一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法

摘要

本发明涉及一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，属于基因工程和遗传修饰领域。本发明改造pX458载体，使其带有DsRed2和ECFP，然后针对目标基因设计多个特异性的sgRNA位点，将其连接至改造载体中，转染细胞系后利用流式细胞仪对细胞群进行分选，可以非常快速获得基因组被编辑的单细胞，然后用PCR扩增单细胞DNA序列，通过凝胶电泳即可以从中挑选出具有大片段缺失的单细胞。本发明通过将CRISPR/Cas9系统、流式细胞仪单细胞分选和表达载体上的荧光蛋白筛选三者结合起来，可以在短时间内获得具有大片段缺失的阳性单克隆，极大地提高细胞系基因敲除工作效率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，属于基因工程和遗传修饰领域。

背景技术

CRISPR-Cas9系统是近年来被研究和利用最为广泛的的一种基因组编辑技术，与传统的基因组编辑方法：锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)相比，CRISPR-Cas9系统具有以下优势：结构简单，对其改造和操作非常容易；对基因组的编辑效率很高，容易获得基因敲除个体；在实际使用过程中没有物种限制，所以其在动物、植物和细胞系等基因敲除模型制作中得到了非常广泛应用。

传统的细胞系基因敲除需要在转染以后经过多轮抗性筛选和稀释才能得到阳性单克隆细胞，非常费时费力，而且假阳性率很高。CRISPR/Cas9系统在切割基因组DNA以后，大多数情况下都会形成少数几个碱基的缺失或是插入，通过传统的凝胶电泳不能检测出这种微小的改变；而其它一些方法，例如：直接测序法、PCR酶切检测法、T7E1酶切检测法、高分辨率溶解曲线检测法，可以检测出打靶位点是否产生了碱基改变，但是不能得到碱基缺失或是插入的具体数目；PAGE电泳检测法、荧光PCR法可以比较准确得到碱基改变的详细信息，但是PAGE电泳检测法操作复杂，荧光PCR法需要使用昂贵的仪器设备，都不适合进行高通量筛选和大范围推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，该检测方法简单易行，通过对目标基因同时进行多处打靶，即可以获得大片段DNA缺失。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，包括如下步骤：

1)选定待敲除的目标基因，使用在线sgRNA设计软件，获得至少两个sgRNA序列，sgRNA序列之间的间隔为50-100bp；

2)将步骤1)获得的sgRNA序列添加酶切位点并合成单链引物，将配对的引物退火得到对应的带有粘性末端的双链DNA片段，将双链DNA片段分别连接入带有不同荧光报告基因的CRISPR/Cas9系统表达载体中，一个双链DNA片段对应连接一个带有荧光报告基因的CRISPR/Cas9系统表达载体，将构建好的表达载体等量混合后转入细胞；

3)细胞经培养后使用流式细胞仪进行阳性筛选，分离包含全部荧光报告基因信号的单克隆细胞；

4)将获得的单克隆细胞扩大培养，10-15天后取细胞通过直接裂解法获取基因组DNA；

5)设计包含靶位点PCR检测引物，以步骤4)获得的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳检测，挑选大片段缺失的纯合子细胞系。

上述的通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，包括如下步骤：

1)将pX458中的EGFP荧光报告基因替换为DsRed2和ECFP，分别命名为：pX458-DsRed2和pX458-ECFP；选定待敲除的目标基因，使用在线sgRNA设计软件，获得两个sgRNA序列，两个sgRNA序列之间的间隔为50-100bp；

2)将步骤1)获得的两个sgRNA序列添加酶切位点并合成4条单链引物，将配对的引物退火得到两条带有粘性末端的双链DNA片段，再将双链DNA片段分别连接入载体pX458-DsRed2和pX458-ECFP，得到pX458-DsRed2-sgRNA1和pX458-ECFP-sgRNA2表达载体；

3)将pX458-DsRed2-sgRNA1和pX458-ECFP-sgRNA2表达载体通过脂质体转染或电转的方式转入细胞，培养后使用流式细胞仪对DsRed2和ECFP荧光报告基因进行双阳性单细胞分选；

4)将获得的单克隆细胞扩大培养，10-15天后取细胞通过直接裂解法获取基因组DNA；

5)设计包含两个靶位点PCR检测引物，以步骤4)获得的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳检测，挑选大片段缺失的纯合子细胞系。

步骤1)中当所述的目标基因为Gfi1b时，两个sgRNA序列分别为：5‘-AGTGACAAGCGCTAGTCCTTTGG-3’，5‘-TTACCACCAGCCCCGGGCACAGG3’。步骤3)中所述4条单链引物分别为：

M-Gfi1b-IVT-1：5‘-CACCGAGTGACAAGCGCTAGTCCTT-3’；

M-Gfi1b-IVT-2：5‘-AAACAAGGACTAGCGCTTGTCACTC-3’；

M-Gfi1b-IVT-3：5‘-CACCGTTACCACCAGCCCCGGGCAC-3’；

M-Gfi1b-IVT-4：5‘-AAACGTGCCCGGGGCTGGTGGTAAC-3’。

步骤1)中当所述的目标基因为Pparg时，两个sgRNA序列分别为：5‘-GTATACCTAACAAGATACTATGG-3’，5‘-GTGAAGCTGTGCGTCATTTCAGG-3’。步骤2)中所述4条单链引物分别为：

M-Pparg-IVT-1：5‘-CACCGTATACCTAACAAGATACTA-3’；

M-Pparg-IVT-2：5‘-AAACTAGTATCTTGTTAGGTATAC-3’；

M-Pparg-IVT-3：5‘-CACCGTGAAGCTGTGCGTCATTTC-3’；

M-Pparg-IVT-4：5‘-AAACGAAATGACGCACAGCTTCAC-3’。

步骤1)中当所述的目标基因为DSG4时，两个sgRNA序列分别为：5‘-CTTAGCCGTAAGGATTGCCGAGG-3’，5‘-GTGGTTGTCATCGCAATCACAGG-3’。步骤2)中所述4条单链引物分别为：

M-DSG4-IVT-1：5‘-CACC>

M-DSG4-IVT-2：5‘-AAAC>

M-DSG4-IVT-3：5‘-CACC>

M-DSG4-IVT-4：5‘-AAAC>

步骤2)中在设计引物时，如果上游引物的5‘起始碱基不是G，则额外添加一个碱基G。

步骤3)中培养40-80h后，使用流式细胞仪进行单细胞分选。本发明将转染后的细胞培养40-80h后，进行流式细胞仪分选，此时间段内分选可以保证细胞具有更高的存活率和基因敲除效率。

步骤4)中所述直接裂解法使用的裂解液的配方为：100mmol/L KCl，20mmol/LTris-HCl pH＝9.0，0.3％Triton X-100，1.0mg/mL proteinase K。本发明通过实验发现在采用浓度为0.3％Triton X-100，1.0mg/mL proteinase K的裂解液时，可以获得更好的细胞裂解效果。本发明在分选获得单细胞后，不需要使用试剂盒抽提基因组DNA，而是可以直接通过裂解法得到基因组DNA，极大减少DNA抽提成本，提高后续验证实验效率。

上述的通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，其特征在于：步骤4)中所述直接裂解法的具体操作为：于55℃孵育15min，然后于95℃孵育10min。本发明不需要使用试剂盒抽提基因组DNA，对细胞的处理时间只需要25min，极大地节省了经济和时间成本。

步骤5)中将待检测扩增产物与野生型扩增产物比较，挑选两条染色体均发生大片段碱基缺失的纯合子细胞系。

本发明通过改造all-in-one CRISPR/Cas9系统载体，使其带有不同的荧光报告基因(DsRed2和ECFP)，然后针对目标打靶基因，设计2-3个特异性的sgRNA位点，将其分别连接进入改造好的载体中，抽提质粒DNA并转染细胞系，利用流式细胞仪对同时具有两种荧光的细胞群进行分选，可以非常快速获得基因组被编辑的单细胞，将候选单细胞扩大培养以后，通过直接裂解法获取其基因组DNA，然后用PCR扩增包含有打靶位点的DNA序列，通过简单的凝胶电泳，即可以从中挑选出具有大片段缺失的单细胞。

本发明通过将CRISPR-Cas9系统、流式细胞仪单细胞分选和表达载体上的荧光蛋白筛选三者结合起来，可以在短时间内获得具有大片段缺失的阳性单克隆，极大地提高细胞系基因敲除工作效率。本发明利用流式细胞仪分选功能、同时结合利用表达载体上的荧光报告蛋白，不仅可以在短时间内得到单克隆，还可以非常有针对性的获得阳性单克隆，所以将CRISPR-Cas9系统、流式细胞仪单细胞分选和表达载体上的荧光报告蛋白筛选三者结合起来，就可以在短时间内获得最多的阳性单克隆，极大地提高细胞系基因敲除工作效率。

与传统细胞系基因敲除方法相比，本发明具有以下优点：

1、本发明使用CRISPR-Cas9系统对细胞系进行基因敲除，编辑效率非常高；

2、本发明中使用DsRed2和ECFP作为荧光报告基因，其优点是此两种荧光蛋白的激发波长相差较远，后期单细胞分选过程中不会相互干扰；

3、本发明使用流式细胞仪对DsRed2和ECFP荧光报告基因双阳性细胞群进行单细胞分选，可以保证两个或是多个打靶sgRNA同时进入单个细胞中，减少假阳性率，也进一步提高了获得大片段缺失单细胞的概率；

4、本发明在分选获得单细胞后，不需要使用试剂盒抽提基因组DNA，而是可以直接通过裂解法得到基因组DNA，极大减少DNA抽提成本，提高后续验证实验效率；

5、本发明通过简单的PCR和凝胶电泳就可以筛选得到大片段缺失的单细胞株，不需要复杂的酶切验证等过程，也不需要使用复杂昂贵的仪器，适合在具有基本分子生物学设备的实验室进行大规模推广；

6、本发明所表述的整个细胞系基因敲除工作可以在一月以内完成，极大节省时间成本；

7、本发明的方法适用范围广泛，没有特定细胞系和基因限制。

附图说明

图1为实施例1中pX458-DsRed2和pX458-ECFP载体示意图；

图2为sgRNA表达载体测序峰图；

图3为流式细胞仪对DsRed2和ECFP双阳性细胞进行单细胞分选示意图；

图4为细胞系RAW264.7中Gfi1b基因敲除阳性单克隆凝胶电泳检测结果图；

图5为细胞系RAW264.7中Pparg基因敲除阳性单克隆凝胶电泳检测结果图；

图6为细胞系HaCat中DSG4基因敲除阳性单克隆凝胶电泳检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

改造all-in-one CRISPR/Cas9系统载体，获得分别带有DsRed2和ECFP的表达载体。

(1)母载体pX458从addgene购买(ID：48138)，扩大培养以后，使用限制性内切酶EcoRI(NEB)将载体DNA线性化；具体步骤为：向1.5ml离心管中依次加入1μg pX458载体DNA；3μl 10×NEB Buffer 2.1；1μl EcoRI(NEB)最后补水至总体积30μl，置于37℃孵育2小时。酶切完成以后使用QIAquick PCR Purification Kit纯化酶切产物并回收至30μl ddH2O中。

(2)DsRed2(如SEQ ID NO.25所示)和ECFP(如SEQ ID NO.26所示)的DNA序列提交公司进行合成(上海百力格生物技术有限公司)，在序列的5‘端添加EcoRI酶切位点和T2A序列，并克隆至pUC57载体中；然后将两段DNA序列分别酶切，具体步骤如下：向1.5ml离心管中分别依次加入1μg载体DNA；3μl 10×NEB Buffer 2.1；1μl EcoRI(NEB)最后补水至总体积30μl，置于37℃孵育2小时。酶切完成以后通过凝胶电泳将载体和目标片段分离，并挖取含有目标片段的凝胶后使用QIAquick gel Purification Kit纯化酶切产物并回收至30μlddH2O中。

(3)通过连接反应、转化、重组子筛选获得完整的DsRed2和ECFP表达载体：加入0.5μl步骤(2)中得到的带有粘性末端的双链DNA片段和2μl步骤(1)中得到的具有相同粘性末端的载体DNA，再加入0.5μlT4DNA连接酶(NEB M0202S)和1μl 10×T4ligation Buffer(NEB)，反应1小时后转化大肠杆菌DH5α并涂布氨苄青霉素抗性平板，置于37℃培养箱进行过夜培养，第二天下午挑选单菌落进行测序验证，最终即可得到DsRed2和ECFP表达载体，并分别命名为：pX458-DsRed2和pX458-ECFP，载体示意图如图1所示。

实施例2

通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的RAW264.7细胞系Gfi1b基因的敲除方法。

(1)确定待敲除基因Gfi1b(Gene ID:1276578)的特异性靶位点sgRNA1，sgRNA2：在小鼠基因组数据库ensembl(http://asia.ensembl.org)中找到小鼠Gfi1b基因DNA序列(Transcript ID:ENSMUST00000028156.7)，然后使用在线设计软件CRISPOR(http://crispor.tefor.net/crispor.cgi)，确定在小鼠Gfi1b基因的靶位点intron1-2和exon2(exon ID：ENSMUSE00001307648)内挑选2个特异性位点作为sgRNA的靶序列，这两个靶序列分别为：sgRNA1(SEQ ID NO.1)：5‘-AGTGACAAGCGCTAGTCCTTTGG-3’，sgRNA2(SEQ ID NO.2)：5‘-TTACCACCAGCCCCGGGCACAGG-3’。

(2)设计引物：根据步骤(1)sgRNA靶序列，设计2对共4条引物(上海百力格生物技术有限公司)，并在引物序列的5‘端添加BbsI酶切位点：

M-Gfi1b-IVT-1(SEQ ID NO.3)：5‘-CACCGAGTGACAAGCGCTAGTCCTT-3’；

M-Gfi1b-IVT-2(SEQ ID NO.4)：5‘-AAACAAGGACTAGCGCTTGTCACT>

M-Gfi1b-IVT-3(SEQ ID NO.5)：5‘-CACCGTTACCACCAGCCCCGGGCAC-3’；

M-Gfi1b-IVT-4(SEQ ID NO.6)：5‘-AAACGTGCCCGGGGCTGGTGGTAAC-3’。

因为sgRNA表达载体使用的是U6启动子，如果在基因转录的起始位点有碱基G存在，则基因的表达量会有显著提高，所以在引物设计过程中，如果上游引物的5‘起始碱基不是G，则需要额外添加一个碱基G，以保证基因维持较高的表达量，此种情形下，其对应的下游引物3’末端需要添加一个碱基C。

(3)通过引物退火、配对获得带有粘性末端的双链DNA片段：将步骤(2)中合成的4条引物以M-Gfi1b-IVT-1+M-Gfi1b-IVT-2和M-Gfi1b-IVT-3+M-Gfi1b-IVT-4的组合方式用于退火配对获得带有粘性末端的双链DNA片段，具体程序如下：首先将合成的两对引物分别磷酸化，磷酸化反应体系为，引物M-Gfi1b-IVT-1+M-Gfi1b-IVT-2和M-Gfi1b-IVT-3+M-Gfi1b-IVT-4各加入1μl(100μM)，再加入1μl 10×T4Ligation Buffer(NEB)，然后加入0.5μl T4Polynucleotide Kinase(NEB M0201S)，最后加入6.5μl ddH₂O至总体积10μl，配制好反应体系以后，充分混匀，置于37℃孵育30min；取出以上反应产物，转移至PCR中进行变性和退火，反应程序如下：95℃，5min；95–25℃at-5℃/min。

(4)使用限制性内切酶BbsI将载体(pX458-DsRed2和pX458-ECFP)DNA线性化，然后纯化回收，获得具有粘性末端的载体DNA片段，具体体系如下：向1.5ml离心管中依次加入1μg pX458-DsRed2载体DNA(或pX458-ECFP)；3μl 10×NEB Buffer 2.1；1μlBbsI(NEB)最后补水至总体积30μl，置于37℃孵育2小时。酶切完成以后使用QIAquick PCR PurificationKit纯化酶切产物并回收至30μl ddH₂O中。

(5)通过连接反应、转化、重组子筛选获得完整的sgRNA和Cas9表达载体：加入0.5μl步骤(3)中得到的带有粘性末端的双链DNA片段和2μl步骤(4)中得到的具有相同粘性末端的载体DNA，再加入0.5μlT4DNA连接酶(NEB M0202S)和1μl 10×T4 ligation Buffer(NEB)，反应1小时后转化大肠杆菌DH5α并涂布氨苄青霉素抗性平板，置于37℃培养箱进行过夜培养，第二天下午挑选单菌落进行测序验证，最终即可得到分别表达有DsRed2和ECFP的表达载体pX458-Gfi1b-1和pX458-Gfi1b-2，sgRNA表达载体测序峰如图2所示，A：pX458-Gfi1b-1和pX458-Gfi1b-2的测序峰图。

(6)将构建好的表达载体等质量混合，然后通过脂质体介导的转染方式转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7。细胞培养和转染详细步骤如下：

RAW264.7细胞的培养和传代：细胞购于ATCC细胞库，将细胞带回实验室置于CO₂培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，用DPBS换液以冲洗掉死细胞和细胞代谢物，再加入新鲜的培养液(DMEM/GLUCOSE+10％FBS+1％双抗(青霉素+链霉素))继续培养，每日在倒置显微镜下观察细胞形态和生长状况，待细胞长满培养瓶底90％左右开始传代。观察培养瓶中细胞生长状况，待细胞增殖至铺满瓶底的80～90％时，吸除瓶内的旧培养液，用预热的DPBS洗涤1-2次，再向培养瓶内加入0.1％的胰蛋白酶1mL，37℃消化2min后将培养瓶放置于显微镜下观察，当细胞形态变圆、细胞间隙增大后，弃去胰蛋白酶并加入3mL>2恒温培养箱中培养待细胞达90％汇合后，按上述传代方法将F2细胞接种到24孔板上培养24h。

RAW264.7细胞的转染：将pX458-Gfi1b-1和pX458-Gfi1b-2载体DNA各取1.5μg，两种质粒共计3μg为实验组，加入到150μL减血清培养基(Opti-MEM)中进行稀释；取0.75μL脂质体Lipofectamine 3000稀释于150μL减血清培养基(Opti-MEM)中，然后将脂质体稀释液加入至DNA稀释液中，充分混匀，置于室温条件下孵育20min。将上述步骤中已接种培养细胞的24孔板中的培养基弃去，然后将复合物按顺序分别加入相应的细胞中，每孔加入300μL，另额外加三孔以作为平行对照实验组和未加入转染混合物的细胞作为阴性对照组。所有细胞在37℃5％浓度CO₂培养箱中孵育1.5h后，弃去培养基，更换新鲜的培养基继续培养。

(7)分选单细胞：转染72h后，弃去培养基，采用胰酶消化法将细胞重悬于含有500μL新鲜培养基的离心管中，1350rpm离心5min后，丢弃大部分培养基上清，留约200μL培养基于管底，用移液器轻轻吹打混匀，再加400μL新鲜培养基混匀后转移至流式管中。为了获得稳定的突变单克隆细胞，通过流式细胞仪将DsRed2和ECFP荧光双阳性的单细胞分选至已经加有150μL新鲜培养基的96孔细胞培养板中。流式细胞仪对DsRed2和ECFP双阳性细胞进行单细胞分选示意图如图3所示，其中右上角圆框中表示DsRed2和ECFP荧光双阳性细胞群。培养14天后，将单克隆转移至48孔细胞培养板中继续扩大培养并做后续分析。

(8)通过直接裂解法获取单克隆细胞基因组DNA：取少量细胞(不需要定量，大约100-1000即可)，离心力350g，离心时间5min，弃去上清液，保留底部细胞，然后加入20ul细胞裂解液，(细胞裂解液配方为：100mM KCl，20mM Tris-HCl pH 9.0，0.3％Triton X-100，1.0mg/ml proteinase K)，使用移液器将细胞吹打混匀，加入矿物油覆盖细胞裂解液，置于55℃孵育15min，使细胞充分裂解，再转移至95℃，孵育10min，使蛋白酶K变性，处理完以后的裂解液即可以作为PCR模板使用，并置于-20℃保存备用。

(9)设计引物，检测分选得到的单克隆细胞株是否有碱基缺失或是插入。使用在线引物设计软件primer3(http://primer3.ut.ee/)，针对打靶位点基因组序列设计特异性引物，Gfi1b-S PCR-F(SEQ ID NO.7)：5‘-ATCTGGGGAGCAAGGCCTAT-3’和Gfi1b-S PCR-R(SEQID NO.8)：5‘-CGATGCTCCCTCAACTCCAA-3’，通过PCR扩增包含打靶位点目的片段(理论长度为480bp)，体系为：(Vazyme，P111)2*Taq Master PCR MIX：10μL，Gfi1b-S PCR-F(5μM)和Gfi1b-S PCR-R(5μM)各0.5μL；基因组DNA：10ng；补充ddH2O至总体积20μL；程序为：95℃，5min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，40s；72℃，10min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图4所示，从电泳图中可以清晰看出有很大一部分经过分选得到的DsRed2和ECFP荧光双阳性单克隆细胞均发生了大片段碱基缺失，其中1、2、3、15、17号单细胞克隆为大片段缺失纯合子，9、21、22号单细胞克隆为大片段缺失杂合子，以上结果表明1、2、3、15、17号单细胞克隆即为Gfi1b基因敲除细胞株。

(10)将已验证的单克隆细胞株扩大培养、冻存液氮以保种。

实施例3

通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的RAW264.7细胞系Pparg基因的敲除方法。

(1)确定小鼠待敲除基因Pparg(Gene ID:97747)的特异性靶位点sgRNA1，sgRNA2：在小鼠基因组数据库ensembl(http://asia.ensembl.org)中找到小鼠Pparg基因DNA序列(Transcript ID:ENSMUST00000171644.7)，然后使用在线设计软件CRISPOR

(http://crispor.tefor.net/crispor.cgi)，确定在小鼠Pparg基因的靶位点intron2-3内挑选2个特异性位点作为sgRNA的靶序列，这两个靶序列分别为：

sgRNA1(SEQ ID NO.9)：5‘-GTATACCTAACAAGATACTA TGG-3’；

sgRNA2(SEQ ID NO.10)：5‘-GTGAAGCTGTGCGTCATTTC AGG-3’。

(2)设计引物：根据步骤(1)sgRNA靶序列，设计2对共4条引物(上海百力格生物技术有限公司，并在引物序列的5‘端添加BbsI酶切位点：

M-Pparg-IVT-1(SEQ ID NO.11)：5‘-CACCGTATACCTAACAAGATACTA-3’；

M-Pparg-IVT-2(SEQ ID NO.12)：5‘-AAAC>

M-Pparg-IVT-3(SEQ ID NO.13)：5‘-CACC>

M-Pparg-IVT-4(SEQ ID NO.14)：5‘-AAAC>

(3)通过引物退火、配对获得带有粘性末端的双链DNA片段：将步骤(2)中合成的4条引物以M-Pparg-IVT-1+M-Pparg-IVT-2和M-Pparg-IVT-3+M-Pparg-IVT-4的组合方式用于退火配对获得带有粘性末端的双链DNA片段，具体程序如下：首先将合成的两对引物分别磷酸化，磷酸化反应体系为，引物M-Pparg-IVT-1+M-Pparg-IVT-2和M-Pparg-IVT-3+M-Pparg-IVT-4各加入1μl(100μM)，再加入1μl 10×T4Ligation Buffer(NEB)，然后加入0.5μl T4Polynucleotide Kinase(NEB M0201S)，最后加入6.5μl ddH₂O至总体积10μl，配制好反应体系以后，充分混匀，置于37℃孵育30min；取出以上反应产物，转移至PCR中进行变性和退火，反应程序如下：95℃，5min；95–25℃at-5℃/min。

(4)使用限制性内切酶BbsI将载体(pX458-DsRed2和pX458-ECFP)DNA线性化，然后纯化回收，获得具有粘性末端的载体DNA片段，具体体系如同实施例2中的步骤(4)。

(5)通过连接反应、转化、重组子筛选获得完整的sgRNA和Cas9表达载体，具体方法如同实施例2中的步骤(5)，最终即可得到分别表达有DsRed2和ECFP的表达载体pX458-Pparg-1和pX458-Pparg-2，sgRNA表达载体测序峰如图2所示，B：pX458-Pparg-1和pX458-Pparg-2测序峰图。

(6)将构建好的表达载体等质量混合，然后通过脂质体介导的转染方式转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7。细胞培养和转染详细步骤如实施例2中的步骤(6)。

(7)分选单细胞：步骤如同上述实施例2中的步骤(7)。

(8)通过直接裂解法获得单克隆细胞基因组DNA：步骤如同上述实施例2中的步骤(8)。

(9)设计引物，检测分选得到的单克隆细胞株是否有碱基缺失或是插入。使用在线引物设计软件primer3(http://primer3.ut.ee/)，针对打靶位点基因组序列设计特异性引物，Pparg-S PCR-F(SEQ ID NO.15)：5‘-TGGCAGCAGCTAGTCTCTCA-3’和Pparg-S PCR-R(SEQID NO.16)：5‘-GGTGCAAGACTGTGCATACG-3’，通过PCR扩增包含打靶位点目的片段(理论长度为378bp)，体系为：(Vazyme，P111)2*Taq Master PCR MIX：10μL，Vav1-S PCR-F(5μM)和Vav1-S PCR-R(5μM)各0.5μL；基因组DNA：10μg；补充ddH2O至总体积20μL；程序为：95℃，5min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，40s；72℃，10min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图5所示，从电泳图中可以清晰看出有很大一部分经过分选得到的DsRed2和ECFP荧光双阳性单克隆细胞均发生了大片段碱基缺失，其中2、3、9号单细胞克隆为大片段缺失纯合子，1、5、6、8、11号单细胞克隆为大片段缺失杂合子，以上结果表明2、3、9号单细胞克隆即为Pparg基因敲除细胞株。

(10)将已验证的单克隆细胞株扩大培养、冻存液氮以保种。

实施例4：

通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的HaCaT细胞系DSG4基因的敲除方法。

(1)确定小鼠待敲除基因DSG4(Gene ID:2661061)的特异性靶位点sgRNA1，sgRNA2：在小鼠基因组数据库ensembl(http://asia.ensembl.org)中找到小鼠DSG4基因DNA序列(Transcript ID:ENSMUST00000019426.4)，然后使用在线设计软件CRISPOR(http://crispor.tefor.net/crispor.cgi)，确定在小鼠DSG4基因的靶位点exon12(exonID：ENST00000308128.8)内挑选2个特异性位点作为sgRNA的靶序列，这两个靶序列分别为：sgRNA1(SEQ ID NO.17)：5‘-CTTAGCCGTAAGGATTGCCG AGG-3’，sgRNA2(SEQ ID NO.18)：5‘-GTGGTTGTCATCGCAATCAC AGG-3’。

(2)设计引物：根据步骤(1)sgRNA靶序列，设计2对共4条引物(上海百力格生物技术有限公司)，并在引物序列的5‘端添加BbsI酶切位点：

M-DSG4-IVT-1(SEQ ID NO.19)：5‘-CACC>

M-DSG4-IVT-2(SEQ ID NO.20)：5‘-AAAC>

M-DSG4-IVT-3(SEQ ID NO.21)：5‘-CACC>

M-DSG4-IVT-4(SEQ ID NO.22)：5‘-AAAC>

(3)通过引物退火、配对获得带有粘性末端的双链DNA片段：将步骤(2)中合成的4条引物以M-DSG4-IVT-1+M-DSG4-IVT-2和M-DSG4-IVT-3+M-DSG4-IVT-4的组合方式用于退火配对获得带有粘性末端的双链DNA片段，具体程序如下：首先将合成的两对引物分别磷酸化，磷酸化反应体系为，引物M-DSG4-IVT-1+M-DSG4-IVT-2和M-DSG4-IVT-3+M-DSG4-IVT-4各加入1μl(100μM)，再加入1μl 10×T4 Ligation Buffer(NEB)，然后加入0.5μl T4Polynucleotide Kinase(NEB M0201S)，最后加入6.5μl ddH₂O至总体积10μl，配制好反应体系以后，充分混匀，置于37℃孵育30min；取出以上反应产物，转移至PCR中进行变性和退火，反应程序如下：95℃，5min；95–25℃at-5℃/min。

(4)使用限制性内切酶BbsI将载体(pX458-DsRed2和pX458-ECFP)DNA线性化，然后纯化回收，获得具有粘性末端的载体DNA片段，具体体系如同实施例2中的步骤(4)。

(5)通过连接反应、转化、重组子筛选获得完整的sgRNA和Cas9表达载体，具体方法如同实施例2中的步骤(5)，最终即可得到分别表达有DsRed2和ECFP的表达载体pX458-DSG4-1和pX458-DSG4-2，sgRNA表达载体测序峰如图2所示，C：pX458-Dsg4-1和pX458-Dsg4-2测序峰图。

(6)将构建好的表达载体等质量混合，然后通过脂质体介导的转染方式转染人永生化表皮细胞系HaCaT。细胞培养和转染详细步骤如下：

HaCaT细胞的培养和传代：细胞购于ATCC细胞库，将细胞带回实验室置于CO₂培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，用DPBS换液以冲洗掉死细胞和细胞代谢物，再加入新鲜的培养液(MEM/GLUCOSE+10％FBS+1％双抗+1％丙酮酸钠+1％非必需氨基酸)继续培养，每日在倒置显微镜下观察细胞形态和生长状况，待细胞长满培养瓶底90％左右开始传代。传代方法如同Raw264.7细胞。有所不同的是，HaCaT细胞在传代消化过程中，37℃消化10min后将培养瓶放置于显微镜下观察，当细胞形态变圆、细胞间隙增大后，弃去胰蛋白酶并加入3mLDMEM以终止消化反应。

HaCaT细胞的转染：将pX458-DSG4-1和pX458-DSG4-2载体DNA转染至HaCaT细胞的方法如同Raw264.7细胞的转染。

(7)分选单细胞：步骤如同上述实施例2中的步骤(7)。

(8)通过直接裂解法获取单克隆细胞基因组DNA：步骤如同上述实施例2中的步骤(8)。

(9)设计引物，检测分选得到的单克隆细胞株是否有碱基缺失或是插入。使用在线引物设计软件primer3(http://primer3.ut.ee/)，针对打靶位点基因组序列设计特异性引物，DSG4-S PCR-F(SEQ ID NO.23):5‘-GTATTAGGGAGAGTTAACCACCCC-3’和DSG4-S PCR-R(SEQ ID NO.24):5‘-TTCAGTGACAGGCCCATACG-3’，通过PCR扩增包含打靶位点目的片段(理论长度为296bp)，体系为：(Vazyme，P111)2*Taq Master PCR MIX：10μL，DSG4-S PCR-F(5μM)和DSG4-S PCR-R(5μM)各0.5μL；基因组DNA：10μg；补充ddH₂O至总体积20μL；程序为：95℃，5min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，40s；72℃，10min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图6所示，从电泳图中可以清晰看出有很大一部分经过分选得到的DsRed2和ECFP荧光双阳性单克隆细胞均发生了大片段碱基缺失，其中2、3、4、6、8、10号单细胞克隆为大片段缺失纯合子，1、5、7、9号单细胞克隆为大片段缺失杂合子，以上结果表明2、3、4、6、8、10号单细胞克隆即为DSG4基因敲除细胞株。

(10)将已验证的单克隆细胞株扩大培养、冻存液氮以保种。

<110> 新乡医学院

<120> 一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<221> Gfi1b基因靶位点1

<400> 1

agtgacaagc gctagtcctt tgg 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<221> Gfi1b基因靶位点2

<400> 2

ttaccaccag ccccgggcac agg 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 序列

<221> M-Gfi1b-IVT-1

<400> 3

caccgagtga caagcgctag tcctt 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 序列

<221> M-Gfi1b-IVT-2

<400> 4

aaacaaggac tagcgcttgt cactc 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 序列

<221> M-Gfi1b-IVT-3

<400> 5

caccgttacc accagccccg ggcac 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 序列

<221> M-Gfi1b-IVT-4

<400> 6

aaacgtgccc ggggctggtg gtaac 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<221> Gfi1b-S PCR-F

<400> 7

atctggggag caaggcctat 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<221> Gfi1b-S PCR-R

<400> 8

cgatgctccc tcaactccaa 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<221> Pparg基因靶位点1

<400> 9

gtatacctaa caagatacta tgg 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<221> Pparg基因靶位点2

<400> 10

gtgaagctgt gcgtcatttc agg 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 序列

<221> M-Pparg-IVT-1

<400> 11

caccgtatac ctaacaagat acta 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 序列

<221> M-Pparg-IVT-2

<400> 12

aaactagtat cttgttaggt atac 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 序列

<221> M-Pparg-IVT-3

<400> 13

caccgtgaag ctgtgcgtca tttc 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 序列

<221> M-Pparg-IVT-4

<400> 14

aaacgaaatg acgcacagct tcac 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<221> Pparg -S PCR-F

<400> 15

tggcagcagc tagtctctca 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<221> Pparg -S PCR-R

<400> 16

ggtgcaagac tgtgcatacg 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<221> DSG4基因靶位点1

<400> 17

cttagccgta aggattgccg agg 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<221> DSG4基因靶位点2

<400> 18

gtggttgtca tcgcaatcac agg 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 序列

<221> M-DSG4-IVT-1

<400> 19

caccgcttag ccgtaaggat tgccg 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 序列

<221> M-DSG4-IVT-2

<400> 20

aaaccggcaa tccttacggc taagc 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 序列

<221> M-DSG4-IVT-3

<400> 21

caccgtggtt gtcatcgcaa tcac 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 序列

<221> M-DSG4-IVT-4

<400> 22

aaacgtgatt gcgatgacaa ccac 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 序列

<221> DSG4-S PCR-F

<400> 23

gtattaggga gagttaacca cccc 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<221> DSG4-S PCR-R

<400> 24

ttcagtgaca ggcccatacg 20

<211> 753

<212> DNA

<213> 序列

<221> 合成的DsRed2序列

<400> 25

gaattcggca gtggagaggg cagaggaagt ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat 60

cctggcccaa tggcctcctc cgagaacgtc atcaccgagt tcatgcgctt caaggtgcgc 120

atggagggca ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc 180

tacgagggcc acaacaccgt gaagctgaag gtgaccaagg gcggccccct gcccttcgcc 240

tgggacatcc tgtcccccca gttccagtac ggctccaagg tgtacgtgaa gcaccccgcc 300

gacatccccg actacaagaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg 360

aacttcgagg acggcggcgt ggcgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggctgc 420

ttcatctaca aggtgaagtt catcggcgtg aacttcccct ccgacggccc cgtgatgcag 480

aagaaaacca tgggctggga ggcctccacc gagcgcctgt acccccgcga cggcgtgctg 540

aagggcgaga cccacaaggc cctgaagctg aaggacggcg gccactacct ggtggagttc 600

aagtccatct acatggccaa gaagcccgtg cagctgcccg gctactacta cgtggacgcc 660

aagctggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggagcagta cgagcgcacc 720

gagggccgcc accacctgtt cctgtaggaa ttc 753

<211> 792

<212> DNA

<213> 序列

<221> 合成ECFP序列

<400> 26

gaattcggca gtggagaggg cagaggaagt ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat 60

cctggcccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 120

ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 180

acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 240

cccaccctcg tgaccaccct gacctggggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 300

atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 360

atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 420

accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 480

gggcacaagc tggagtacaa ctacatcagc cacaacgtct atatcaccgc cgacaagcag 540

aagaacggca tcaaggccaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 600

ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 660

aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 720

atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 780

aagtaagaat tc 792

<211> 480

<212> DNA

<213> 序列

<221> Gfi1b基因PCR检测片段（野生型）

<400> 27

atctggggag caaggcctat cttatcttca ggcacatctt aacttgatgt gatattcaca 60

ggtgtcaggt ggatgtgaac tttggggaac gttatacaag ccagcatggg atagtgtgcc 120

tttgatccaa aggactagcg cttgtcactc ttagtcactc ccattgcccc tcctcccccg 180

caggtgtggc gtgcacgcag aaaaatgcca cggtcctttc tagtgaagag taagaaggca 240

cacacttacc accagccccg ggcacagggt gatgagctgg tctggcctcc tgctgtaatt 300

cctggtgagt ctgagcttag gctatatggc ccacctcatg cctgcttggc actgtcttga 360

tgatgctgtg gcatttcttc tgtatctaac tgtcactgaa tgaatgaatg gacaagtgaa 420

taaatgaatg aatgaaataa atactcatct cctctagcct ttggagttga gggagcatcg 480

<211> 378

<212> DNA

<213> 序列

<221> Pparg基因PCR检测片段（野生型）

<400> 28

tggcagcagc tagtctctca aagtgctaaa atacatccat ctctctaata ttgtcaggtc 60

agtgtgtcta taagtgtact ccctaagtta taattttacc ctgaagaagt aatgctagag 120

aaactctaaa accatagtat cttgttaggt atacatttct tgtctcagag gaaatctggg 180

ctgagaaatt ttcttcactg acttagggga cctgaaatga cgcacagctt cactatgtta 240

gcttccttgg acacaccaga atgtcaaaga atttagtgaa tacttcctga gtacttgtgt 300

tggagtcatt taaatagaat tgggtttctg tacctttcta ctgcactatt ctttccttcg 360

tatgcacagt cttgcacc 378

<211> 296

<212> DNA

<213> 序列

<221> DSG4基因PCR检测片段（野生型）

<400> 29

gtattaggga gagttaacca cccccctagc ccaccaagga atttccattt attttctgtt 60

tcctctcttc catttcagct acctcggcaa tccttacggc taagcaggtt ttatctccag 120

gattttatga aatcccaatc ctggtgaagg acagctataa cagagcatgt gaattggcac 180

aaatggtgca gttatatgcc tgtgattgcg atgacaacca catgtgcctg gactctggtg 240

ccgcgggcat ctacacagag gacataactg gtgacacgta tgggcctgtc actgaa 296