一种酿酒酵母突变菌株及其诱变和筛选方法

摘要

本发明公开了一种酿酒酵母突变菌株及其诱变和筛选方法，酿酒酵母突变菌株为球形或卵圆形，直径5～10μm，表面凸起，乳白色；无真菌丝，有同心圆圈，所述突变菌株的生长速度与出发菌株相比提高10‑40％，所述突变菌株能够在45℃高温下生长，保藏号为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.14448。生长的最适pH值为4.5‑6.0。所述突变菌株是出发菌株经地面模拟空间诱变和/或空间诱变试验后，筛选的生长速度快的单菌落，地面模拟空间诱变为振动试验和/或真空低能粒子诱变。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母突变菌株及其诱变和筛选方法。

背景技术

目前，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)属酵母属，是酵母属中的酿酒酵母种。酿酒酵母是酵母菌中最重要、应用最广泛的一类，在发酵、功能性营养源和生物领域等有重要作用。酿酒酵母为球形或卵圆形，直径5～10μm，无真菌丝，细胞通过重复出芽繁殖。酿酒酵母菌体中富含β-葡聚糖和甘露寡糖等活性多糖、蛋白质、谷胱甘肽等活性小肽、核酸、氨基酸、维生素等营养功能成分，这些营养物质被不断地研究开发并应用于医药、功能食品和饲料等多个行业。

酿酒酵母菌含丰富的蛋白质、维生素、矿物质、多糖和许多生物活性物质，有许多完整的酶系，并含有2.5％～10％的核糖核酸(ribose nucleic acid，RNA)。这些营养功能成分对机体的免疫、抗肿瘤、抗氧化和消化功能等有重要作用，是维持机体健康的重要成分。目前，这些功能物质对人体、动物的作用及机制一直在不断地研究并对其开发应用。

酿酒酵母细胞壁含有丰富的β-1,3-葡聚糖。β-葡聚糖是通过β-1,3/1,6糖苷键的方式结合形成的一种结构多糖，位于酵母细胞壁的内层，占细胞壁干质量的30％～60％。β-葡聚糖在食品工业得到广泛应用，并具有刺激免疫、降低血胆固醇、抗肿瘤和预防炭疽热等显著医学功效；此外，β-葡聚糖在增强溶菌酶活性、补体活性和杀菌活性方面均具有显著的作用。TORELLO C O等的研究结果表明，口服β-1,3-D-葡聚糖可促进释放生物活性的细胞因子，从而产生骨髓免疫活性和增强荷瘤小鼠的抵抗力。

酵母菌株发酵生产功能性物质，一般由两方面的特性决定：一是菌株的生长能力；二是菌株产功能性物质的能力。由于微生物变异快，因此微生物发酵工程一直受到生物工程学科的重视。微生物的诱变方法一直受到广大科研人员的重视，是微生物发酵工程领域的重点研究方向之一。诱变方法一直是一个只有更好，没有最好的研究课题；同时高效的诱变方法以及从众多的突变菌株中筛选出高产功能性物质的菌株，一直是微生物诱变工作的难点。空间诱变技术作为酵母菌新的诱变手段具有诱变有益突变率高等显著特点，筛选模式简便，不失为获得高效菌株的新手段之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种酿酒酵母突变菌株及其诱变和筛选方法，提供的经过地面模拟空间诱变和/或空间诱变的酿酒酵母突变菌株的生长速度与出发菌株相比提高了10-40％，筛选方法简单，解决了微生物诱变工作困难的问题。

为了实现上述目的，本发明提供的一种酿酒酵母突变菌株，为球形或卵圆形，直径5～10μm，表面凸起，乳白色；所述突变菌株是酵母菌株经地面模拟空间诱变和/或空间诱变试验后，筛选的相对生长速度快的单菌落，分类命名：酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，微生物株：shenzhou 11-4，保藏号为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.14448。

优选地，所述突变菌株的生长速度与酵母菌株出发菌株相比提高10-40％，所述突变菌株能够在45℃高温下生长，生长的最适pH值为4.5-6.0。

酿酒酵母突变菌株的生理生化特点为：生长温度范围比出发菌株更广，耐高温，45℃仍能够生长，最适生长温度为28-30℃，突变菌株的生长能力显著进步。突变菌株的生长速度与酵母菌株出发菌株相比提高10-40％，突变菌株的生长最适pH值为4.5-6.0，比诱变前的出发菌株适应范围变宽，诱变前出发菌株的适应范围为pH5.0-6.0，突变菌株的生长能力显著进步。

优选地，所述突变菌株无真菌丝，有同心圆圈。

酿酒酵母突变菌株，有同心圆圈，诱变前的酵母菌株出发菌株无同心圆圈，易挑取。

优选地，地面模拟空间诱变为振动试验和/或真空低能粒子诱变。

振动试验，将长满菌株的平板固定在双振动台上，在0-400kN下振动1小时，其中前0.5小时为低频正弦振动试验，后0.5小时为随机振动试验；真空低能粒子诱变，将长满菌株的平板放入空间低能综合辐照实验设备中，在10^-3-10^-6Pa真空度下辐照30-180分钟后回收，辐射总剂量为1×10¹⁴eV-4×10¹⁴eV。

优选地，所述空间诱变试验中，空间环境为：微重力10^-3-10^-6g，振动0-400kN；太空舱内辐射剂量0.1-0.9mGy。

将从地面模拟实验中挑选出的生长更迅速酿酒酵母菌株接种在固体培养基上，将接完种的斜面放入培养箱中，培养3天，以便于进行空间诱变试验。在无菌条件下，刮取一块培养好的斜面加入搭载管中，封口膜封口，将搭载管交给发射基地有关人员，随飞船进行空间诱变试验，最后得到了生长速度与出发菌株相比提高了10-40％的突变菌株。采用地面模拟诱变，然后进行空间诱变的联合诱变方法可以得到生长能力显著进步的酿酒酵母突变菌株。

本发明还提供一种酿酒酵母突变菌株在发酵、生物、医药、发酵、功能性营养源、食品或饲料方面的应用。

本发明还提供一种酿酒酵母突变菌株的诱变方法，具体步骤为：

(1)出发菌株的培养：将酿酒酵母出发菌株接种在YEPD固体培养基上进行培养，培养1-10天，筛选出生长速度更快的酿酒酵母菌株待用；

(2)诱变：将筛选的菌株经地面模拟空间诱变和/或空间诱变，诱变菌株做倍比稀释，取10^-4和10^-5倍稀释液进行培养2-7天。

优选地，地面模拟空间诱变为振动试验和/或真空低能粒子诱变。

先采用地面模拟空间诱变，然后进行空间诱变的联合诱变方法得到的酿酒酵母突变菌株生长更快速，突变菌株的生长速度与出发菌株相比提高10-40％，代谢效率更高；耐高温，生长适应范围变宽，生长能力显著进步。

本发明还提供一种酿酒酵母突变菌株的筛选方法，具体步骤为：

(1)筛选：在配好的YEPD固体培养基中加入酿酒酵母代谢产物，组成筛选培养基，将诱变菌株接种于筛选培养基上培养，筛选出生长速度更快、菌落形态变化较大的菌株作为备选菌株。

(2)发酵：将备选菌株接种于液体培养基中，摇床培养发酵，最终依靠发酵液的OD值确定生产速度快的酿酒酵母突变菌株。

优选地，所述酿酒酵母代谢产物为乙酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸、丁酸和/或己酸，所述代谢产物的浓度为10^-3g/L—10²g/L

本方法将高浓度代谢终产物加入到普通培养平板中，基于微生物代谢途径中代谢产物反馈抑制原理，在这样平板中生长状况良好的菌株，通常都是生长更快速、代谢效率更高的优良菌株，此种平板筛选方法高效、简便。本方法使用单独培养平板筛选出高产菌株，和传统筛选方法比较，降低了工作量50％-100％，并大大降低了筛选的盲目性。本方法操作过程简单，所需试剂和材料均为实验室常见的普通试剂。

本发明提供的一种酿酒酵母突变菌株及其诱变和筛选方法，具有如下有益效果：

先采用地面模拟空间诱变，然后进行空间诱变的联合诱变方法得到的酿酒酵母突变菌株生长更快速，突变菌株的生长速度与出发菌株相比提高10-40％，代谢效率更高；

酿酒酵母突变菌株的生长温度范围比出发菌株更广，耐高温，45℃仍可生长，突变菌株的生长最适pH值为4.5-6.0，比诱变前的出发菌株适应范围变宽，诱变前出发菌株的适应范围为pH5.0-6.0，突变菌株的生长能力显著进步；

酿酒酵母突变菌株的生产方法，基于微生物代谢途径中代谢产物反馈抑制原理，此种平板筛选方法高效、简便；

本方法使用单独培养平板筛选出高产菌株，和传统筛选方法比较，降低了工作量50％-100％，并大大降低了筛选的盲目性；

本方法操作过程简单，所需试剂和材料均为实验室常见的普通试剂。

附图说明

图1为本实施例的酿酒酵母突变菌株在YEPD培养基上的特征形态示意图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

本发明提供一种生长更加快速的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)shenzhou 11-4，提供的菌株其生长速度与出发株相比提高了10-40％。相应地还提供了上述突变菌株的诱变方法和筛选方法。

一株生长更加快速的酿酒酵母突变菌株，其命名为酿酒酵母shenzhou 11-4，该菌种已于2017年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14448，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。

酿酒酵母菌株在YEPD固体培养平板上，形态特征为：酵母菌为球形或卵圆形，直径5～10μm，无真菌丝，表面凸起，乳白色，光滑湿润，有同心圆圈(空间诱变前无同心圆圈)，易挑取。该菌株的生理生化特点为：生长温度范围比出发菌株更广，耐高温，45℃仍可生长，最适生长温度为28-30℃；生长的最适pH值4.5-6.0，比诱变前的出发菌株适应范围变宽，诱变前出发菌株的最适pH范围为pH5.0-6.0。

出发菌株为用于育种的原始菌株。

YEPD培养基的配制：酵母粉10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,蒸馏水1000mL,自然pH,经过120-125℃湿热灭菌25min。

一种生长更加快速的酿酒酵母shenzhou 11-4的诱变方法，是先采用地面模拟空间诱变，然后进行空间诱变的联合诱变方法。

实施例1

地面模拟空间诱变前的菌株培养：将出发菌株接种在固体培养基的平板(Φ9cm)上进行培养，当菌株长满整个平板后待用。菌株平板的制作方式如下：：1)葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸出粉1％，琼脂1.5-2.0％，无菌蒸馏水，自然pH；2)在125℃下灭菌25min；3)每个平皿倒培养基20-30ml，30-33℃培养24小时后，无菌的平皿可以使用；4)将出发菌株接种后在25-35℃恒温培养，1-10天筛选出生长速度更快的菌株待用。

对平板上的酿酒酵母菌株进行以下一组或几组筛选试验，筛选出生长速度更快的酿酒酵母菌株：

1、地面模拟空间诱变

(1)真空低能粒子诱变：将长满酿酒酵母菌株的平板放入空间低能综合辐照实验设备中进行真空低能粒子辐照试验。1小时后回收，将辐照试验后菌株加入种子液中进行扩增培养。辐射剂量为：5×10¹⁰e/cm²×S和10×10¹⁰e/cm²×S，辐照时间为1小时，辐照一个小时总剂量为：1.8×10¹⁴eV和3.6×10¹⁴eV。

(2)培养：在无菌条件下取培养面积为0.5平方厘米的地面模拟空间诱变样品，用5毫升无菌水洗脱菌体到无菌离心管中，用移液器吸打均匀菌体洗脱液，取0.5毫升该菌液到4.5毫升无菌水中，吸打均匀，以此类推，做倍比稀释。取10^-4和10^-5稀释液涂布到平板培养基，每块平板上涂50-250微升稀释菌液，每个稀释梯度涂多块平板。待菌液被培养基吸收后于培养箱中25-35℃倒置培养2-7天。

(3)筛选：选取生长迅速、单菌落大的菌株继续培养、保存，进行下一步空间诱变试验。

2、空间诱变试验

(1)神舟十一号搭载样品准备

将地面模拟空间诱变筛选出的菌株接种在固体培养基上，以便于进行空间诱变试验。将接完种的斜面放入培养箱中，25～35℃条件下进行培养3天，以便于进行空间诱变试验。在无菌条件下，刮取一块培养好的斜面加入2mL搭载小管中，封口膜封口，再将搭载小管装入容积为30-50mL的搭载大管中。送交搭载前于4℃保存。将搭载大管交给发射基地有关人员，安装在神舟十一号飞船上，随飞船进行空间诱变试验。此搭载管放入“神舟十一号”飞船中，在太空中随飞船飞行33天后回收。

(2)实施空间诱变的环境条件

此次空间诱变，主要是在神舟十一号与天宫二号交会对接后展开的，空间环境的相关数据为：距离地面3393公里；飞行30天；微重力水平：10^-3-10^-6g；辐射剂量测试结果表明，太空舱内辐射剂量0.1-0.9mGy，本次飞行平均日剂量在0.5mGy。天宫二号的温度范围：19-23℃，湿度为50％左右。氧气浓度与地面一致。

(3)培养：回收搭载管。在无菌条件下取培养面积为0.5平方厘米的搭载回收样品，用5毫升无菌水洗脱菌体到无菌离心管中，用移液器吸打均匀菌体洗脱液，取0.5毫升该菌液到4.5毫升无菌水中，吸打均匀，以此类推，做倍比稀释。取10^-4和10^-5倍的稀释液涂布到平板培养基，每块平板上涂50-250微升稀释菌液，每个稀释梯度涂多块平板。待菌液被培养基吸收后于培养箱中25-35℃倒置培养2-7天。

3、筛选

(1)筛选平板的制作

1)筛选平板由以下几种物质组成：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸出粉1％，琼脂1.5-2.0％，无菌蒸馏水，自然pH；1ml“乙酸乙酯:己酸＝1:10”的混合液，混合浓度为10g/L，自然pH。

2)125℃灭菌25min

3)取灭好菌的直径为90mm的培养皿，每个培养皿倒培养基30ml，37℃培养24小时，选取无菌平板进入下一个工作环节，污染平板灭菌销毁。

(2)接种

挑选经空间诱变后生长迅速的单菌落，划线法接种于预先制备好的筛选平板上。

(3)培养

将接种好的平板于霉菌培养箱中，30℃恒温培养3天。

(4)菌落挑选

将平板上生长速度快的单菌落挑出。划线法接种到口服液1号生产培养基上，即可进入生产发酵环节。

(5)发酵

1)液体培养液以每升计算(分装4瓶)

液体培养液成分液体培养液含量麦芽汁300mL葡萄糖60.8g碳酸钙0.2g硫酸锌0.05g蒸馏水700mL

在121℃下灭菌20min。

2)接菌

①取搭载前、搭载后单菌落平板，接种于液体培养基中；

②每瓶接种1环菌种；

③搭载前、搭载后各做2-3组平行；

④空白培养基预留2-3瓶；

⑤取搭载前后的单菌落平板接种于液体培养基中，每瓶接1个单菌落，下同③-④；

3)摇床培养

30℃、200r/min；空白培养基与菌液同时培养。

4)接菌混匀(此时为培养0h)、每隔一定时间进行取样检测

①检测方法

同一时间取空白培养基及菌液进行紫外分光光度计测定，以空白培养基为对照，波长600nm，测定菌液吸光度；

吸光度的＜1的情况下，采用检测值；吸光度＞1的情况下，以空白培养基未稀释液为对照，对菌液进行10倍、100倍或更高倍数稀释，至吸光度＜1；

②检测结果

实施例1试验检测结果

编号名称搭载前OD600搭载OD6001培养0h0.4490.4522培养5h-1.0071.0543培养7h4.6604.9904培养24h9.7359.8805培养72h11.00012.35

5)结果

经发酵结果验证，诱变菌株比原始菌株的生长速率提高了12.27％。

实施例2：

模拟空间诱变前的菌株培养方法同实施例1。

1、地面模拟空间诱变

(1)模拟空间飞行的振动试验：将培养好的酿酒酵母菌平板(Φ9cm)固定在400kN双振动台上，试验1h，开始0.5小时为低频正弦振动试验，后0.5小时为随机振动试验。本试验模拟飞行器发射和返回时所受振动的情况。

(2)培养：在无菌条件下取培养面积为0.5平方厘米的模拟样品，用5毫升无菌水洗脱菌体到无菌离心管中，用移液器吸打均匀菌体洗脱液，取0.5毫升该菌液到4.5毫升无菌水中，吸打均匀，以此类推，做倍比稀释。取10^-4和10^-5倍的稀释液涂布到平板培养基，每块平板上涂50-250微升稀释菌液，每个稀释梯度涂多块平板。待菌液被培养基吸收后于培养箱中25-35℃倒置培养2-7天。

(3)筛选：选取生长迅速、单菌落大的菌株继续培养、保存，进行下一步空间诱变试验。

2、空间诱变试验与实施例1相同。

3、筛选

(1)筛选平板的制作

1)筛选平板由以下几种物质组成：1)葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸出粉1％，琼脂1.5-2.0％，自然pH；1ml“庚酸乙酯：乙酸：丁酸＝1：5：1”的混合液，混合浓度为100g/L，自然pH。

2)在121℃下灭菌25min。

3)取灭好菌的直径为90mm的培养皿，每个培养皿倒培养基30ml，37℃培养24小时，选取无菌平板进入下一个工作环节，污染平板灭菌销毁。

(2)接种

挑选经空间诱变后生长迅速的单菌落，划线法接种于预先制备好的筛选平板上。

(3)培养

将接种好的平板于霉菌培养箱中，30℃恒温培养3天。

(4)菌落挑选

将平板上生长速度快的单菌落挑出。划线法接种到口服液1号生产培养基上，即可进入生产发酵环节。

发酵方法与实施例1相同。

实施例2试验检测结果

编号培养时间h搭载前OD600搭载后OD6001培养0h0.6700.7582培养5h0.7860.8953培养10h8.3808.7904培养25h32.50042.9005培养30h26.70032.600

经发酵结果验证，该菌株的生长速率比出发菌株提高了22.09％，效果十分显著。

实施例3：

模拟空间诱变前的菌株培养方法同实施例1。

1、地面模拟空间诱变试验与实施例1相同。

2、空间诱变试验与实施例1相同。

3、筛选

(1)筛选平板的制作

1)筛选平板由以下几种物质组成：1)葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸出粉1％，琼脂1.5-2.0％，自然pH；1ml乙酸乙酯，溶液浓度为1g/L，自然pH。。

2)121℃灭菌25min

3)取灭好菌的直径为90mm的培养皿，每个培养皿倒培养基30ml，37℃培养24小时，选取无菌平板进入下一个工作环节，污染平板灭菌销毁。

(2)接种

挑选经空间诱变后生长迅速单菌落，划线法接种于预先制备好的筛选平板上。

(3)培养

将接种好的平板于霉菌培养箱中，30℃恒温培养3天。

(4)菌落挑选

将平板上生长速度快的单菌落挑出。划线法接种到口服液1号生产培养基上，即可进入生产发酵环节。

(5)发酵与实施例1相同。

结果：该菌株经发酵验证，该菌株的生长速率比出发菌株提高了13.19％，效果显著。

实施例4：

模拟空间诱变前的菌株培养方法同实施例1。

1、地面模拟空间诱变的振动试验与实施例2中1相同。

(1)模拟空间飞行的振动试验：试验同实施例2中1、(1)模拟空间飞行的振动试验；

(2)培养：模拟后的培养试验同实施例2中1、(2)培养；

(3)筛选：同实施例2的1、(3)筛选；

选取生长迅速、单菌落大的菌株进行模拟空间诱变试验。

2、真空低能粒子诱变实验

(1)真空低能粒子诱变：同实施例1中1、(2)；

(2)培养：同实施例1中的1、(3)；

(3)筛选：同实施例1中的1、(4)。

3、筛选

(1)筛选平板的制作

1)筛选平板由以下几种物质组成：1)葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸出粉1％，琼脂1.5-2.0％，自然pH；1ml“庚酸乙酯：乙酸：丁酸＝1：5：1”的混合液，混合浓度为100g/L，自然pH。

2)121℃灭菌25min

3)取灭好菌的直径为90mm的培养皿，每个培养皿倒培养基30ml，37℃培养24小时，选取无菌平板进入下一个工作环节，污染平板灭菌销毁。

(2)接种

挑选经空间诱变后生长迅速，划线法接种于预先制备好的筛选平板上。

(3)培养

将接种好的平板于霉菌培养箱中，30℃恒温培养3天。

(4)菌落挑选

将平板上生长速度快的单菌落挑出。划线法接种到东方1号生产培养基上，即可进入生产发酵环节。

(5)发酵与实施例1相同。

结果：该菌株经发酵验证，生长速率比出发菌株提高了33.78％，效果十分显著。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。