一株芽孢杆菌发酵提取物在防治植物病虫害中的应用

摘要

本发明公开了

说明书

技术领域

本发明属于生物农药领域，具体的说是Bacillus> DSM23495发酵提取物在防治植物病害与甜菜夜蛾中的应用。

背景技术

苹果、番茄、白菜与棉花等是我国的主要经济作物，尤其胶东苹果享誉全国，给当地带来巨大经济效益。近年来，随着化学合成农药的大量使用，上述作物病害抗药性日益严重，造成直接经济损失达20-70%，随之也带来农残超标、环境污染甚至人畜中毒等问题。

甜菜夜蛾（Spodoptera> Hübner）属鳞翅目夜蛾科，是一种世界性分布、间歇性大发生的杂食性害虫，在我国南北方经济作物产区均有发生，尤其北方发生面积较大。近年来，甜菜夜蛾经常暴发成灾，在我国由次要害虫上升为主要害虫，给农业生产带来严重损失。与上述植物病害防治类似，当前甜菜夜蛾主要依靠化学合成农药防控，其长期使用已经导致一系列令人担忧的问题，如：害虫产生抗药性、生态平衡遭到破坏及农药残留危害人类健康等。

微生物农药作为一种“环境友好”的无公害绿色农药，能够有效克服化学合成农药的弊端，可持续性强，在植物病虫害防治中的作用日益明显。因此，从微生物中寻找并开发生物农药，已经成为发展植物病虫害绿色防治的重要方向。

发明内容

本发明的目的在于提供Bacillus> DSM23495发酵提取物在制备防治植物病害与甜菜夜蛾的微生物农药方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：Bacillus> DSM23495发酵提取物在制备防治植物病害与甜菜夜蛾微生物农药中的应用。所述菌株于2017年1月9日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 13551。所述植物病害为番茄灰霉病菌、棉花枯萎病菌、苹果腐烂病菌与白菜黑斑病菌中的一种或几种。

所述Bacillus> DSM23495发酵提取物的制备方法如下：Bacillus>horneckiae>DSM23495经培养基摇床或静置发酵10-30天，乙酸乙酯萃取，柱层析制备得到。所述培养基比例为：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl，蒸馏水，pH调至7.0。

所述乙酸乙酯萃取物进行柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比20:1梯度的洗脱组分I用于制备防治植物病害的微生物杀菌剂；收集石油醚-乙酸乙酯体积比2:1梯度的洗脱组分Ⅱ用于制备防治甜菜夜蛾的微生物杀虫剂。所述柱层析为硅胶柱层析、凝胶柱层析、大孔吸附树脂柱层析与反相柱层析中的一种或几种。所述石油醚-乙酸乙酯洗脱梯度为100:1至1:1。

本发明所具有的优点：Bacillus> DSM23495发酵提取物可由菌株Bacillus> DSM23495经发酵培养、提取分离而获得，其对番茄灰霉病菌、棉花枯萎病菌、苹果腐烂病菌与白菜黑斑病菌等植物病原真菌具有较好的抑制活性，最小抑制浓度（MIC）分别为4、8、8与10 μg/mL，可用于制备微生物杀菌剂；Bacillus>DSM23495发酵提取物对甜菜夜蛾具有较好的拒食活性，0.4 mg/mL浓度，抑制取食率达86.1±2.2%，可用于制备微生物杀虫剂。

本发明所涉及的Bacillus> DSM23495发酵提取物可以利用微生物进行规模发酵，具有生产工艺简单、周期短、产品成本低等特点；且在环境中易于降解，对人畜毒性较低。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：Bacillus> DSM23495发酵提取物的制备

（1）发酵培养

按照微生物的常规培养方法，挑取少量保存于LB固体培养基斜面的菌株Bacillus>horneckiae>

LB固体培养基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl，1%琼脂，蒸馏水，pH调至7.0。

切取上述LB固体平板表面的菌种，接种至无菌LB液体培养基的锥形瓶中，30℃、120 rpm摇床培养10天，备用。

（2）发酵提取物的制备

将上述LB液体培养基用乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯提取液，减压蒸馏得浸膏。将其进行硅胶VLC（vacuum liquid chromatography）快速柱层析，按照洗脱液极性递增顺序，以体积比100:1至1:1的石油醚-乙酸乙酯（流速为150 mL/min）进行梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比20:1梯度的洗脱组分I用于制备防治植物病害的微生物杀菌剂；收集石油醚-乙酸乙酯体积比2:1梯度的洗脱组分Ⅱ用于制备防治甜菜夜蛾的微生物杀虫剂。

实施例2：抑菌活性试验

采用微量稀释法，测定Bacillus> DSM23495发酵提取物对番茄灰霉病菌与棉花枯萎病菌的抑菌活性。

1）菌悬液的制备

将供试真菌接种于PDA培养基表面于28℃培养72 h后，吸取2 mL无菌0.85% NaCl溶液（含0.25% 吐温-20）洗涤培养物，并用玻璃刮刀将菌落轻轻刮下。吸取适量菌悬液于无菌试管中，调至0.5麦氏比浊（相当于1.5×10^{8>CFU/mL）备用；}

2）样品的配制

取一定量待测样品（实施例1中制备的洗脱组分I），溶解于100 μL 50% DMSO中，充分混匀后，吸取50 μL样品溶液到另一只离心管中，接着加入50 μL 50% DMSO，得到浓度减半的样品溶液。按照此方法，得到12组浓度依次减半的样品溶液。

3）MIC测定方法

（1）采用无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的样品溶液分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第12孔各加5 μL的样品溶液，并以不加样品孔作为空白对照，加5 μL DMSO溶液孔为溶剂对照。

（2）将相当于0.5麦氏比浊度的指示菌悬液，经沙氏培养基稀释1000倍后，取95 μL依次加入到96孔板中，使得第1至第12孔的样品浓度依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25 μg/mL。以上所有样品均重复三次。轻轻震荡混匀后，将96孔板密封置于28℃生化培养箱中培养72 h。

（3）在600 nm波长下使用酶标仪测定每孔的吸光值，以在小孔内完全抑制指示菌生长的最低样品浓度为该化合物的MIC。（注意：当阴性对照孔内指示菌明显生长实验才有意义；当实验出现单一的跳孔时，应记录抑制菌株生长的最高药物浓度；如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复实验。）

试验结果为Bacillus> DSM23495发酵提取物对对番茄灰霉病菌、棉花枯萎病菌、苹果腐烂病菌与白菜黑斑病菌的MIC分别为4、8、8和10 μg/mL，具有较好抑菌活性。

上述实验结果证明本发明所涉及的Bacillus> DSM23495发酵提取物具有较好抑菌活性，可用于制备防治植物病害的微生物杀菌剂。

实施例3：甜菜夜蛾杀虫活性测定

采用叶碟浸渍法测定Bacillus> DSM23495发酵提取物对甜菜夜蛾3 龄幼虫的杀虫活性。

操作步骤：（1）将新鲜的甘蓝叶片叶肉部分剪成1 cm × 1 cm的小叶碟，样品（实施例1中制备的洗脱组分Ⅱ）用90%丙酮溶液配制成一定浓度的溶液；（2）吸取50 μL样品溶液加入装有4片叶碟的24孔板中，每浓度8个重复，以90%丙酮溶液做空白对照；（3）待溶剂挥干后，加入甜菜夜蛾3龄幼虫，每孔1头，盖好盖子，35℃、RH40%条件下避光培养；（4）培养48h后，观察甜菜夜蛾幼虫取食和死亡情况，计算校正死亡率和抑制取食率。校正死亡率=（A-CK）/（1-CK）×100%，A为样品孔致死率，CK为对照孔致死率；抑制取食率=（CK-B）/CK×100%，B为样品组取食量，CK为对照组取食量。

实验表明，Bacillus> DSM23495发酵提取物在浓度为0.4 mg/mL时，对甜菜夜蛾具有较好的拒食活性，抑制取食率为86.1±2.2%，可用于制备微生物杀虫剂。

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