提取温度可以在4℃到95℃的范围内，因为其适合于正在被处理的具体食物。类似地，最佳提取所需要的时间可以取决于食物、颗粒大小和水可提取蛋白抗原的性质。适合的提取时间可以在30分钟到48小时的范围内。在提取之后，残余的固体可以通过沉降和倾析、离心、过滤或这些的组合来移出。在提取和移出提取的固体之后，水溶性蛋白抗原制品可以被转移至适合的结合缓冲液，或者可选地可以在使用之前储存。水溶性蛋白抗原制品可以被冻干以便储存，在降低的温度下以液体形式储存，或者在使用之前冷冻储存。在一些实施方式中，添加剂比如甘油可以被加入至水溶性蛋白抗原制品以允许在低于0℃的温度下液态储存。

多种方法适合于从食物提取碱溶性蛋白。在利用碱溶液提取之前，食物可以如上面所指出的被减小为微粒。然后，食物可以在适合温度的碱性(即，pH大于或等于大约8)溶液中悬浮。在本发明构思的优选实施方式中，这样的碱性溶液可以具有大于或等于大约10的pH。这样的碱性溶液可以通过将碱式盐加入至水中来制备。适合的碱式盐包括NaOH、KOH、Ca(OH)₂、Na₂CO₃、NaHCO₃、Na₂HPO₄、K₂CO₃、KHCO₃、Ca(HCO₃)₂、CaCO₃和其组合。可选地，适合的碱性缓冲液可以使用缓冲液比如CAPS、CAPSO、Tris和/或甘氨酸来制备。在本发明构思的其它实施方式中，这样的碱性溶液可以具有大于或等于大约9的pH。在本发明构思的一些实施方式中，这样的碱性溶液可以具有大于或等于8的pH。在一些实施方式中，抑制蛋白酶活性的化合物，比如EDTA、PMSF和/或胃酶抑制剂可以包含在用于提取的碱性溶液中。在其它实施方式中，用于提取的碱性溶液中可以包含表面活性剂，比如4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、聚乙二醇失水山梨糖醇单月桂酸酯和十二烷基硫酸钠。适合的提取温度可以在4℃到95℃的范围内，因为其适合于正在被处理的具体食物。类似地，最佳提取所需要的时间可以取决于食物、颗粒大小和碱可提取蛋白抗原的性质。适合的提取时间可以在30分钟到48小时的范围内。在提取之后，残余的固体可以通过沉降和倾析、离心、过滤或这些的组合来移出。在提取和移出提取的固体之后，碱溶性蛋白抗原制品可以被转移至适合的结合缓冲液，或者可选地可以在使用之前储存。碱溶性蛋白抗原制品可以被冻干以便储存，在降低的温度下以液体形式储存，或者在使用之前冷冻储存。在一些实施方式中，添加剂比如甘油可以被加入至水溶性蛋白抗原制品以允许在低于0℃的温度下液态储存。

多种方法适合于从食物提取醇/有机溶性蛋白。在利用醇或其它有机溶剂提取之前，食物可以如上面所指出的被减小为微粒。然后，食物可以在醇或其它适合的有机溶剂的水溶液中悬浮。适合的醇类包括甲醇、乙醇、丙醇和其混合物。其它适合的有机溶剂至少可与水混溶，并且包括DMSO、DMF和甘油。适合的提取温度可以在4℃到95℃的范围内，因为其适合于正在被处理的具体食物。类似地，最佳提取所需要的时间可以取决于食物、颗粒大小和水可提取蛋白抗原的性质。适合的提取时间可以在30分钟到48小时的范围内。在提取之后，残余的固体可以通过沉降和倾析、离心、过滤或这些的组合来移出。在提取和移出提取的固体之后，醇/有机溶性蛋白抗原制品可以被转移至适合的结合缓冲液，或者可选地可以在使用之前储存。醇/有机溶性蛋白抗原制品可以被冻干以便储存，在降低的温度下以液体形式储存，或者在使用之前冷冻储存。在一些实施方式中，添加剂比如甘油可以被加入至水溶性蛋白抗原制品以允许在低于0℃的温度下液态储存。

多种方法适合于从食物提取糖脂。在提取之前，食物可以如上面所指出的被减小为微粒。含脂质的部分可以使用有机溶剂或有机溶剂混合物——比如氯仿、甲醇、吡啶或其混合物——从食物提取。糖脂可以使用离子交换层析从提取的脂质混合物分离，例如使用DADE取代的层析介质，并用有机溶剂/盐水溶液混合物(比如混合有氯仿/甲醇混合物的乙酸钠)洗脱。在一些实施方式中，超声处理可以在该提取期间实施。在一些实施方式中，洗脱的糖脂可以使用碱性溶液水解，然后中和。所得到的盐可以通过适合的脱盐工艺——比如凝胶过滤、疏水作用层析和/或反相层析——去除。适合的提取温度可以在4℃到95℃的范围内，因为其适合于正在被处理的具体食物。类似地，最佳提取所需要的时间可以取决于食物和颗粒大小。适合的提取时间可以在30分钟到48小时的范围内。在提取之后，残余的固体可以通过沉降和倾析、离心、过滤或这些的组合来移出。在提取和移出提取的固体之后，糖脂抗原制品可以被转移至适合的结合缓冲液，或者可选地可以在使用之前储存。糖脂可以被蒸发至干燥、冻干、在降低的温度下以液体形式储存或者在使用之前冷冻储存。在一些实施方式中，添加剂比如甘油可以被加入至糖脂制品以允许在低于0℃的温度下液态储存。

多种方法适合于从食物提取多糖。在提取之前，食物可以如上面所指出的被减小为微粒。含多糖的部分可以通过酶消化例如使用纤维素酶从食物提取。在适合的时间段之后，酶活性可以被停止，例如通过煮沸提取混合物进行。在这之后，蛋白质(包括加入的酶)可以通过沉淀从多糖抗原制品去除。可以使用挥发性有机溶剂比如氯仿、丁醇或其混合物便利地沉淀蛋白质。适合的提取温度可以在4℃到100℃的范围内，因为其适合于正在被处理的具体食物。类似地，最佳提取所需要的时间可以取决于食物和颗粒大小。适合的提取时间可以在30分钟到48小时的范围内。在提取之后，残余的固体可以通过沉降和倾析、离心、过滤或这些的组合来移出。在提取和移出提取的固体之后，多糖抗原制品可以被转移至适合的结合缓冲液，或者可选地可以在使用之前储存。多糖可以被蒸发至干燥、冻干、在降低的温度下以液体形式储存或者在使用之前冷冻储存。在一些实施方式中，添加剂比如甘油可以被加入至多糖制品以允许在低于0℃的温度下液态储存。

出于本申请的目的被理解为对糖具有亲和力的蛋白质的糖蛋白抗原可以通过多种方法从食物提取。在提取之前，食物可以如上面所指出的被减小为微粒。含糖蛋白的部分可以通过例如亲和层析或特定的沉淀剂从食物提取。在亲和层析方法中，从食物获得的蛋白质部分被应用至层析介质，该层析介质包括能够与糖蛋白相互作用的固定的糖类或多糖组。结合的糖蛋白可以随后从介质通过应用适合的糖——比如葡萄糖、半乳糖、甘露糖或其衍生物——的溶液洗脱。特定的沉淀剂可以包括包含糖部分和难溶性有机部分的化合物。这样的化合物的结合可以在适当的缓冲液条件下(例如，在二价阳离子存在下)引起糖蛋白沉淀。这样沉淀的糖蛋白可以通过例如裂解沉淀剂以释放难溶性有机部分然后脱盐步骤(上面提供了其几个实例)来回收。适合的提取温度可以在4℃到95℃的范围内，因为其适合于正在被处理的具体食物。类似地，最佳提取所需要的时间可以取决于食物和颗粒大小。适合的提取时间可以在30分钟到48小时的范围内。在提取之后，残余的固体可以通过沉降和倾析、离心、过滤或这些的组合来移出。在提取和移出提取的固体之后，糖蛋白抗原制品可以被转移至适合的结合缓冲液，或者可选地可以在使用之前储存。糖蛋白可以被冻干，在降低的温度下以液体形式储存，或者在使用之前冷冻储存。在一些实施方式中，添加剂比如甘油可以被加入至糖蛋白制品以允许在低于0℃的温度下液态储存。

如上面所指出，在一些实施方式中，期望的是将提取的抗原制品从一种缓冲液转移至另一种，例如从一种加工缓冲液转移到另一种或者从储存缓冲液转移到适合于将抗原附接至固相的缓冲液。这样的缓冲液转移可以通过使用具有保留提取抗原的排阻限的透析膜针对新缓冲液的透析来完成。可选地，缓冲液可以使用尺寸排阻层析针对适合的层析介质而改变。在仍其它实施方式中，缓冲液可以通过使用挥发性添加剂的沉淀、沉淀物的收集和干燥、和在期望缓冲液中的再增溶而更换。

为了在抗体和C1q结合分析中使用，提取的抗原被连接至固相。在本申请的背景下，术语“固相”包括不溶的悬浮相，比如颗粒和微粒。这样的微粒可以例如通过颗粒大小和/或染料的并入来编码以允许区分颗粒群(例如，与源自具体食物的抗原相关联的颗粒)。这样的编码可以允许在单一、多路分析内的同时测定。典型的固相包括但不限于微孔板、微孔板条(microwell strip)、微阵列、多孔或纤维材料、吸管端、珠和微粒。这样的连接可以是共价的(即，利用提取抗原与固相的分子之间的共价键)或者非共价的。在本发明构思的优选实施方式中，固相是微孔板或微孔板条的孔的内表面的至少一部分。这样的微孔可以由任何适合的材料构成，所述材料包括聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯和聚乙烯。在本发明构思的一些实施方式中，微孔表面已经被化学地或物理地修饰(例如，通过形成纹理)以加强结合。

用于检测来自样品的抗体和/或C1q与固定化食物抗原之间的复合物的形成的分析可以是免疫分析。这样的免疫分析可以是间接的(即竞争性的)或直接的(即“夹心”分析)，并且可以利用任意适合的可检测的标记(例如，荧光部分、生色部分、质量标记、放射性部分和/或酶)。在本发明构思的优选实施方式中，分析是利用酶标记比如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的直接免疫分析。应当理解，虽然多于一种特异性抗体(例如，抗物种IgG(anti-species IgG)、抗物种IgA和/或抗C1q)可以被应用至单一测试表面，但是可以对于所有使用共同的标记。

在本发明构思的一些实施方式中，如上面描述的来自抗原制品的抗原通过吸附被贴附于固体测试表面。本发明构思的测试表面包括从至少两种不同的抗原提取物——从单一食物来源通过不同方法制备——获得的抗原。在一些实施方式中，测试表面包括从单一食物来源通过不同方法制备的至少三种不同的抗原提取物。在其它实施方式中，测试表面包括从单一食物来源通过不同方法制备的至少四种不同的抗原提取物。在仍其它实施方式中，测试表面包括从单一食物来源通过不同方法制备的至少五种不同的抗原提取物。在优选的实施方式中，测试表面包括从单一食物来源通过不同方法制备的至少六种不同的抗原提取物。

在本发明构思的优选实施方式中，如上面描述制备的抗原制品以顺序的逐步方式被吸附至测试表面，在添加之间去除未结合的物质。例如，由食物制备的抗原制品可以被应用至测试表面持续足以允许吸附的时间段。这样的时间段可以在0.5到48小时的范围内，并且可以在4℃到50℃的温度范围下执行。然后在吸附源自相同食物的第二、不同的抗原制品之前，例如通过用移液管吸移去除未结合的材料。任选地，测试表面可以被洗涤，然后将其与第二和/或随后的抗原制品接触。这样的洗涤可以使用可以包括表面活性剂的洗涤缓冲液执行。适合的表面活性剂包括聚氧乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯(吐温20)、聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)、4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇(Triton X-100)、和/或辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇(Nonidet P40)。该过程可以利用来自相同食物的额外的(例如，三、四、五或六种)食物抗原制品重复以产生顺序涂覆的测试表面。

出人意料地，尽管事先暴露于抗原制品和含表面活性剂的洗涤缓冲液，但是已经发现许多共同的测试表面(例如聚苯乙烯微孔)保留吸附额外的抗原物质的能力。在应用最终抗原制品之后，测试表面的剩余吸附位点可以通过应用封闭缓冲液来封闭。这样的封闭缓冲液可以包含一种或多种蛋白质(即封闭蛋白)，其占据测试表面的残余吸附或连接位点但是不提供与其它分析成分的显著相互作用。适合的封闭蛋白的实例包括血清白蛋白、卵清蛋白、明胶、乳蛋白和来自适合物种的非特异性免疫球蛋白。

出人意料地，本发明人已经发现包括多种抗原提取物的测试表面不能通过在应用至测试表面之前混合这样的抗原提取物来有效地产生。这样的混合物被证明是不稳定的，导致形成沉淀物，其在应用至测试表面之前去除至少一些抗原化合物。由于损失这样的抗原可能导致该具体食物的假阴性结果，因此这是高度不期望的。出人意料地，本发明人已经发现了顺序地应用食物抗原制品至测试表面产生了在其中存在更多种类的食物抗原的测试表面。在本发明构思的一些实施方式中，食物抗原制品以特定顺序被添加。例如，多种食物抗原制品可以以下面的顺序成功地被应用：首先碱溶性蛋白，然后醇溶性蛋白，然后水溶性蛋白，然后多糖，然后糖脂，并且最终糖蛋白。在本构思的其它实施方式中，不同顺序的添加可以是适合的，条件是不同的抗原制品以分开的、独特的步骤被应用至测试表面。还应当理解，在一些实施方式中，上面讨论的一种或多种食物抗原制品可以从涂覆过程省略。

实施例

实施例1：从不同食物提取蛋白质

从不同食物来源提取水溶性、醇溶性和碱溶性蛋白的适合方法如下：

步骤1–对于每种蛋白抗原制品，在三种不同溶剂/缓冲液(命名为A、B和C)中的一种中研磨或磨碎2克干豆、坚果、种子和调味料或者20克湿水果或蔬菜：

A.对于水溶性蛋白，100mL的0.1M PBS(pH 7.2)

B.对于醇溶性蛋白，100mL的70％乙醇

C.对于碱溶性蛋白，100mL的0.1M KOH(pH 10.0)。

步骤2–应用2到5分钟的超声处理以便于溶解细胞。添加2mL的洗涤剂(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇或正十二烷基-β-D-麦芽甙)和重复超声处理持续另外的2-5分钟。

步骤3–搅拌混合物2小时，然后在10,000g下离心每种制品持续15分钟。移出上清液。

步骤4–将每种上清液转移至单独的透析袋(6,000道尔顿MW截止)和针对特定溶剂透析。例如，对于溶于PBS中的蛋白抗原的溶液，透析应当针对PBS进行。类似地，对于利用KOH提取的蛋白抗原，透析应当针对0.1M KOH进行。

步骤5–在透析48小时之后，收集透析的溶液并在14,000g下离心15分钟。样品可以被移出以便测量蛋白质浓度；剩余的蛋白抗原制品可以在-20℃下储存直到需要在免疫学分析中使用。

实施例2：从不同食物提取糖脂

从不同食物来源提取糖脂的适合方法如下：

步骤1–在100mL水中研磨或磨碎2克干豆、坚果、种子和调味料或者20克湿水果或蔬菜。

步骤2–应用2到5分钟的超声处理以溶解细胞。

步骤3–添加120mL的氯仿：甲醇(2:1，v:v)并重复超声处理。

步骤4–添加600μl吡啶并在50℃下培育混合物24小时以提取单纯的脂质、磷脂和糖脂。

步骤5–应用氯仿：甲醇提取物至DEAE基离子交换介质；然后利用氯仿：甲醇：乙酸钠(1:2:1，v:v:v)从柱中洗脱糖脂。

步骤6–利用0.1N氢氧化钠/甲醇溶液水解洗脱的糖脂，使用乙酸中和，然后通过结合并随后从C-18反相柱洗脱而脱盐。

步骤7–在氯仿：甲醇(2:1,v:v)中溶解脱盐的糖脂。

步骤8–在55℃下使用旋转蒸发仪从溶解的糖脂去除有机溶剂。该干燥的物质可以在-20℃下储存。

步骤9–为了使用，将糖脂悬浮在70％甲醇中并在室温下超声处理2分钟。

实施例3-从不同食物制备多糖

由水果、蔬菜或豆类产生多糖的适合方法如下。

步骤1–在100mL水中研磨或磨碎2克干豆、坚果、种子和调味料或者20克湿水果或蔬菜。

步骤2–应用2到5分钟的超声处理以便于溶解细胞。

步骤3–添加100mg的纤维素酶并在37℃下培育4小时。

步骤4–增加温度至100℃并培育60分钟。

步骤5–在10,000g下离心15分钟并保留上清液。

步骤6–添加4:1的氯仿：丁醇(4:1，v:v)以去除游离的蛋白质——包括纤维素酶。

步骤7–通过添加4体积的95％乙醇从去蛋白溶液沉淀多糖，然后在100mL水中重溶解沉淀物。

步骤8–使用葡萄糖作为标准物测定中性糖含量(例如，通过Dubois等，1956的苯酚-硫酸比色法)，并进一步表征单糖组成(例如，通过Sheng等2017的方法)。多糖制品可以在-20℃下储存直到需要在免疫学分析中使用。

实施例4-从不同食物提取糖蛋白

从不同食物来源提取糖蛋白的适合方法如下。

步骤1–在搅拌器中研磨或磨碎100克水果、蔬菜、豆类、豆科植物、坚果、种子、调味料、草本植物、乳制品、蛋类、肉、海鲜、树胶或饮料。

步骤2–添加100mL的2％(w/v)CaCl₂和均化5分钟。

步骤3–应用3分钟的超声处理以便于溶解细胞。

步骤4–在室温下搅拌混合物2小时，然后在10,000g下离心溶液持续30分钟。保留上清液。

步骤5–添加包含120mg 1,3,5-P-β-D-半乳糖基-氧偶氮酚(oxyphenazo))2,4,6-三羟基苯的120mL 2％(w/v)CaCl₂并搅拌1小时以便于沉淀糖蛋白。

步骤6–通过在2,000g下离心10分钟收集包含糖蛋白的沉淀物。

步骤7–在15mL蒸馏水中溶解沉淀物。

步骤8–添加溶解在5mL蒸馏水中的250mg的焦亚硫酸钠以还原重氮键。

步骤9–紧密地盖上包含糖蛋白的管并在50℃下培育20分钟。

步骤10–使用具有分子量截止的透析膜针对3升蒸馏水透析还原的糖蛋白溶液持续3天，每日换水。

步骤11–在14,000g下离心透析的物质持续15分钟。可以使用来自Roche LifeSciences(Indianapolis,Indiana)的DIG GLYCAN DETECTION 测量糖蛋白浓度。制品可以在-20℃下储存直到在免疫学分析中使用。

实施例5-将各种食物提取物结合至用于测量抗体的固体基质

在使用如上面描述所提取的抗原制品对相同的测试表面进行成功的板涂覆中，不同的提取物被顺序地添加至相同的测试表面，其中洗涤步骤在连续添加之间提供以去除未结合的物质。添加至微孔板的孔的适合顺序如下。

步骤1-添加碱溶性蛋白至板，接着在4℃下培育24小时，然后用PBS/吐温20洗涤。

步骤2-添加醇溶性蛋白至板，接着在4℃下培育24小时，然后用PBS/吐温20洗涤。

步骤3-添加水溶性蛋白至板，接着在4℃下培育24小时，然后用PBS/吐温20洗涤。

步骤4-添加多糖至板，接着在4℃下培育24小时，然后用PBS/吐温20洗涤。

步骤5-添加糖脂至板，接着在4℃下培育24小时，然后用PBS/吐温20洗涤。

步骤6-添加糖蛋白至板，接着在4℃下培育24小时，然后用PBS/吐温20洗涤。

步骤7-在所有六种抗原制品已经被添加至板并使其中包含的抗原结合至固体基质之后，剩余的非特异性结合位点通过添加2％(w/v)牛血清白蛋白、2％(w/v)卵清蛋白、2％(w/v)干奶、2％(w/v)明胶或2％(w/v)硬骨鱼明胶饱和。在用PBS/吐温20最终洗涤之后，板可以在4℃下储存直到用于抗体和/或C1q测量。

实施例6-检测血液中针对不同食物提取物的组合的IgG、IgA抗体和免疫球蛋白-C1q复合物的分析过程

下面的过程描述了涂覆有根据实施例5的食物提取物的组合的微孔板的用途。应当理解，可以使用试管、硝化纤维纸、微粒悬浮液和其它基质。

血清样品通过静脉穿刺从个体收集并使其在室温下静置20分钟。其它样品类型也是适合的，包括血浆、全血、唾液、粘液、滑液和/或脑脊液。在800g下离心10分钟之后，移出血清并在-40℃下储存。

洗涤缓冲液如下制备：在500mL量筒中，将450mL水加入至50mL的10x洗涤缓冲液(用3.0L蒸馏水或去离子水稀释的1.0L 1x PBS；1.5mL吐温20；400mg叠氮化钠)。溶液被混合并转移至500mL挤压瓶并在2-8℃下储存直到使用。

抗-免疫球蛋白和抗-C1q抗体如下制备：将100μl酶标记的抗-人IgG、抗-人IgA、抗-人IgG加抗-C1q补体或抗-人IgA加抗-C1q补体加入到20-50mL包含0.1M PBS/吐温20和2％BSA的缀合物稀释液，并被用于检测血清中的抗体和/或C1q抗体缀合物。

就在使用之前通过在空的聚丙烯管中加入5mL底物缓冲液/5mg底物片(tablet)来制备底物溶液。给管加盖，混合以溶解片，并且然后立即使用溶液。每个微孔板条使用大约1mL的底物溶液。

对于抗体和C1q概况表征，通过加入40μl血清至4mL包含0.1M PBS/吐温20加2％BSA的稀释缓冲液以1:100(v/v)稀释血清。应当理解，该稀释可以在必要时修改，并且可以在1:20(v/v)到1:400(v/v)的范围内。稀释的血清被加入到为每种食物准备的一式双份孔中并且在4℃到25℃下培育30到60分钟。该培育可以短至15分钟并且长至24小时。在培育之后，使用洗涤缓冲液比如0.1M PBS/吐温20洗涤板3-6次，然后将100μl适当稀释的抗-人IgG、抗-人IgA或抗-人IgG加抗-人C1q——其全部标记有酶比如碱性磷酸酶——加入到测试孔。这样的抗-免疫球蛋白和抗-C1q缀合物的适合稀释可以在大约1:200到大约1:1000(v/v)的范围内。

微孔板或板条然后被覆盖并在室温下(即22℃到25℃)培育60分钟。然后从所有的孔中移出液体并且用大约200μL的洗涤缓冲液洗涤孔四次。然后将100μl的p-NPP底物溶液加入到孔，时间间隔对应于用于读取反应的器械的读取时间(例如，如果器械需要30秒从单个孔获得数据，则以30秒间隔将底物添加至孔)。在22℃到25℃的温度下，每个孔中的底物的培育时间为45分钟到60分钟。应当理解，如果底物培育步骤在更高的温度下执行，则该时间可以减少。通过以p-NPP加入的相同时间间隔将50μl的3N NaOH加入到孔来停止酶促反应。微孔板然后被摇动1到2分钟。微孔板的底部在阅读之前用非磨蚀性纸巾吸干，并且器械基于空白孔调零。在停止酶促反应的30分钟内读取在405nm±5nm下的光密度(OD)并且记录值。

效价或抗体水平可以利用使用下式的计算机执行的程序测定：

1)IgG、IgA或IgG+C1q指数＝(测试试样的吸光度)/(校准物的吸光度)

2)IgG、IgA或IgG+C1q水平＝((校准物的值)×(测试试样的吸光度))/(校准物的吸光度)

为了精确测定，可以使用点对点数据简化方法将吸光度转化为浓度值。可选地，最佳拟合线性回归可以被用于获得值。

使用自动ELISA阅读器获得该值。X轴是每个校准物的浓度值。Y轴是表达为光密度(OD)的相应平均吸光度值。导出最佳拟合线。通过将其吸光度定位在Y轴上并且找到在X轴上的相应浓度值来获得每个患者的唾液或血清的浓度。典型校准曲线的实例在图1中示出。浓度以相对单位表达，其实际上取决于校准种类的性质。

使用从第一患者获得的血清获得的结果在图2中示出。图2示出了针对由180种测试食物制备的抗原，IgG抗体升高，使用如上面描述的顺序涂覆的微孔板的孔表征，并且仅利用抗-人IgG探测。0.5O.D.的截止光密度值基于非升高值的分布选择，其中高于该值的光密度指示阳性应答。注意，在具有0.5的截止的该实例中，针对香蕉、菠萝、姜、香草、朝鲜蓟、芦笋、卷心菜、玉米、茄子、橄榄、咸菜、油炸土豆、海藻、小扁豆外源凝集素、美洲山核桃、蛋清和人造蟹肉观察到显著升高。针对其余163种食物提取物的IgG免疫反应性低于0.5OD或者是阴性的。

图3中示出了相同样品——但是其中微孔板的孔仅用抗-C1q抗体探测——的结果。图3示出了C1q结合(以天然免疫球蛋白-C1q复合物的形式)至由180种测试食物制备的抗原混合物的水平升高。注意，以这种方式测量C1q，针对当仅测量IgG时不为阳性的12种不同的新食物提取物，该复合物的浓度显著升高。这些提取物是乳胶橡胶蛋白、大蒜、洋葱、豌豆外源凝集素、萝卜、水稻内切几丁质酶、食用色素、金枪鱼、虾、树胶和绿茶。而且，注意到对于这12种食物，当利用抗-人IgG探测类似的孔时，IgG的浓度低于0.5或者是阴性的。

图4中示出了相同样品——但是其中微孔板的孔中的每个仅用抗-人IgG和用抗-C1q抗体二者探测——的结果。图4示出了当通过同时应用抗-人IgG和抗-人C1q二者测量IgG和C1q-IgG复合物的组合时，当测量IgG或C1q-IgG时为反应性的所有食物提取物(如图2和3中所示出)变得高度反应性。对于其他151种食物，光密度低于0.5或者是阴性的。

这些发现证明如果对该个体血清仅已经表征IgG抗体结合，则针对仅17种食物提取物的反应性将被检测到。类似地，如果仅天然免疫球蛋白-C1q复合物被测量，则患者的C1q概况显示了对12种没有通过单独的IgG测量检测到的食物提取物反应。但是，当IgG和C1q-IgG二者同时被测量时，生成显示与所有29种食物提取物的反应性的概况(在图4中示出)，其结合通过IgG检测的17种(图2中所示)和通过C1q-IgG评估检测的另外12种(图3中示出)二者。

图5、6和7显示了利用不同个体进行类似研究的结果(即，针对180种食物提取物的IgG、天然免疫球蛋白-C1q复合物和IgG+天然免疫球蛋白-C1q抗体概况)。注意，对于IgG测量，180种食物提取物中的仅10种是反应性的(图5)，并且当天然免疫球蛋白-C1q复合物被测量时，14种食物是反应性的(其中的11种对天然免疫球蛋白-C1q概况是唯一的，参见图6)。当IgG和天然免疫球蛋白-C1q二者都被表征时，结合的概况表明对21种食物提取物的反应性升高(如图7中所示)。该结合的概况代表通过IgG检测的10种食物抗原(在图5中示出)和针对天然免疫球蛋白-C1q复合物检测的另外11种(在图6中示出)的组合。

这证明为了食物免疫反应性的最佳检测，应当生成IgG加天然免疫球蛋白-C1q复合物概况的组合，这利用涂覆有源自测试的每种食物的不同抗原群的组合的测试表面进行。

图8、9、10和11描绘了针对分别涂覆有源自四种不同组食物的抗原的血清处理的测试表面的抗-IgG加抗-C1q抗体结合研究的表格式结果。测试表面涂覆有不同的抗原制品，包括主要包含水溶性成分的商业食物抗原制品、如上面所述提取的非商业水溶性蛋白、如上面所述提取的非商业醇溶性蛋白、如上面所述提取的非商业碱溶性蛋白、如上面所述提取的非商业糖脂、如上面所述提取的非商业多糖和如上面所述提取的非商业糖蛋白。显示了涂覆有单独抗原制品的测试表面和涂覆有所有六种非商业抗原制品的组合的测试表面的结果。另外，显示了来自用来自热处理/烹饪的食物的非商业抗原制品的组合处理的表面的结果。对于该数据组，显示大于0.5的光密度的结果被视为阳性。

虽然在针对商业食物抗原制品和水溶性食物成分的抗体检测之间存在良好关联，但是当这些测量与利用醇溶性、碱溶性、糖脂、多糖和糖蛋白成分获得的那些相比时，在免疫反应性中发现显著的区别。在与顺序地涂覆有这些食物抗原制品的测试表面相比，可见类似区别。

例如，当IgG和天然IgG-Cq复合物结合针对商业香蕉提取物表征时(参见图8)，结果是0.58的光密度(OD)，或者非常弱的阳性。使用如上面制备的水溶性提取物，OD变为0.65，其是弱阳性(或者“+”)。但是当针对香蕉多糖表征时，O.D.上升至0.98或(++)，并且利用所有六种提取物的混合物，OD上升至1.73(++++)。类似地，使用香蕉抗原的热变性混合物，所得OD为1.48(+++)。这些发现证明如果仅商业抗原在该分析中被使用，则针对香蕉的强免疫反应性将不能检测到。

利用玉米可见类似模式(参见图8)。当IgG加天然免疫球蛋白-C1q复合物被测量时，结果是针对商业玉米提取物的0.48或(±)的O.D.，利用水溶性提取物的0.56或(+)，利用醇溶性提取物的1.4或(+++)，利用碱溶性提取物的0.93或(++)，利用糖脂制品的0.72或(+)，和利用多糖制品的0.86或(++)。当针对顺序地涂覆有这六种提取物的测试表面测量时，O.D.是2.84或(+++++)，这表明高度的免疫反应性。

蘑菇(参见图9)是另一个良好实例，免疫反应性从利用商业提取物的0.45或(±)的O.D.上升至利用水溶性提取物的3.11(+++++)，甚至上升至使用顺序地利用所有热变性的抗原制品处理的测试表面的3.52(++++++)。同样，对于梨(图9)、土豆(图9)、水稻(图10)、芝麻种子(图10)、菠菜(图10)、番茄(图10)、小麦(图10)和蛋黄(图10)的O.D.承受检查。针对蛋黄，水溶性提取物成分实际上没有检测到IgG或天然免疫球蛋白-C1q复合物(-)，但是，利用醇溶性成分O.D.上升至0.36，并且当使用顺序地涂覆有所有抗原制品的测试表面时上升至3.31(+++++)。利用具有水溶性蛋白质的蛋清(图10)，观察到类似的反应性(++++)。利用虾(图11)、杏仁(图11)、巴西坚果(图11)、花生(图11)和小麦也观察到类似的结果。

值得注意的是，在虾和杏仁的情况下，当使用顺序地涂覆有所有抗原制品的测试表面测量时，IgG和天然免疫球蛋白-C1q复合物的结合显著地改变。也应当注意，虽然当对于虾使用提取物混合物时热变性导致O.D.从2.76(+++++)降低至1.2(++)，但是对于杏仁混合物的热变性导致免疫反应性从0.5增强至1.6，和对于巴西坚果从1.36增强至2.49。作为最终实例，针对花生的IgG加天然免疫球蛋白-C1q复合物的O.D.从利用商业提取物的1.51上升至当使用顺序地涂覆有所有提取物的测试表面时的2.18，并且当混合物被热变性时进一步上升至3.98。

这显示为了更精确表征包含免疫复合物的IgG和/或C1q，顺序地涂覆有由未加工形式——和当可用时以热变性或烹饪形式——的食物制备的水溶性成分、醇溶性成分、碱溶性成分、糖脂、多糖、糖蛋白制成的提取物的测试表面，应当被用于产生最完整的结合概况。

应当理解，虽然上面指出了来自样品的IgG的结果，但是从IgA结合至本发明构思的测试表面的测试预期类似改善的结果。还应当理解，与使用来自每种食物的单一抗原提取或制备方法制备的测试表面获得的那些相比，预期结合至本发明构思的测试表面的IgE、IgM和/或IgD的表征提供对食物抗原的抗体应答的更完整的、灵敏的和/或精确的评估。在本发明构思的一些实施方式中，利用相同测试表面可以组合测试不同的抗体种类。例如，结合至相同测试表面的IgG和IgA二者可以同时被测定。类似地，至相同测试表面的IgG、IgA和IgE可以同时被测定。在本发明构思的其它实施方式中，结合至相同测试表面的IgG和IgE可以同时被测定。在仍其它实施方式中，结合至相同测试表面的IgA和IgE可以同时被测定。

还应当理解，虽然C1q在上面被明确引用，但是从对与IgG、IgA、IgM、IgE和/或IgD中的一种或多种协同的其它补体种类的测试预期类似改善的结果。适合的补体成分包括经典补体途径中的参与者，包括C1r和/或C1s。在一些实施方式中，使用相同测试表面与IgG、IgA、IgM、IgE和/或IgD中的一种或多种协同(即同时)表征C1q、C1r和/或C1s。类似地，使用相同测试表面，可以与C1q、C1r、C1s、IgG、IgA、IgE、IgM和/或IgD中的一种或多种协同表征C4、C2、C4a、C4b、C2a、C2b、C3、C3a和C3b中的一种或多种。

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对于本领域技术人员而言应当显而易见的是在不背离本文中的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外，更多的修改是可能的。因此，本发明主题将仅被所附权利要求书的精神所限制。而且，在解释说明书和权利要求书二者中，所有术语应当以与该背景一致的最宽泛可能的方式解释。具体而言，术语“包括”应当被解释为以非排他方式提及元件、成分或步骤，这表明所陈述的元件、成分或步骤可以存在、被利用或者与未被明确陈述的其它元件、成分或步骤组合。在说明书和权利要求书涉及选自A、B、C……和N中的至少一个时，该文本应当被解释为要求保护来自该组的仅一个要素，非A加N，或B加N等。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.用于表征抗体和补体概况的方法，其包括：

获得包括一种或多种免疫球蛋白和天然免疫球蛋白-C1q复合物的样品；

提供包括食物抗原涂层的测试表面，其中所述食物抗原涂层包括第一食物抗原、第二食物抗原和第三食物抗原，其已经以顺序方式被施加至所述测试表面；

将所述测试表面与所述样品的至少一部分接触；

将所述测试表面与抗体混合物接触，其中所述抗体混合物包括针对C1q的第一抗体和针对所述样品种类的一种或多种免疫球蛋白的至少一种的第二抗体；和

获得将来自所述样品的所述免疫球蛋白的至少一种和天然免疫球蛋白-C1q复合物二者结合至所述测试表面的信号特征，其中超过背景截止的信号强度被表征为阳性结果。

2.权利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白的至少一种是IgG。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述免疫球蛋白的至少一种是IgA。

4.权利要求1-3中一项所述的方法，其中所述第一食物抗原、所述第二食物抗原和所述第三食物抗原通过不同的提取方法从相同食物获得。

5.权利要求1-4中一项所述的方法，进一步包括将所述测试表面与第三抗体接触，所述第三抗体包括针对所述第一抗体的抗体，其中所述第三抗体包括可检测的标签。

6.权利要求5所述的方法，进一步包括将所述测试表面与第四抗体接触，所述第四抗体包括针对所述第二抗体的抗体，其中所述第四抗体包括可检测的标签。

7.权利要求1-4中一项所述的方法，进一步包括将所述测试表面与第五抗体接触，所述第五抗体包括针对所述第一抗体和第二抗体二者的抗体，其中所述第五抗体包括可检测的标签。

8.权利要求1-4中一项所述的方法，其中所述第一抗体进一步包括第一可检测的标签和所述第二抗体进一步包括第二可检测的标签。

9.权利要求8所述的方法，其中所述第一可检测的标签和所述第二可检测的标签是不可区分的。

10.用于表征抗体和补体概况的方法，其包括：

获得包括一种或多种免疫球蛋白和一种或多种天然免疫球蛋白-C1q复合物的样品；

提供包括第一食物抗原涂层的第一测试表面，其中所述第一食物抗原涂层包括第一食物抗原、第二食物抗原和第三食物抗原，其已经以顺序方式被施加至所述测试表面；

提供包括第二食物抗原涂层的第二测试表面，其中所述第二食物抗原涂层包括第四食物抗原、第五食物抗原和第六食物抗原，其已经以顺序方式被施加至所述第二测试表面；

将所述第一测试表面和第二测试表面分别与所述样品的第一部分和第二部分接触；

将所述第一测试表面和第二测试表面与抗体混合物接触，其中所述抗体混合物包括针对C1q的第一抗体和针对所述样品种类的所述免疫球蛋白的至少一种的第二抗体；

从所述第一测试表面获得将来自所述样品的所述免疫球蛋白的至少一种和所述天然免疫球蛋白-C1q复合物的至少一种二者结合至所述第一测试表面的第一信号特征，其中超过背景截止的第一信号强度被表征为对所述第一测试表面的阳性结果；和

从所述第二测试表面获得将来自所述样品的所述免疫球蛋白的至少一种和所述天然免疫球蛋白-C1q复合物的至少一种二者结合至所述第二测试表面的第二信号特征，其中超过背景截止的第二信号强度被表征为对所述第二测试表面的阳性结果。

11.用于表征抗体和C1q概况的测试表面，其包括：

共同的测试表面；

在所述共同的测试表面上的第一涂层，其包括通过第一方法从食物提取的第一食物抗原；

在所述共同的测试表面上的第二涂层，其包括通过第二方法从所述食物提取的第二食物抗原；和

在所述共同的测试表面上的第三涂层，其包括通过第三方法从所述食物提取的第三食物抗原，

其中在应用所述第一涂层之后所述第二涂层已经被施加至所述共同的测试表面，和在应用所述第二涂层之后，所述第三涂层已经被施加至所述共同的测试表面。

12.权利要求11所述的测试表面，其中所述第一食物抗原选自水溶性蛋白、醇溶性蛋白、碱溶性蛋白、糖脂、多糖和糖蛋白。

13.权利要求11或12所述的测试表面，其中所述第二食物抗原选自水溶性蛋白、醇溶性蛋白、碱溶性蛋白、糖脂、多糖和糖蛋白。

14.权利要求11-13中一项所述的测试表面，其中所述第三食物抗原选自水溶性蛋白、醇溶性蛋白、碱溶性蛋白、糖脂、多糖和糖蛋白。

15.制造用于表征食物敏感性的测试表面的方法，其包括：

提供共同的测试表面；

使第一食物抗原制品与所述共同的测试表面接触持续足以允许所述第一食物抗原制品的第一食物抗原的至少一部分与所述共同的测试表面复合的时间段；

在与所述第一食物抗原制品接触之后，使第二食物抗原制品与所述共同的测试表面接触持续足以允许所述第二食物抗原制品的第二食物抗原的至少一部分与所述共同的测试表面复合的时间段；和

在与所述第二食物抗原制品接触之后，使第三食物抗原制品与所述共同的测试表面接触持续足以允许所述第三食物抗原制品的第三食物抗原的至少一部分与所述共同的测试表面复合的时间段，

其中所述第一食物抗原制品、所述第二食物抗原制品和所述第三食物抗原制品由相同食物制备。

16.权利要求15所述的方法，进一步包括在使所述共同的测试表面与所述第二食物抗原制品接触之前，去除来自所述第一食物抗原制品的未复合的物质的步骤。

17.权利要求16所述的方法，其中所述去除步骤包括使所述共同的测试表面与包含表面活性剂的溶液接触。

18.权利要求15-17中一项所述的方法，进一步包括在使所述共同的测试表面与所述第三食物抗原制品接触之前，去除来自所述第二食物抗原制品的未复合的物质的步骤。

19.权利要求18所述的方法，其中所述去除步骤包括使所述共同的测试表面与包含表面活性剂的溶液接触。

20.权利要求15-19中一项所述的方法，进一步包括使所述共同的测试表面与封闭液接触的步骤。

21.用于表征抗体和C1q结合概况的测试试剂盒，其包括测试板，其中所述测试板包括多个权利要求11所述的共同的测试表面。

22.权利要求21所述的测试试剂盒，其中所述多个共同的测试表面包括第一测试表面和第二测试表面，所述第一测试表面包括来自第一食物的抗原，所述第二测试表面包括来自第二食物的抗原。