尼罗替尼作为治疗登革病毒感染的药物及其制药用途

摘要

本发明涉及尼罗替尼作为治疗登革病毒感染的药物及其制药用途，具体公开了尼洛替尼在制备治疗或预防登革病毒感染的药物中的用途。本发明通过对DENV的抑制实验证实了尼洛替尼对DENV2具有良好的抑制作用，从本质上证明了该药物在治疗DENV2感染疾病中具有广范的应用前景。该发明能够为临床治疗由DENV2引起的疾病提供良好的候选药物，具有十分良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及尼洛替尼在抗登革热病毒方面的用途。

背景技术

登革病毒(dengue virus,DENV)属黄病毒科，黄病毒属(Flaviviridae),是当今世界上分布最广的一种虫媒病毒，主要由叮咬人的埃及伊蚊和白纹伊蚊传播引起登革热，其中以出现登革出血热/登革休克综合征(dengue hemorrhagic fever/dengue shocksyndrome,DHF/DSS)更为严重。该病毒有四个血清型，血清 2型是流行病株登革热(denguefever)是经蚊媒传播的急性传染病，主要在热带、亚热带地区流行。自1779年首次发现登革热以来，世界各地陆续爆发登革热疫情。据WHO估计，目前全球约2/5的人口受到登革热的威胁，每年有亿计的人感染该病毒。我国除台湾地区有流行外，其疫情主要集中在广东，多呈爆发和输入性流行的特征，已知的4种血清型登革病毒在我国均有发现，而且呈扩散加大的趋势。目前，登革病毒感染的机制扔不明确，由于各血清型之间缺乏有效的交叉保护，又存在抗体依赖的增强作用等，至今仍无安全有效的疫苗可用，临床上还没有有效的治疗药物。虽然发现了许多针对登革热病毒主要蛋白的活性分子，但由于种种原因(如毒副作用等问题)，目前还没有针对登革热病毒的药物，因此，针对登革热的抗病毒活性分子的发现具有重要的生物学研究意义和实践意义，为开发登革热病毒的有效药物提供支持。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种已经上市的抗肿瘤药物尼洛替尼在作为制备治疗或预防登革病毒感染药物中的应用，尼洛替尼在10.0M浓度下对2型登革热病毒的抑制率为90％。而尼洛替尼在10M条件下，对BHK21细胞的存活率为95％。尼洛替尼能够有效地抑制登革热病毒的增值，其对细胞毒性很小，可进一步开发为治疗登革热病毒感染的药物，具有广泛的应用前景。

所述尼洛替尼结构如下所示：

本发明一个方面提供了尼洛替尼在治疗或预防黄病毒类病毒感染的药物中的用途。

本发明另一个方面提供了尼洛替尼在制备治疗或预防登革病毒感染的药物中的用途。

在本发明的技术方案中，登革病毒为登革病毒1-4型。

在本发明的技术方案中，登革病毒为登革病毒2型。

本发明再一个方面提供了尼洛替尼在制备抑制登革病毒中NS1和E蛋白的 mRNA的药物中的用途。

本发明再一个方面提供了尼洛替尼在制备抑制登革病毒中NS1和E蛋白的蛋白质表达的药物中的用途。

本发明再一个方面提供了一种治疗登革病毒感染的药物组合物，其含有作为活性物质的尼洛替尼。

在本发明的技术方案中，所述药物组合物为注射制剂、口服制剂或外用制剂。

在本发明的技术方案中，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。

本发明涉及的药物尼洛替尼是由伊马替尼的分子结构改进而来的，对 BCR-ABL激酶活性有更强的选择性，对酪氨酸激酶的抑制作用较伊马替尼强30 倍，可抑制对伊马替尼耐药的BCR-ABL突变型的激酶活性。同时还能抑制KIT 和PDGFR激酶活性，在临床上其是强效精准的第二代酪氨酸激酶抑制剂，有效治疗产生耐药的或不耐受的慢性髓性白血病患者。发明人通过筛选已有的上市药物发现了尼洛替尼的抗病毒效果，对于本发明涉及的尼洛替尼在制备治疗或预防 2型登革热病毒感染药物中的用途属于首次公开，由于其是上市的药物，药代动力学特征良好，而且其对2型登革热病毒抑制活性具有良好的效果，不存在由于其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于登革热病毒感染的治疗和防治显然具有显著的进步，极有可能被开发成新型的抗病毒感染的药物。

附图说明

图1为登革病毒诱导的细胞病变效应图；

图2为蛋白免疫印迹检测结果图；

图3为空斑试验结果图。

具体实施方式

实施例1尼洛替尼对BHK-21细胞的毒性实验

BHK-21细胞(乳仓鼠肾细胞)是DENV2的易感细胞。实验中的BHK-21 细胞为本科室所有；MTT购自碧云天生物技术研究所；胎牛血清购自美国GIBICO 公司；细胞培养板购自美国康宁公司；RPMI 1640培养基购自美国GIBICO公司。

实验步骤如下：

1)接种BHK-21细胞：用含10％(V/V)胎牛血清的RPMI 1640培养基配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔细胞培养板；

2)培养BHK-21细胞：在37℃，5％(V/V)CO₂培养条件下培养24小时；

3)加入尼洛替尼：吸弃每个孔中的培养基，向各个孔加入100μl用10％(V/V) 胎牛血清的RPMI 1640培养基稀释成相应浓度的尼洛替尼，对照孔加入不含药物的10％(V/V)胎牛血清的RPMI 1640培养基100μl；

4)呈色：培养48小时后，至普通光学显微镜下观察发现Formazan全部溶解；

5)测量与计算：在570nm测定吸收值，尼洛替尼不同浓度下的细胞的存活率为该浓度下细胞吸光度值比上对照孔的吸光值，再乘以100％。

表1不同浓度的尼洛替尼对BHK-21细胞的毒性实验

实验结果

BHK-21即乳仓鼠肾细胞(Baby Hamster Syrian Kidney)，能被2型登革病毒(DENV2)感染，是登革病毒研究使用较多的细胞之一。本实验首先检测尼洛替尼对BHK-21细胞的细胞毒性，以不同浓度的尼洛替尼作用于BHK-21细胞，以了解在细胞存活90％以上的尼洛替尼的最大使用浓度，为后续的尼洛替尼对 DENV2的抑制作用实验提供参考数据。

实施例2尼洛替尼对DENV2感染BHK-21细胞的抑制实验：

以BHK-21为培养病毒DENV2的细胞，10TCID50，实验步骤如下：

1)在细胞培养板中接入BHK-21，24小时后细胞长至单层，细胞覆盖孔底的面积约为80％～90％，吸出培养基，PBS洗1次，接入病毒样品200μl，37℃吸附1小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，PBS清洗1次。加入含10％(V/V) 胎牛血清的RPMI 1640培养基稀释的指定浓度的尼洛替尼，于37℃5％(V/V)CO₂培养条件下培养。96小时后，细胞出现明显的细胞病变之后，显微镜下观察细胞病变效应。见图1。

2)收集上清，测上清中细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)含量；或培养至48小时后，收集细胞上清，做病毒空斑实验；或培养至48小时后，收集细胞的总蛋白总mRNA分别通过蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR检测细胞内病毒蛋白的含量。

3)测上清中细胞释放的乳酸脱氢酶含量：吸取96孔板细胞上清120μl，用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(LDH Cytotoxicity Assay Ki，Beyotime)检测 DENV所致细胞毒性时释放的乳酸脱氢酶的活性。

表2不同浓度的尼洛替尼对DENV2感染的BHK-21细胞释放的LDH的影响

实验结果:

见图1，尼洛替尼(10μM)处理后，显著降低了DENV2诱导的细胞病变效应。而以不同浓度的尼洛替尼(10、5、2.5μM)作用与已经感染了DENV2 的BHK-21细胞，LDH释放水平显著降低，从而得到尼洛替尼对病毒的抑制效率。

实施例3尼洛替尼对DENV2关键蛋白NS3和E蛋白的抑制试验

1)收集细胞总蛋白：BHK-21细胞用药物以及登革病毒(DENV2)处理后， 48h提蛋白，收集于1.5ml Eppendorf管中。

2)检测样品蛋白浓度：蛋白标准品用双蒸水稀释至0，0.0008，0.0016， 0.0032，0.004，0.006，0.008mg/ml的梯度浓度；根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。使每个样品蛋白浓度一致。

3)蛋白免疫印迹检测梯度浓度尼洛替尼处理后的登革病毒蛋白的表达差异：按顺序加入各种试剂，电泳起始用80V恒压进行电泳，待染料前沿进入分离胶后，再改为120V，根据预染蛋白Marker的分离程度和目标蛋白的分子量确定电泳时间75min。

4)转膜：从玻璃板中取出凝胶，剪切凝胶大小的PVDF膜，并在甲醇中浸泡 1min，再用转移缓冲液(1*tris/glycine buffer，Biorad)浸泡5min。将凝胶，滤纸，PVDF膜都浸泡在转移液中。将转膜装置置于转膜盒内，确认电极无误，加入转膜液至覆盖整个转膜装置，转膜盒及上方均用冰块覆盖，接通电源，100V 恒压转膜70min，结束后，取出PVDF膜。

5)蛋白封闭：将PVDF膜置于封闭液中，室温摇床浸泡1h，以封闭非特异性抗原。封闭后，TBS/TT室温摇床洗膜3次，每次5min接着孵育一抗。

6)一抗杂交：将PVDF膜蛋白面向上置于小盒子内，加入含有登革病毒包膜蛋白(Dengue virus Envelope protein antibody，GeneTex)和非结构蛋白1 (Dengue virusNS3glycoprotein antibody，abcam)一抗的TBS/T配置的5％(w/v)脱脂牛奶缓冲液，4℃摇床过夜。PBST室温摇床洗膜六次，每次5min。

7)二抗杂交：将PVDF膜蛋白面向上置于小盒子内，加入含有二抗(兔抗或鼠抗，Proteintech)的TBS/T配置的5％(w/v)脱脂牛奶缓冲液，室温摇床1 小时。PBST室温摇床洗膜六次，每次5min。

8)化学发光显影：按比例均匀加入ECL显影液A/B液(CST)，将PVDF 膜浸泡在发光液中，反应2min。取出PVDF膜，置于暗盒中，暗室曝光，放置 X光底片，曝光，取出显影，晾干胶片，记录，保存。

DENV2病毒中包含结构蛋白和非结构蛋白，而结构蛋白E蛋白和非结构蛋白NS3蛋白在DENV2病毒的繁殖扩增中起重要作用，因此检测不同浓度的尼洛替尼对NS3和E蛋白的mRNA抑制水平。

实验结果:

参见图2，随着尼罗替尼用量的增加构蛋白E蛋白和非结构蛋白NS3蛋白抑制水平也逐渐增强，从而进一步确认尼洛替尼的病毒抑制效果。

实施例4尼洛替尼对DENV2产生子代病毒的空斑抑制试验

1)在24孔板中接入C6/36细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约90％～100％)，吸弃各孔中的培养基，PBS洗1次，接入用PBS稀释的病毒样品200μl，37℃吸附1小时。

2)吸附完成后将各个孔的上清吸弃，PBS洗去未吸附的病毒。加入含1.2％甲基纤维素2％(V/V)胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37℃，5％(V/V)CO₂的培养箱中培养96～120小时。

3)待空斑形成后吸弃甲基纤维素覆盖培养基用4％多聚甲醛(博士德生物) 固定，再用1％(w/v)结晶紫染色，2小时后用流水冲去结晶紫，晾干后扫描 24孔板，根据空斑数和稀释倍数计算病毒的滴度(PFU/ml，PFU：plaque formation unit空斑形成单位)。PFU＝病毒稀释度×P/V，(P：空斑数目；V：接种量)。

实验结果

参见图3，空斑抑制试验是检测病毒滴度和感染能力的一个重要指标，病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。通过染色和洗涤后，病毒蚀斑不会染上颜色，从而体现为空白，其余部分细胞完好呈现蓝色。将尼洛替尼处理过的BHK-21细胞上清液取出后，进行上清的病毒空斑实验，这样能更进一步确证尼洛替尼处理后，细胞上清中的病毒含量、滴度和感染能力的水平。更精确的判断尼洛替尼的抗DENV2子代病毒效果。通过实验结果可知，随着尼洛替尼浓度则增加形成的空斑逐渐减少。