一种牙鲆雌核发育四倍体的诱导方法

摘要

本发明提供了一种牙鲆雌核发育四倍体的诱导方法，属于海洋生物育种技术领域。所述诱导方法是将新鲜的真鲷精子进行紫外线照射进行灭活处理；将灭活真鲷精子和新鲜牙鲆卵子进行混合，将得到的精卵混合液与15～19℃的海水混合3min，然后将精卵混合液转移至0～3℃的海水中冷休克处理40～50min；将处理后的精卵混合液培育45～71min，从精卵混合液筛选出浮鱼卵置于压力为550～750kg/cm

说明书

技术领域

本发明属于海洋生物育种技术领域，具体涉及一种牙鲆雌核发育四倍体的诱导方法。

背景技术

多倍体育种是鱼类育种的一种重要技术手段。在鱼类中，三倍体普遍具有生长快、不育等特性，可大幅提高单位养殖产量，增加收益。批量化生产商业化养殖所需的三倍体苗种，最简便的方法就是通过四倍体和二倍体亲本之间的交配。因此，四倍体的制备在鱼类多倍体育种中具有重要的意义。

虽然自然界中存在天然四倍体鱼类，但是数量较少，不易得，不能满足鱼苗的应用。传统的鱼类四倍体诱导都是通过精子和卵子正常受精，然后再抑制卵裂从而实现染色体的加倍。这种方法得到的四倍体具有父母本的遗传信息，从而无法对某些只有母本具有的优良性状进行固定。对一些含有特殊性状的雌性个体，如何实现四倍体化，当前技术不能予以解决。

发明内容

有鉴于此，为了获得牙鲆雌核发育四倍体，本发明提供一种牙鲆雌核发育四倍体的诱导方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种牙鲆雌核发育四倍体的诱导方法，包括以下步骤：

1)将新鲜的真鲷精子进行进行灭活处理，得到灭活的真鲷精子；

2)将所述步骤1)得到的灭活的真鲷精子和新鲜的牙鲆卵子进行混合，将得到的精卵混合液与15～19℃的海水混合；

3)待所述精卵混合液与海水混合3min后，将所述精卵混合物转移至0～3℃的海水中进行冷休克处理40～50min，得到冷休克处理的精卵混合物；

4)将所述步骤3)中得到的冷休克处理的精卵混合液在15～19℃条件下培育45～71min后，从精卵混合物筛选出上浮鱼卵置于压力为550～750kg/cm²的环境中静压处理5～7min，得到静压处理的鱼卵；

5)将所述步骤4)中得到的静压处理的浮鱼卵进行流水孵化，得到牙鲆雌核发育四倍体。

优选的，所述步骤1)中灭活处理为紫外线照射；所述紫外线照射的时间为40～60s；所述紫外线照射的剂量为55～92mJ/cm²，所述紫外线的功率为28～32W。

优选的，所述步骤1)中新鲜的牙鲆卵子进行灭活处理前进行稀释；所述稀释用溶液为林格氏液；所述真鲷精子稀释后的密度为4×10⁶～5×10⁶个/ml。

优选的，所述步骤2)中灭活真鲷精子和牙鲆卵子的数量比为1:10～1:20。

优选的，所述步骤2)中精卵混合液和海水的体积比为1:8～12。

优选的，所述步骤4)中处理浮鱼卵的压力环境在30s内达到设定压力；所述静水压处理后，在5s内泄压至标准大气压。

优选的，所述步骤5)中流水孵育的时间70～80h，所述流水孵育的温度为15～16℃。

优选的，所述步骤5)中流水孵育后还包括：对流水孵化得到的鱼苗进行倍性鉴定；所述倍性鉴定包括流式细胞仪倍性鉴定和亲子鉴定；所述倍性鉴定包括流式细胞仪倍性鉴定或染色体滴片鉴定；亲子鉴定包括微卫星标记鉴定

优选的，所述微卫星标记倍性鉴定中使用的微卫星引物包括四对引物中的任意一对；所述4对均能有效扩增母本微卫星序列。所述微卫星引物具有如序列表中SEQ ID No：1～SEQ ID No：8所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种牙鲆雌核发育四倍体的诱导方法，首先利用紫外线照射将异源真鲷精子的DNA进行破坏，使其失去遗传活性，灭活的真鲷精子与牙鲆卵子混合授精，在授精过程中只起到激活卵子的作用，异源真鲷精子的遗传物质DNA并没有参加到发育过程中；牙鲆卵子在用灭活的真鲷精子进行人工授精后(仅激活，为假授精，授精卵为单倍体)3min后利用0～3℃海水进行冷休克处理，抑制其第二极体排出，从而使其母本染色体组加倍(单倍体变为二倍体)，形成的二倍体胚胎在15～19℃海水中孵化后，再进行静水压处理，抑制有丝分裂，使染色体组第二次加倍，从而获得四倍体。普通四倍体诱导过程是将牙鲆卵子和牙鲆精子人工受精后(此时的受精卵为二倍体)，17℃海水中孵化后，对受精卵进行静水压处理，抑制有丝分裂，进行染色体加倍，使之成为四倍体。由此可见，本发明提供的诱导方法与普通四倍体诱导相比，不同之处是采用遗传失活的异源精子激活牙鲆卵子，再利用冷休克结合静水压的方法进行两次倍性加倍，从而获得只含有母本遗传信息的四倍体。真鲷和牙鲆存在生殖隔离，即使紫外线照射过程没有完全灭活真鲷精子的遗传活性，授精后也不能得到可存活的胚胎，从而有效避免真鲷精子的DNA参与胚胎的发育中，保证牙鲆四倍体是只含有母本遗传信息。

附图说明

图1是实施例1中雌核发育四倍体的染色体组形态图，其中图1-A为二倍体染色体组，图1-B为四倍体染色体组。

具体实施方式

本发明提供了一种牙鲆雌核发育四倍体的诱导方法，包括以下步骤：

1)将新鲜的真鲷精子进行紫外线照射灭活处理，得到灭活的真鲷精子；

2)将所述步骤1)得到的灭活的真鲷精子和新鲜的牙鲆卵子进行混合，将得到的精卵混合液与15～19℃的海水混合；

3)待所述精卵混合液与海水混合3min后，将所述精卵混合液转移至0～3℃的海水中进行冷休克处理40～50min，得到冷休克处理的精卵混合物；

4)将所述步骤3)中得到的冷休克处理的精卵混合液在15～19℃条件下培育45～71min后，从精卵混合物筛选出浮鱼卵置于压力为550～750kg/cm²的环境中静压处理5～7min，得到静压处理的浮鱼卵；

5)将所述步骤4)中得到的静压处理的鱼卵进行流水孵化。

本发明将新鲜的真鲷精子进行紫外线照射灭活处理，得到灭活的真鲷精子。

本发明中，所述新鲜的真鲷精子是通过人工采精的方法，从雄性真鲷亲本中获得。所采集的新鲜真鲷精子应避光保存，并在显微镜下对精子质量进行检查，挑选游动时间长的精子进行照射。本发明对所述产生真鲷精子的真鲷亲本的品系没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的真鲷品系即可。

本发明中，所述新鲜的真鲷精子进行灭活处理前优选进行稀释；所述稀释用溶液优选为林格氏液；所述真鲷精子稀释后的密度为4×10⁶～5×10⁶个/ml。所述林格氏液的组分包括：NaCl>2·2H₂O>2·6H₂O>2PO₄·2H₂O0.28g，NaHCO₃0.20g，Glucose>

本发明中，灭活处理为紫外线照射；所述紫外线照射的时间优选为40～60s，更优选为50s；所述紫外线照射的剂量为55～92mJ/cm²，更优选为60～85mJ/cm²，最优选为78mJ/cm²。所述紫外线的功率优选为28～32W，更优选为30W。所述紫外线优选采用紫外灯提供。所述真鲷精子与所述紫外线灯的间距优选为28～32cm，更优选为30cm。本发明中，利用紫外线对真鲷精子的DNA进行破坏，使其失去生物活性，得到灭活的真鲷精子。

得到的灭活的真鲷精子后，本发明将所述灭活的真鲷精子和新鲜的牙鲆卵子进行混合，将得到的精卵混合液与15～19℃的海水混合。

本发明中，所采集的牙鲆卵子应避光保存，并在解剖镜下对牙鲆卵子质量进行检查，挑选透明、饱满、大小均一的卵子。

本发明中，所述灭活的真鲷精子和牙鲆卵子的数量比优选为1:10～1:20，更优选为1:10。本发明对所述混合的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的混合方案即可。本发明中，灭活的真鲷精子在授精过程中只是起到激活卵子的作用，其遗传物质并没有参加到发育过程中，激活后的卵子仍为单倍体，即使存在真鲷精子未被紫外线灭活，但是由于真鲷精子和牙鲆卵子存在生殖隔离，其杂交后代不能存活。

本发明中，待紫外线照射后真鲷精子激活牙鲆卵子3min后，将所述精卵混合物转移至0～3℃的海水中进行冷休克处理40～50min，得到冷休克处理后的鱼卵。

本发明中，所述冷处理能够抑制卵子第二极体排出，使其染色体组加倍，变成二倍体，完成牙鲆减数分裂雌核发育。

本发明中，所述冷休克处理的时间优选为45min。本发明对所述海水没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的鱼苗育种海水即可。

本发明对所述转移的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的转移方案即可。

得到的冷休克处理的精卵混合物后，本发明将所述冷休克处理的精卵混合物在15～19℃海水中培育45～71min后，从精卵混合物挑选上浮鱼卵置于压力为550～750kg/cm²的环境中处理5～7min，得到静压处理后的鱼卵。

本发明中，所述精卵混合物的培育温度优选为16～18℃，更优选为17℃。所述培育的时间优选为50～60min，更优选为55min。所述培育优选在孵化缸中进行。

本发明中，所述静压处理浮鱼卵的压力环境优选在30s内达到设定压力；所述压力优选为600～700kg/cm²，更优选为650kg/cm²。所述处理的时间优选为6min。所述处理后，优选5秒内泄压至标准大气压。所述处理浮鱼卵的环境优选在静水压机内进行。

得到的静压处理的鱼卵后，本发明将所述鱼卵进行流水孵化。

本发明中，所述流水孵育的时间优选为70～80h，更优选为75h。所述流水孵育的温度优选为15～16℃。本发明对所述流水孵育的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的流水孵育方法即可。所述流水孵育使染色体加倍的鱼卵生长发育为四倍体鱼苗

本发明中，所述流水孵育后优选还包括：对流水孵化得到的鱼苗进行倍性鉴定和亲子鉴定；所述倍性鉴定优选包括流式细胞仪倍性鉴定和染色体滴片鉴定；亲子鉴定包括微卫星标记鉴定。

本发明中，所述微卫星标记倍性鉴定中使用的微卫星引物优选包括四对引物中的任意一对；所述微卫星引物具有如序列表中SEQ ID No：1～SEQ ID No：8所示的核苷酸序列。

本发明对所述流式细胞仪倍性鉴定，染色体滴片倍性鉴定以及微卫星亲子鉴定的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的鉴定方案即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种牙鲆雌核发育四倍体的诱导方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1)精子和卵子的采集

从中国水产科学研究院北戴河中心实验站采集新鲜的真鲷精子和牙鲆卵子。

2)精子紫外线照射

用稀释液(格林氏液)对上述精子进行稀释40倍，并在距离30w的紫外线灯30cm下进行照射45s，照射剂量为70mJ/cm²。

3)人工授精：

将经紫外线照射的真鲷精子和牙鲆卵子按照个数比为1:10混合，搅拌均匀后，向其加入15℃的10倍体积的海水，得到经海水激活的精卵混合物。

4)冷休克处理抑制第二极体释放：

在海水激活3min后，将精卵混合物转移至0℃的海水中进行冷休克处理45分钟，处理结束后转移至孵化缸内。

5)染色体加倍：

冷休克结束60min后，从孵化缸中用网兜捞取上浮鱼卵至静水压机中，加压至650kg/cm²，持续6min，快速泄压后，将鱼卵转移至孵化缸内进行流水孵化。

通过上述方法，即可得到牙鲆雌核发育四倍体。

6)仔鱼倍性鉴定：对所得到的仔鱼进行流式细胞仪倍性鉴定；具体步骤如下：

用流式细胞仪PloidyAnalyzer(Partec GmbH，Münster，Germany)检测流水孵化后一天仔鱼的相对DNA含量，从而确定其倍性。将每一条仔鱼置于洁净的培养皿上，加0.5mL含DAPI(4’6-deamidino-2-phenylindole)的CyStainDNA 1step染液(Partec GmbH，Münster，Germany)，用镊子将仔鱼研碎，使细胞游离，再加1.5mL的CyStain DNA 1step染液，在室温下培育5min。然后将样品用Partec 30μm cellTrics一次性过滤器(Partec GmbH，Münster，Germany)过滤，上机测试。普通二倍体的相对DNA含量作为二倍体标准。

7)亲子鉴定：对所检测到的四倍体利用微卫星标记进行亲子鉴定，包括以下具体步骤：

微卫星引物Poli1915TUF的序列为：

F：如SEQ ID NO：1所示；R：如SEQ ID NO：2所示；

微卫星引物Poli1077TUF的序列为：

F：如SEQ ID NO：3所示；R：如SEQ ID NO：4所示；

微卫星引物Poli212TUF的序列为：

F：如SEQ ID NO：5所示；R：如SEQ ID NO：6所示；

微卫星引物Poli1831TUF的序列为：

F：如SEQ ID NO：7所示；R：如SEQ ID NO：8所示。

微卫星检测结果见表1。

表1 4对微卫星引物检测结果

雌核发育四倍体只具有母本的等位基因，而二倍体对照和普通四倍体对照分别具有母本和父本的等位基因，由此可以说明，雌核发育四倍体的全母本遗传。

(8)染色体滴片分析

取孵化后15日龄仔鱼，置于海水配置的0.02％秋水仙素中，室温避光处理2h。随后取出鳃，生理盐水润洗，0.8％柠檬酸钠低渗30min。用新配置的卡诺氏固定液(-20℃预冷)连续固定3次，每次20min，-20℃保存过夜。第二天将所固定的鳃丝放入50％冰醋酸中，用剪刀剪碎，使细胞分离。取20Μl液体滴于提前预冷载玻片，在酒精灯上过火，随后将载玻片倾斜放置，室温下自然风干。完全干燥的载玻片用10％吉姆萨染液染色45min，之后用纯水冲洗三次，自然风干。染色后的染色体滴片标本在普通光学显微镜下100×倍物镜下拍照。牙鲆二倍体染色体数为48，四倍体染色体数为96。

分析结果如图1，其中图1-A为二倍体染色体组，图1-B为四倍体染色体组。

实施例1中，受精率为60.8％，孵化率为16.5％，四倍体率为83.3％。

受精率为原肠期上浮胚胎数占诱导所用总卵数的百分比；

孵化率为孵化仔鱼数占诱导所用总卵数的百分比；

四倍体率为四倍体仔鱼数占所检测仔鱼数的百分比。

实施例2

1)精子和卵子的采集

从中国水产科学研究院北戴河中心实验站采集新鲜的真鲷精子和牙鲆卵子。

2)精子紫外线照射

用稀释液(格林氏液)对上述精子进行稀释50倍，并在距离32w的紫外线灯32cm下进行照射60s，照射剂量为92mJ/cm²。

3)人工授精：

将经紫外线照射的真鲷精子和牙鲆卵子按照个数比为1～10混合，搅拌均匀后，向其加入19℃的12倍体积的海水，得到经海水激活的精卵混合物。

4)冷休克处理抑制第二极体释放：

在海水激活3min后，将精卵混合物转移至3℃的海水中进行冷休克处理40min，处理结束后转移至孵化缸内。

5)染色体加倍：

冷休克结束55min后，从孵化缸中用网兜捞取上浮鱼卵至静水压机中，加压至750kg/cm²，持续7min，快速泄压后，将鱼卵转移至孵化缸内进行流水孵化。

通过上述方法，即可得到牙鲆雌核发育四倍体。

6)亲子鉴定：对所检测到的四倍体利用微卫星标记进行亲子鉴定，具体步骤如实施例1中所示。

本实施例中，受精率为20.8％，孵化率为4.5％，四倍体率为63.4％。

实施例3

1)精子和卵子的采集

从中国水产科学研究院北戴河中心实验站采集新鲜的真鲷精子和牙鲆卵子。

2)精子紫外线照射

用稀释液(格林氏液)对上述精子进行稀释30倍，并在距离28w的紫外线灯28cm下进行照射30s，照射剂量为55mJ/cm²。

3)人工授精：

将经紫外线照射的真鲷精子和牙鲆卵子按照个数比为1:20混合，搅拌均匀后，向其加入17℃的8倍体积的海水，得到经海水激活的精卵混合物。

4)冷休克处理抑制第二极体释放：

在海水激活3min后，将精卵混合物转移至2℃的海水中进行冷休克处理50min，处理结束后转移至孵化缸内。

5)染色体加倍：

从孵化缸中用网兜捞取上浮鱼卵至静水压机中，加压至550kg/cm²，持续5min，快速泄压后，将鱼卵转移至孵化缸内进行流水孵化。

通过上述方法，即可得到牙鲆雌核发育四倍体。

6)亲子鉴定：对所检测到的四倍体利用微卫星标记进行亲子鉴定，具体步骤如实施例1中所示。

本实施例中，受精率为43.8％，孵化率为4.2％，四倍体率为50.4％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国水产科学研究院北戴河中心实验站

<120> 一种牙鲆雌核发育四倍体的诱导方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> Paralichthys olivaceus

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<212> DNA

<213> Paralichthys olivaceus

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<212> DNA

<213> Paralichthys olivaceus

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<213> Paralichthys olivaceus

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<212> DNA

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<213> Paralichthys olivaceus

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