一种斜带石斑鱼天然免疫受体TLR13基因及其真核表达载体与应用

摘要

本发明首次公开了一种斜带石斑鱼天然免疫受体

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，更具体地，涉及一种斜带石斑鱼天然免疫受体TLR13基因及其真核表达载体与应用。

背景技术

Toll 样受体（Toll-like receptor, TLR）家族是“异己”识别和先天性免疫反应的活化基础，属于Ⅰ型跨膜受体。TLRs具有膜内保守的TIR（Toll/IL-1 receptor）结构域，主要用于免疫反应中募集接头蛋白髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和Toll样受体接头蛋白1（TIR domain-containing adaptor inducinginterferon-β （TRIF）/TIR domain-containing adaptor molecule （TICAM-1），TRIF1），以进一步激活下游的免疫反应。TLRs还具有膜外不保守的亮氨酸重复的区域，主要用于识别不同的病原相关分子模式。

TLR介导的下游通路主要通过MyD88依赖的信号通路或TRIF依赖的信号通路激活下游的免疫反应。受到特定的配体刺激后，TLR将会形成同源二聚体或异源二聚体，募集接头蛋白MyD88，MAL（myeloid differentiation protein 88 adapter-like），TRIF，和TRAM（TRIF-related adaptor molecule），然后激活下游的一系列激酶，并介导转录因子NF-κB（nuclear factor-κB），AP1（activator protein-1）等的激活，最终引起免疫炎症因子的产生。

硬骨鱼类的TLR与哺乳类相比，在种类和功能上具有一定的差异。目前，在人类中发现了TLR1~10，在小鼠中发现了TLR1~13，而在硬骨鱼类中，在哺乳类的基础上，另外发现了TLR18~23，25，26等多种鱼类特有的TLR家族成员。研究表明，鱼类的TLR2可能识别病毒而不是细菌类的配体，TLR4并不能识别LPS，TLR5具有胞内和位于细胞膜的两种形态，而且都能识别鞭毛蛋白。而鱼类特异的TLR22具有多种亚型，可以识别包括脂多糖、双链RNA类似物（Polyinosinic-polycytidylic acid，Poly （I:C））、肽聚糖（peptidoglycan，PGN）等多种不同类型的配体刺激，激活下游免疫通路。

目前，在小鼠中研究发现，TLR13的表达能受到脑囊虫病、疱疹性口炎病毒以及细菌23S rRNA的刺激上调，并且发现小鼠TLR13可以识别细菌23S rRNA。但是在硬骨鱼类中，对TLR13研究甚少，TLR13在硬骨鱼类免疫中是否也能起到识别细菌的作用，能够识别何种细菌等功能尚不明确。

石斑鱼是我国名贵的水产养殖鱼类，肉质鲜美，营养丰富，具有很高的食用价值及经济价值。斜带石斑鱼（Epinepheluscoioides）属于养殖中较为常见的石斑鱼种类之一，在分类上属于鲈形目（Perciformes），鮨科（Serranidae），石斑鱼亚科（Epinephelinae），石斑鱼属（Epinephelus）。近年来，石斑鱼养殖业发展迅猛，但是伴随着养殖规模的扩大，病害也频繁爆发，严重制约了石斑鱼产业的发展。由于细菌感染对石斑鱼养殖造成的影响较大，因此，探究斜带石斑鱼天然免疫受体TLR13的功能特点及其在细菌防御中发挥的作用，一方面可以丰富鱼类天然免疫信号通路的理论研究，同时也可以在生产应用中为鱼类免疫，预防病害等研究提供科学的依据和实践的基础。

副溶血弧菌是一种嗜盐性的革兰氏阴性致病菌，是鱼、虾、贝类等养殖水产动物的重要病原菌。同时，副溶血弧菌还是引起人类食源性疾病的重要病原之一，广东地区是我国水产品副溶血性弧菌污染最严重的地区。因此，深入了解硬骨鱼类对其的识别及防御机制，并制定针对性的高效环保防控策略，对于改善抗生素滥用的现状，有力推动海水渔业的健康高效养殖，在获得健康优质水产品的同时，降低人类健康风险有着重要的意义。

发明内容

本发明的要解决的技术问题是弥补现有技术的空白，提供一种斜带石斑鱼天然免疫受体TLR13基因的核苷酸序列。

本发明要解决的另一技术问题是提供一种包含所述TLR13基因全长cDNA序列的真核表达载体。

本发明还一要解决的技术问题是提供一种所述TLR13基因或TLR13蛋白在调节炎症因子的表达中的应用。

本发明还一要解决的技术问题是提供一种所述TLR13基因或TLR13蛋白在识别细菌RNA中的应用。

本发明还一要解决的技术问题是提供一种所述TLR13基因或TLR13蛋白在识别副溶血弧菌RNA并调节炎症因子的表达中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种斜带石斑鱼天然免疫受体TLR13基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO1所示。

所述的斜带石斑鱼天然免疫受体TLR13基因的全长cDNA序列如SEQ.ID.NO2所示。

所述的斜带石斑鱼天然免疫受体TLR13基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO3所示。

所述斜带石斑鱼天然免疫受体TLR13基因编码的蛋白的蛋白结构包括1段信号肽序列、14个LRR结构域，1个典型的TIR结构域和1个跨膜结构域。

本发明还提供了包含所述TLR13基因全长cDNA序列的真核表达载体。

进一步地，所述载体为pcDNA3.1-TLR13或pEGFP-N3-TLR13，其中TLR13是指权利要求2所述TLR13基因全长cDNA序列；其中pcDNA3.1是指pcDNA3.1质粒，其中pEGFP-N3是指pEGFP-N3质粒。

本发明还提供了所述的基因或所述的蛋白在调节炎症因子的表达中的应用。

本发明还提供了所述的基因或所述的蛋白在识别细菌RNA中的应用。

本发明还提供了所述的基因或所述的蛋白在识别副溶血弧菌RNA并调节炎症因子的表达中的应用。

本发明的有益效果：

本发明首次提供了所述斜带石斑鱼天然免疫受体TLR13基因的核苷酸序列基于所述序列，还提供了两种所述TLR13基因的真核表达载体pEGFP-N3-TLR13与pcDNA3.1-TLR13，并且提供了所述TLR13基因及TLR13基因编码的蛋白在调节炎症因子的表达、识别细菌RNA、识别副溶血弧菌RNA并调节炎症因子的表达中的应用，具有突出的实质性进步。

附图说明

图1 TLR13基因全长cDNA的PCR扩增电泳图。

图2重组质粒pEGFP-N3-TLR13及pcDNA3.1-13转化大肠杆菌DH5α的菌液PCR验证电泳图。

图3 两种真核表达载体的过表达TLR13的效果。

图4 过表达TLR13使多种炎症因子的mRNA转录上调。

图5 过表达TLR13后对细菌RNA的识别及对下游IFN-β启动子活性的上调。

图6敲降TLR13后对副溶血弧菌RNA介导产生的免疫因子的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的应用方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1 斜带石斑鱼TLR13基因的克隆

（1）斜带石斑鱼脾脏总RNA的提取

取健康斜带石斑鱼，于冰上麻醉3分钟，分离脾脏组织，采用Trizol试剂提取其总RNA。

（2）cDNA第一链的合成

取1μg斜带石斑鱼头肾总 RNA 样品进行DNA酶处理以去除基因组 DNA 的污染，与RNAOligodT混合，进行反转录，所得产物置于 -20℃保存备用。

（3）斜带石斑鱼TLR13基因cDNA全序列的克隆

设计特异性引物TLR13FullF和TLR13FullR，如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，扩增得到的ORF片段大小为2844 bp，电泳结果如附图1所示，切胶回收目的条带并纯化产物。将产物连接至pTZ57R/T载体，转化DH5α大肠杆菌，挑选阳性克隆测序。经BLAST同源性分析表明，目的产物确为TLR13基因的cDNA 序列片段。PCR扩增中用到的序列如下表：

实施例2重组质粒 pEGFP-N3-TLR13及pcDNA3.1-13的构建及其验证

根据TLR13基因全长cDNA序列，在编码基因的两端序列合成一对引物，上游引物含有XhoI切割位点，序列，下游引物含有BamHI切割位点，以含有TLR13编码基因的pTZ57R/T质粒为模板，进行>

实施例3重组质粒 pEGFP-N3-TLR13及pcDNA3.1-13的过表达效果

将适量的293T细胞（每孔细胞数约为1×10 6）接种到96孔板中，次日待细胞长至60％~80％时即可转染，转染前换为无血清的Opti-MEM培养液。每孔分别转染150 ng重组质粒pEGFP-N3-TLR13，pcDNA3.1-13或它们的空白载体对照。转染液为：A液（Opti-MEM 培养液10μL，加入质粒，混匀），B液（Opti-MEM培养液10 μL，加入0.25μL lipo3000，混匀，室温放置5min）；将A液和B液轻轻混匀即为转染液，室温放置20 min，加入相应的转染孔中，孵育6小时；最后换为含有10%的胎牛血清的DMEM培养液。

转染36小时后收集细胞，提取总RNA，逆转录，进行荧光定量PCR检测TLR13的mRNA水平，采用的扩增引物为TLR13 RTF及TLR13 RTR，其中选取的内参基因为EF1，采用的扩增引物为EF1RTF1及EF1RTR1。根据检测得到的CT值进行结果的分析，利用2-△△ct的方法计算出TLR13的相对表达量，实验结果如附图3所示。检测中用到的引物序列如下表2：

从附图3中可以看出，转染重组质粒pEGFP-N3-TLR13或pcDNA3.1-13后，都可以显著性提高TLR13 mRNA在细胞中的表达水平。结果表明，重组质粒构建成功，转染后可以在细胞中显著提高TLR13的表达。

实施例4过表达TLR13后对多种炎症因子的mRNA转录上调

将适量的GS细胞（每孔细胞数约为4×10 6）接种到6孔板中，次日待细胞长至50％~60％时即可转染，转染前换为无血清的Opti-MEM培养液。每孔转染2000 ng pEGFP-N3-TLR13或者pEGFP-N3空白载体对照。转染液为：A液（Opti-MEM 培养液50 μL，加入质粒，混匀），B液（Opti-MEM培养液 50 μL，加入4 μL lipo2000，混匀，室温放置5 min）；将A液和B液轻轻混匀即为转染液，室温放置20 min，加入相应的转染孔中，孵育12小时；最后换为含有10%的胎牛血清的L15培养液。

转染48小时后收集细胞，提取总RNA，逆转录，进行荧光定量PCR检测IL-6，IL-1β，IL-12以及TNFα的mRNA水平，其中选取的内参基因为EF1，采用的扩增引物为EF1RTF1及EF1RTR1。根据检测得到的CT值进行结果的分析，利用2-△△ct的方法计算出以上免疫因子的相对表达量，实验结果如附图4所示。检测中用到的引物序列如下表3：

从附图4中可以看出，在GS细胞细胞中过表达TLR13后可以显著性提高IL-1β、IL-6、IL-12、TNFα这几种炎症因子的表达。结果表明，TLR13基因或TLR13蛋白可调节炎症因子的表达。

实施例5 过表达TLR13后对细菌23S rRNA的识别及对下游IFN-β启动子活性的上调

（1）真核细胞的基因转染

将适量的293T细胞（每孔细胞数约为2×10 5）接种到24孔板中，次日细胞待长至50％~60％时即可转染。转染前换为无血清的Opti-MEM培养液。每孔转染700 ng pcDNA3.1-13或pcDNA3.1空白载体对照，200 ng PGL3-IFN-β-Luc报告质粒以及100 ng pRL-TK质粒。转染液为：A液（Opti-MEM 培养液50 μL，加入质粒，混匀），B液（Opti-MEM 培养液 10 μL，加入1.5μL lipo2000，混匀，室温放置5 min）；将A液和B液轻轻混匀即为转染液，室温放置20min，加入相应的转染孔中，孵育4~6 h；最后换为含有5%的胎牛血清的DMEM培养液。

（2）报告基因转录活性检测

转染36 h后，用梯度浓度的ORN Sa19及其突变对照ORN Sa19 Control刺激293T细胞，18 h后收获细胞，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行检测，实验结果如附图5所示，图中显示值为萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的比值。

从附图5中可以看出，TLR13的过表达可以显著性提高细胞对ORN Sa19刺激时介导的IFN-β启动子活性的激活。结果表明，TLR13基因或TLR13蛋白可识别细菌RNA。

实施例6敲降TLR13后对副溶血弧菌RNA介导产生的免疫因子的影响

（1）提取副溶血弧菌RNA

将200 μL副溶血弧菌接种到35 mL培养基中培养12 h，离心分离细菌，利用Trizol试剂法抽提RNA。

（2）TLR13敲降后的副溶血弧菌RNA刺激实验

将适量的GS细胞（每孔细胞数约为1×10 4）接种到96孔板中，次日待细胞长至50％~60％时即可转染，转染前换为无血清的Opti-MEM培养液。所用到的siRNA序列为，siTLR13（序列：sense：5’-GCCUAUCAGCUGUCUCCAUTT-3’；antisense：5’-AUGGAGACAGCUGAUAGGCTT-3’）及Negative Control序列：（序列：sense：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；antisense：5’-AUGGAGACAGC UGAUAGGCTT-3’），稀释浓度为20nM。转染液为：A液（Opti-MEM培养液5 μL，加入0.3 μLsiRNA，混匀），B液（Opti-MEM 培养液 5 μL，加入0.4 μL lipo3000，混匀，室温放置5 min）；将A液和B液轻轻混匀即为转染液，室温放置15 min，加入相应的转染孔中，孵育6 h；最后换为含有10%的胎牛血清的L15培养液。转染40 h后，加入副溶血弧菌RNA进行刺激，刺激所用的RNA的浓度为2 ug/mL，等量的RNA用RNase A（20 mg/mL）在37℃消化1 h作为对照。刺激6 h后，收获细胞，提取总RNA，逆转录，进行荧光定量PCR检测检测各免疫因子表达量，实验结果如附图6所示。

从附图6中可以看出，敲降TLR13后可以显著性抑制副溶血弧菌RNA刺激介导引起的下游炎症因子的激活。结果表明，TLR13基因或TLR13蛋白可识别副溶血弧菌RNA并调节炎症因子。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种斜带石斑鱼天然免疫受体TLR13基因及其真核表达载体与应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2847

<212> DNA

<213> 斜带石斑鱼TLR13基因的核苷酸序列

<400> 1

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aacaatgtga cttgggtaga atgcgcagat cgtgacctca ctggggttcc tgatgacatt 180

ctcataactg tggtaactct agatctcaac ttcaatcaca tctcaaagat aaacaggaca 240

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cagacgttac agctgacata taacaaccta catcaaataa ccgacattgt gcccatctta 540

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gatgacctgc cttttaataa atcaaacctc aggacactat ggctatgtag tgattcaatg 660

aaaaagttca gcattacaag agacgttttt ccccatcttc agtctatcca tttaaatgct 720

aacactggct ttgagtggga tgtaccagac ccaatgtttc tgaggagcct gactactttg 780

gagttatctg tatctgacaa tagttgtgag atgtaccaag tgatgctgaa gagtgccgag 840

tcagtgcagg aactgtcact cctcttttgg caccatgacc gagaaagaga tctggtagac 900

atcgcctgcc aaatgactgc tctgacaagt cttcatttga gtggaattag ctttgtcagt 960

ataaacaaga catttcttca atcttgcact gaaattactg agcttgattt atcatataat 1020

tatttggaag agctgtccga gttttccctc ggatcaataa aacagctcag acgcctggac 1080

ttagtgagaa actccctgtc tagagtgcca cagggtgtca gaggcctctc cacacttgaa 1140

atcctagatc tgagtgtgaa tttcatcagt gagttagact gctctgactt tcaaaatttg 1200

acaaaactag tagaactcaa tctcagccaa aatcgcattt caacactcaa gggatgtgtt 1260

tttcaagatc tgaatgattt gaaagtcctg aacgttgcag aaaatggagt tcatttactt 1320

gttgatttct tcaaattgaa tttacagaaa ctagaagttt tggatttgaa catgaatact 1380

ttgatgcagc tcaaaacaga tgactttgag aatatgtctt ccctcaggtc tctgtattta 1440

gaatcagata cattttacgt tgcccataag ggggcttttg aaggactgga caatcttcaa 1500

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ctgcaacacc tacaaaacct caaaatacat ctcacgtctt catatgacag caagagttct 1620

tgtcaaaaaa atgagacaca tttatccatt ttcccattac ctttcttgaa gagtctactg 1680

atacaaaatt atgattggta tcatgaaatc tcacctgatt ttctgacagg tctgaattct 1740

ttagattact ttggagcgga gaaattattt acagagtcac ctcacccaga cacattcaga 1800

tatactcccc tcctgacaag tcttcacata tttcaaagtg atctgcaagt cttaaaccct 1860

gaagtgcttc agccaatcct caacctgcag gctctcgacc tttccaaaaa caagctcaga 1920

tctctggatt ttctagccca ggtcaacctc tctgcactca gagtgttgac agttagagac 1980

aatgaattga ccgtgatcaa cgacatggtc tttcagtctc tccctgcact gacatacctg 2040

gacctgactg gtaacccttt cacttgtaac tgctctaaca ctggctttat ccaatgggtg 2100

aagaacaaca accaaacaca ggttgttaat gcctaccagt acacttgtac ctttcctgtg 2160

gctaaacaag gaacaaagtt gctggacttt gacgtccagt cctgttggat ggacgttagc 2220

ttcctctgct tcatttctag cttttgcctg acgctgatga ttctcctcac atccttcatc 2280

taccactttc tgaggtggca gctagcctac acctactacc tcttcctggc cttcctctac 2340

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tggagactct gtctgcacca cagagacttc caaccaggta aacccatcat agacaacata 2520

acagacgcca tctacggcag caggaagacc atctgtgtga tcacccggcg ttacctgcag 2580

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<213> 斜带石斑鱼TLR13基因的全长cDNA序列

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catgggttca aacaacctca taaacctgac aaactatatg tttcagggcc tgtggaagtt 540

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tagtgattca atgaaaaagt tcagcattac aagagacgtt tttccccatc ttcagtctat 840

ccatttaaat gctaacactg gctttgagtg ggatgtacca gacccaatgt ttctgaggag 900

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agacacattc agatatactc ccctcctgac aagtcttcac atatttcaaa gtgatctgca 1980

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<210> 3

<211> 948

<212> PRT

<213> 斜带石斑鱼TLR13蛋白氨基酸序列

<400> 3

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1 5 1015

Ile Leu Leu Pro Ser Ala Leu Leu Pro Phe Asn Pro Leu Leu Ala Phe

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Ser Leu Lys Asn Cys Thr Val Asp Asn Asn Val Thr Trp Val Glu Cys

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