人质子感知受体G2A基因的克隆、真核表达载体构建及瞬时转染293T细胞

摘要

目的:本研究克隆了G2A基因并构建表达载体,瞬时转染293T细胞,为下一步考察其下游细胞应答奠定基础.方法:以含有G2ACDS序列的质粒pET-G2A为模板，设计HindIII和BamHI酶切位点进行PCR;PCR产物连入pMD-19T克隆载体，转入DHSa大肠杆菌感受态细胞，酶切鉴定为阳性质粒后送测;将目的片段连入真核表达载体pEGFP-N3，测序证明目的片段插入顺序正确，无碱基突变后用LipofectamineTM2000转入293T细胞，提取细胞总RNA，反转录为cDNA后进行Real time PCR检测外源基因的表达情况。结果:pEGFP-N3(4.7kb)和重组载体pEGFP-N3-G2A经HindIII和BamH I双酶切的电泳图，鉴定符合预期结果。Real time PCR检测G2A基因的表达，检测到G2A基因表达水平较未转染的细胞提高153倍。结论:本实验成功克隆了G2A基因并构建了真核表达载体pEGFP-N3-G2A质粒，用脂质体介导瞬时转染293T细胞;实验中发现293T细胞具有极低量的G2A基础表达。转染pEGFP-N3-G2A后，293T细胞中G2AmRNA表达量较未转染的细胞提高153倍，为下一步研究其质子感知后的信号通路奠定了基础。