咪康唑在预防血管破裂中的应用

摘要

本发明涉及咪康唑在制备预防血管出血药物中的应用。本发明还涉及咪康唑在血管外周细胞中，作为MMP9抑制剂的应用。本发明还涉及咪康唑在血管外周细胞中，作为ERK抑制剂的应用。本发明还涉及一种预防血管出血的药物组合物，主要药效成分为咪康唑。本发明还涉及一种抑制血管外周细胞中MMP9表达的药物组合物，主要药效成分为咪康唑。本发明还涉及一种抑制血管外周细胞中ERK磷酸化的药物组合物，主要药效成分为咪康唑。本发明还涉及一种药物组合物，含有U0126和咪康唑。本发明还涉及咪康唑在预防血管异常破裂中的应用。本发明提供了咪康唑在预防血管异常出血中的新用途，可以有效预防血管出血导致的多种疾病。

说明书

技术领域

本发明涉及咪康唑在预防血管破裂中的应用。

背景技术

血管异常破裂会导致多种疾病的发生。心血管疾病长久以来一直是全世界疾病致死的主要原因，其中脑卒中位列前三。2012全球大于有六百七十万人死于脑卒中，占非传染性疾病总死亡率的17％左右(WHO,2015)。出血性脑卒中仅占所有脑卒中的10-15％，但其发生率和死亡率却要高的多。

尽管出血性脑卒中具有相当高的发生率和死亡率，与缺血性脑卒中相比，人们对其分子病理却知之甚少。近期的研究指出，炎症反应是出血性脑卒中发生后的主要细胞细胞事件，伴随有神经元死亡、白细胞侵润以及小胶质细胞/巨噬细胞和星形胶质细胞的激活，主要炎症调节因子包括基质金属蛋白酶(MMPs)、核转录因子2(Nrf2)、血红素氧化酶(HO)以及铁离子(Fe3+)(Wang,2010)。在临床前和临床试验中，很多治疗出血性脑卒中的尝试是基于抗炎原理的，例如介导小胶质细胞/巨噬细胞抑制因子、MMP抑制剂、Nrf2诱导剂、HO抑制剂或是去铁胺(Egashira et al.,2015；Wang,2010)。然而所有这些基于靶点的治疗尝试都未能推展到临床应用。

迄今为止，基于上述原理而发现的药物或手术方法中，尚未出现足够有效、可以进入三期临床的治疗手段。这或许由于出血性脑卒中的治疗靶点尚未清楚，亦或者这种复杂疾 病是由多基因控制，针对单个靶点的治疗见效甚微。近些年，基于表型的药物研发逐渐被人所关注，学术界和工业界均投入很大力度利用包括斑马鱼在内的动物模型开展研发(MacRae and Peterson,2015)。

哺乳动物中金属基质蛋白酶(MMPs)家族包含五大类超过20种蛋白成员，其中MMP2和MMP9属于明胶酶(Cuzner and Opdenakker,1999)。神经血管单元中的多种细胞均可分泌MMP蛋白，在脑部发育过程中起着至关重要的作用——MMPs的高表达疏松细胞外基质以实现神经元细胞的突触生长和细胞迁移(Yong et al.,2001)。在实验动物的缺血性脑卒中、出血性脑卒中和头部外伤模型中，MMP的水平均有上调(Lo et al.,2003)，同时脑卒中病人脑部和血浆中的MMP水平亦明显上调(Clark et al.,1997；Montaner et al.,2001)。持续的MMP活性对生物体而言是有害的，例如向脑组织中直接注射MMP9可以造成细胞死亡和炎症反应(Anthony et al.,1998)。MMP9基因敲除小鼠可以对颅内缺血和头部外伤起到保护作用(Asahi et al.,2001；Wang et al.,2000)，而MMP2基因敲除小鼠并不能抵抗局部缺血的发生(Asahi et al.,2001)。说明在脑卒中和头部外伤过程中，MMP9起着更为主导的作用(Lo et al.,2003)。

临床资料显示，缺血性脑卒中病人若伴有较高的血浆MMP9浓度，非常容易发生出血性脑卒中的转型(Montaner et al.,2001)。另外，在栓塞型局部缺血病人中经常使用纤溶酶原激活物(PA)以化解栓塞，由于MMP9可以被纤溶酶原激活物所激活，导致病人体内MMP9水平上调，容易诱发PA诱导的出血性转型(Lo et al.,2003)。

咪康唑是一种广谱高效的咪唑类抗真菌药物，通过多种通路起到抑制真菌的作用(Quatresooz et al.,2008)。咪康唑以其安全、高效、多效和独特的多方位抑制真菌的特点，而被广泛应用于皮肤真菌病中。咪康唑的化学结构式如式I所示，咪康唑的硝酸盐的化学结 构式如式II所示。

发明内容

为了解决现有技术中，血管异常出血导致的各种疾病预防效果差的现状，本发明实施例提供如下技术方案。

作为本发明的一个方面，涉及咪康唑在制备预防血管出血药物中的应用。具体来讲，所述应用包括咪康唑在制备预防脑出血性脑中风药物中的应用。具体的，脑出血性脑中风是指MMP9过表达导致的脑出血性脑中风。

作为本发明的另一个方面，涉及咪康唑在血管外周细胞中，作为MMP9抑制剂的应用。具体来讲，所述应用包括咪康唑在血管外周细胞中，作为MMP9表达抑制剂的应用。

作为本发明的再一个方面，涉及咪康唑在血管外周细胞中，作为ERK抑制剂的应用。具体来讲，所述应用包括咪康唑在血管外周细胞中，作为ERK磷酸化抑制剂的应用。

作为本发明的又一个方面，涉及一种预防血管出血的药物组合物，主要药效成分为咪康唑。

作为本发明的又一个方面，涉及一种抑制血管外周细胞中mmp9表达的药物组合物， 主要药效成分为咪康唑。

作为本发明的又一个方面，涉及一种抑制血管外周细胞中ERK磷酸化的药物组合物，主要药效成分为咪康唑。

作为本发明的又一个方面，涉及一种药物组合物，含有U0126和咪康唑，具体比例可以为1:1。

作为本发明的又一个方面，涉及咪康唑在预防血管异常破裂中的应用。具体来讲，所述应用包括咪康唑在预防脑出血性脑中风的应用。

本发明提供了咪康唑在预防血管异常出血中的新用途，可以有效预防血管出血导致的多种疾病。

附图说明

图1：咪康唑对斑马鱼脑出血突变体的出血抑制效果图。

图2：咪康唑对大鼠肠系膜出血模型的出血抑制效果图。

图3：咪康唑在斑马鱼中对MMP9的表达影响结果图。

图4：MMP9抑制剂在斑马鱼中对MMP9表达的抑制结果图。

图5：咪康唑在大鼠中对MMP9的表达影响结果图。

图6：咪康唑与PD在斑马鱼中抑制ERK磷酸化的效果图。

图7：咪康唑与U0126在斑马鱼中抑制ERK磷酸化的效果图。

图8：咪康唑与U0126混合使用于斑马鱼中抑制ERK磷酸化的效果图。

具体实施方式：

实施例1：

利用o-dianisidine染色可以标记活体胚胎中红细胞的数量和位置，因而可以比较出斑马鱼脑出血突变体与无出血胚胎在红细胞水平的差异。受精后2天的胚胎中，无出血胚胎的红细胞均分布于心脏、总主静脉、背主动脉以及其它主要血管中；与其相比，对照组突变体的红细胞主要聚集在脑部，总主静脉红细胞明显减少，而咪康唑处理组胚胎脑部的红细胞堆积现象明显改善，总主静脉红细胞数量增加。由此说明，咪康唑对斑马鱼脑出血突变体的出血表型有显著的抑制作用，而并未影响其红细胞数量。

咪康唑对斑马鱼脑出血突变体的出血抑制效果随药物浓度增加而增强，5μM浓度的咪康唑处理突变体，可以显著降低其出血率约80％(图1)。

与其在斑马鱼中效果类似，咪康唑亦可抑制哺乳动物中的出血表型。为方便研究，我们建立了大鼠肠系膜出血模型并检测咪康唑在该模型中的作用。实验时，向麻醉后的大鼠静脉注射生理盐水作为对照或30000UI/kg尿激酶作模型组；两组再各分为三组，分别用DMSO-生理盐水、5mg/kg咪康唑－生理盐水和10mg/kg咪康唑－生理盐水提前30分钟预处理，观察肠系膜上出血点数量和总出血面积的变化。生理盐水处理组中，DMSO-生理盐水对照组在观察的两小时内无明显出血表型，5mg/kg或10mg/kg咪康唑－生理盐水组亦未观察到明显出血。尿激酶处理的模型组中，在建模后约60分钟起出现出血表型，且出血点数量和出血面积都随时间延长而增加。用5mg/kg或10mg/kg咪康唑－生理盐水预处理后，出血点数量和出血面积随咪康唑浓度升高而明显减少。对其进行生物学统计，测量出视野内出血点数量和出血面积，分别除以总血管长度，每组动物数量大于六只，得到如图所示的统计结果(图2)。说明与斑马鱼中作用保守一致，咪康唑可保护大鼠中尿激酶诱导的肠系膜出血。

具体实验过程如下：

斑马鱼实验

原料：o-dianisidine(Sigma-Aldrich，D9143)，乙酸钠(北京化工厂)，30％过氧化氢(北京化工厂)

实验动物：野生型斑马鱼(TL，从斑马鱼国际资源中心ZIRC购得)，脑出血突变体(ENU诱导突变得到)

实验步骤：

1.配置o-dianisidine染色液

组分体积14％o-dianisidine2ml1M pH4.5乙酸钠500μl去离子水2ml30％过氧化氢100μl

2.收集野生型和脑出血突变体胚胎，在受精后6小时向胚胎中加入5μM咪康唑或一定量DMSO作对照，胚胎于28℃培养；受精后24小时洗去药品，换入新鲜胚胎培养液，胚胎培养于28℃。

3.受精后2天，取野生型－DMSO、野生型－咪康唑、突变体－DMSO和突变体－咪康唑胚胎各20枚左右，用尖头镊子小心剥去卵膜，经胚胎培养液冲洗干净后移至玻璃凹槽中并尽可能干净地去除胚胎培养液。

4.向胚胎滴加500-800μl新鲜配置的o-dianisidine染色液，避光染色20分钟。

5.染色完毕，用去离子水轻柔洗涤三遍，直接观察、照相并统计。

大鼠实验

原料：尿激酶(阿拉丁，9039-53-6)，生理盐水，二甲基亚砜(DMSO，Amresco，0231)，乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司，30191228)

实验动物：200克雄性Wistar大鼠(从北京维通利华购得)

实验步骤：

1.200g雄性Wistar大鼠通过大腿肌肉注射2ml 20％乌拉坦麻醉剂。

2.彻底麻醉后在左颈静脉和左股静脉双插管，在观察盘中使大鼠右侧卧，轻柔分离出肠系膜，选取合适视野使其置于观察窗得适宜位置。

3.将放置的大鼠连观察盘转移至37℃恒温箱，向肠系膜上间断滴加生理盐水保持湿润。恒温箱与显微镜相连，可以直接观察并拍摄。

4.提前30分钟通过股静脉插管用含DMSO的生理盐水或咪康唑(5mg/kg或10mg/kg)预处理。

5.录入肠系膜微循环的基准影像(baseline)后，通过颈静脉插管注入生理盐水作对照组或30000UI/kg尿激酶(uPA)建立模型组。

6.之后每隔30分钟录入一次影像，总计录入2小时。

7.全部录入后，对图像进行分析并统计各时间点中，肠系膜上出血点数量和出血面积。

实施例2

细胞外基质蛋白中的金属基质蛋白酶(MMPs)是维持血管稳定性的重要组分之一(Xing et al.,2012)。细胞外MMPs表达量升高增强细胞外基质(ECM)中的蛋白水解过程，有利于发育过程中的细胞分裂与迁移。在脑损伤过程中MMPs也是至关重要的炎症调节因子(del Zoppo,2010)。

斑马鱼基因组中MMP家族有很多成员，其中得到良好注释的只有六个：mmp2,mmp9,mmp13b,mmp14a,mmp14b和mmp23aa。因而首先，我们用定量PCR的方法对这六个基因的转录情况进行检测。分别取受精后2天的野生型、脑出血突变体和咪康唑处理的突变体胚胎，经过定量PCR发现，只有mmp9的表达在突变体中明显升高，而在咪康唑处理的突变体中表达量降至与野生型组相当的水平；其它mmp的表达变化无统计差异。进一步的实验表明，与野生型对照组相比，Mmp9的蛋白表达和RNA转录水平在斑马鱼脑出血突变体中有明显上调；咪康唑可以下调突变体中异常增高的MMP9表达水平，而并不影响野生型的正常表达(图3)。用MMP9抑制剂在受精后6-24小时处理斑马鱼脑出血突变体，与对照组相比，也可将出血率从约100％降至50％左右(图4)。

已有的研究表明，尿激酶剪切前体纤溶酶原(pro-plasminogen)为纤溶酶原(plasminogen)，后者可剪切前体MMP9(pro-MMP9)成为有活性的MMP9；胞外基质中MMP9含量升高后，蛋白水解过程增强，使基质结构松散(Smith and Marshall,2010)。在尿激酶诱导的大鼠肠系膜出血模型中，尿激酶激活胞外基质中MMP9降解胞外基质，降低血管稳定性从而产生出血。与生理盐水组相比，模型组中MMP9表达上调；模型组中，5mg/kg或10mg/kg咪康唑预处理样品的MMP9表达得到明显下调恢复，而生理盐水组的预处理样品无显著变化(图5)。

综上所述，斑马鱼脑出血突变体和大鼠中尿激酶诱导的肠系膜出血模型中，出血表型的发生是由于MMP9的过量表达而导致胞外基质异常降解引起的，咪康唑通过下调MMP9的表达而起到出血抑制的作用。

具体实验过程如下：

斑马鱼实验

原料：TriZol(Invitrogen),PrimeScript RT reagent kit(Takara，RR037A)，SYBR Premix DimerEraser(Takara，RR091a)

实验动物：野生型斑马鱼(TL，从斑马鱼国际资源中心ZIRC购得)，脑出血突变体(ENU诱导突变得到)

实验步骤：

1.收集野生型和脑出血突变体胚胎，在受精后6小时向胚胎中加入5μM咪康唑或一定量DMSO作对照，胚胎于28℃培养；受精后24小时洗去药品，换入新鲜胚胎培养液，胚胎培养于28℃。

2.受精后2天，取50枚左右各组胚胎用胚胎培养液漂洗。漂洗干净后转移至无RNA酶的离心管中，尽可能多的去除液体，迅速加入1ml TriZol室温裂解，如有需要可辅以研磨棒或注射器。充分裂解后，加入200μl无RNA酶的氯仿震荡15s，室温静置5分钟。4℃，10000g离心15分钟，将上清转移至新的离心管中，注意不要吸入蛋白层。向上清中加入500μl无RNA酶的异丙醇，轻柔混合均匀，室温沉淀10分钟。4℃，10000g离心5分钟，弃上清。沉淀用1ml70％乙醇漂洗，4℃，7500g离心5分钟。弃上清，充分晾干后，用10-20μl无RNA酶水溶解沉淀，即得总RNA。保存于-80℃冰箱。

3.设计并合成定量PCR引物，使PCR片段长度为100-200bp，退火温度相近。

4.总RNA用PrimeScript RT reagent kit试剂盒反转录得到单链cDNA文库。37℃反应20分钟，85℃热处理5秒使反转录酶失活，4℃冷却。可保存于-20℃。

5.用SYBR Premix DimerEraser试剂盒进行定量PCR实验，并对实验结果进行统计分析。

大鼠实验

原料：anti-MMP9(Sigma-Aldrich，HPA001238)，尿激酶(阿拉丁，9039-53-6)，生理盐水，二甲基亚砜(DMSO，Amresco，0231)，乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司，30191228)

实验动物：200克雄性Wistar大鼠(从北京维通利华购得)

实验步骤：

1. 200g雄性Wistar大鼠通过大腿肌肉注射2ml 20％乌拉坦麻醉剂。

2.彻底麻醉后在左颈静脉和左股静脉双插管，并通过股静脉向大鼠注射含DMSO的生理盐水或咪康唑(5mg/kg或10mg/kg)预处理。30分钟后，通过颈静脉插管注入生理盐水作对照组或30000UI/kg尿激酶(uPA)建立模型组。

3. 2小时后，大鼠处死并迅速取材。截取适量长度的小肠，以靠近盲肠端为宜。用预冷的生理盐水充分清洗，沿肠中线剪开肠管后，用棉棒轻柔去除黏膜层，移至吸水纸上，充分吸干水分。在吸水纸干燥处用弯头镊子刮下浆膜层，移至冻存管，用液氮迅速冷冻，冷冻完全后转移至-80℃冰箱保存。所有操作均在冰上进行，动作迅速。

4.蛋白质的提取。

取适量肠组织在液氮中用研钵充分研碎。称量后，向100mg组织中加入100μl蛋白裂解液，适量超声震荡裂解细胞。4℃12000g离心10分钟，取上清，分装后存于-80℃冰箱。

5.蛋白印记实验。

取适量分装好的蛋白裂解液，与5X蛋白上样缓冲液(含巯基乙醇)混合均匀,沸水煮10分钟，迅速冷却，备用。

配制8％的SDS-PAGE凝胶。上样后恒压电泳，浓缩胶中保持90V，分离胶120V。电泳至适当位置后，低温恒流200mA转移至PVDF膜。将含有蛋白样品的PVDF膜正面朝上，用封闭液室温封闭2小时后，用含有anti-MMP9的封闭液4℃孵育过夜。洗去一抗后，TBST漂洗3遍，每遍10分钟。用含有二抗的封闭液室温孵育2小时。TBST漂洗3遍，每遍10分钟。最终，用ECL发光液显色并拍照。所得蛋白条带用ImageJ定量。

实施例3

之前的研究表明，在MMP9和胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)在转录和转录后水平调节上存在相当紧密联系(Garavello et al.,2010)。MMP9可被诱导表达，其表达被很多转录因子所调控，包括激活蛋白1和2(AP1/2)、特化蛋白1(SP1)、NF-B和多瘤增强子A结合蛋白3/Ets(PEA3/Ets)(St-Pierre et al.,2004)。通过Ras/Raf/MEK/ERK通路，这些转录因子被激活、转移进入细胞核，进而调控MMP9的表达(Chang et al.,2011；Garavello et al.,2010；Wu et al.,2013)。ERK1/2对MMP9的调控十分复杂，甚至于在不同种类的细胞中表现出完全相反趋势的调控。然而比较确定的是在很多神经疾病如缺血性脑卒中中，MEK/ERK激活MMP9的过量表达(Maddahi et al.,2009)。因此，推测在斑马鱼脑出血突变体中，Erk1/2亦增强了Mmp9的表达。

为了验证这一点，首先检测野生型与突变体斑马鱼在有或无咪康唑处理情况下Erk1/2的活性，即磷酸化Erk1/2的表达。免疫印记实验表明，与野生型对照组(DMSO处理)相比，脑出血突变体的胚胎中磷酸化Erk1/2占总Erk1/2的比例明显升高，说明突变体中Erk1/2活性增强；咪康唑处理突变体后，升高的磷酸化Erk1/2水平得到下调恢复，而野生型中无显著区别，说明咪康唑降低斑马鱼脑出血突变体中异常增强的Erk1/2活性

具体实验过程如下：

原料：anti-ERK(anti-P42/44,cell signaling technology,#4695)，anti-pERK(anti-pP42/44,cell signaling technology,#4370)，Goat anti-rabbit IgG-HRP(Abmart，M21001)

实验动物：野生型斑马鱼(TL，从斑马鱼国际资源中心ZIRC购得)，脑出血突变体(ENU诱导突变得到)

实验步骤：

1.收集野生型和脑出血突变体胚胎，在受精后6小时向胚胎中加入5μM咪康唑或一定量DMSO作对照，胚胎于28℃培养；受精后24小时洗去药品，换入新鲜胚胎培养液，胚胎培养于28℃。

2.全胚胎蛋白的提取。

受精后24小时，取50-100枚斑马鱼胚胎，去除卵膜后用4℃预冷的PBS漂洗两遍，转移入1.5ml离心管。用21G注射器轻轻吹打胚胎，使完全卵黄破裂，4℃500g离心6分钟，尽可能多地弃去上清。向每管中加入100μl蛋白裂解液，用25G注射器充分吹打使胚胎破裂，冰上30分钟使充分裂解。4℃12000g离心3分钟，取上清，分装后存于-80℃冰箱。

3.蛋白印记实验

取适量分装好的蛋白裂解液，与5X蛋白上样缓冲液(含巯基乙醇)混合均匀,沸水煮10分钟，迅速冷却，备用。

配制8％的SDS-PAGE凝胶。上样后恒压电泳，浓缩胶中保持90V，分离胶120V。电泳至适当位置后，低温恒流200mA转移至PVDF膜。将含有蛋白样品的PVDF膜 正面朝上，用封闭液室温封闭2小时后，用含有一抗(anti-ERK或anti-pERK)的封闭液4℃孵育过夜。洗去一抗后，TBST漂洗3遍，每遍10分钟。用含有二抗(goat anti-rabbit IgG HRP)的封闭液室温孵育2小时。TBST漂洗3遍，每遍10分钟。用ECL发光液显色并拍照。所得蛋白条带用ImageJ定量并统计。

由于咪康唑可以降低ERK的活性，因而进一步探究ERK抑制剂是否具有与咪康唑类似的出血抑制作用。选取两种ERK抑制剂——U0126和PD0325901来检测其对斑马鱼脑出血突变体的出血抑制效果。实验表明，两种抑制剂都可以有效降低斑马鱼脑出血突变体的出血率，并且抑制效率随抑制剂浓度升高而增强。另一方面，选取某一低浓度，使得在此低浓度时ERK抑制剂与咪康唑均不能产生显著的出血抑制效果，而当将此浓度的ERK抑制剂与咪康唑混合后再处理突变体，可以得到十分显著的抑制效果(图6、7)。这提示咪康唑可能通过Erk通路发挥抑制出血的功能的。

用U0126和咪康唑处理的胚胎进行蛋白分析，发现野生型中无论是否有小分子处理，其磷酸化Erk1/2占总Erk1/2比重相差不大，说明Erk1/2活性相差不大。与野生型对照组(DMSO处理)相比，斑马鱼脑出血突变体(DMSO处理)的磷酸化Erk1/2占总Erk1/2比重明显升高，说明Erk1/2活性增强。用低浓度U0126、咪康唑或两者混合处理后，上调的磷酸化Erk1/2占总Erk1/2比重得到恢复，U0126与咪康唑混合处理的恢复效果最好，说明U0126与咪康唑都可以降低fn40a突变体中异常增强的Erk1/2活性(图8)。

具体实验过程如下：

原料：anti-ERK(anti-P42/44,cell signaling technology，#4695)，anti-pERK(anti-pP42/44,cell signaling technology,#4370)，anti-Mmp9(AnaSpec，55345)，anti-Tubulin(Easybio，BE0031)，Goat anti-rabbit IgG-HRP(Abmart，M21001)，Goat anti-mouseIgG-HRP(Abmart， M21002)

实验动物：野生型斑马鱼(TL，从斑马鱼国际资源中心ZIRC购得)，脑出血突变体(ENU诱导突变得到)

实验步骤：

1.收集野生型和脑出血突变体胚胎，在受精后6小时向胚胎中加入5μM咪康唑或一定量DMSO作对照，胚胎于28℃培养；受精后24小时洗去药品，换入新鲜胚胎培养液，胚胎培养于28℃。

2.全胚胎蛋白的提取。

受精后24小时，取50-100枚斑马鱼胚胎，去除卵膜后用4℃预冷的PBS漂洗两遍，转移入1.5ml离心管。用21G注射器轻轻吹打胚胎，使完全卵黄破裂，4℃500g离心6分钟，尽可能多地弃去上清。向每管中加入100μl蛋白裂解液，用25G注射器充分吹打使胚胎破裂，冰上30分钟使充分裂解。4℃12000g离心3分钟，取上清，分装后存于-80℃冰箱。

3.蛋白印记实验

取适量分装好的蛋白裂解液，与5X蛋白上样缓冲液(含巯基乙醇)混合均匀,沸水煮10分钟，迅速冷却，备用。

配制8％的SDS-PAGE凝胶。上样后恒压电泳，浓缩胶中保持90V，分离胶120V。电泳至适当位置后，低温恒流200mA转移至PVDF膜。将含有蛋白样品的PVDF膜正面朝上，用封闭液室温封闭2小时后，用含有一抗(anti-ERK、anti-pERK、anti-Mmp9或anti-Tubulin)的封闭液4℃孵育过夜。洗去一抗后，TBST漂洗3遍，每遍10分钟。用含有二抗(goat anti-rabbitIgG HRP或goat anti-mouse IgG HRP) 的封闭液室温孵育2小时。TBST漂洗3遍，每遍10分钟。最终，用ECL发光液显色并拍照。所得蛋白条带用ImageJ定量并统计。