基于CRISPR/Cas9技术构建KDM2A基因敲除细胞系及S100A9基因敲除小鼠

摘要

CRISPR/Cas9是广泛存在于细菌和古菌中的获得性免疫系统，能够剪切外源基因，抵御病毒对细菌的入侵，最早由 nakata等发现于1987年，直到2010年CRISPR的机制和功能才被研究清楚。在2013年，CRISPR/Cas9被整合为基因编辑工具，其中CRISPR/Cas9三个必要元素（Cas9内切酶，crRNA和tracrRNA）可被融合为两个，通过将crRNA和tracrRNA合成为一个单链引导RNA，从而扩大了其在基因组编辑上的运用。因为该技术有着操作简单、编辑效率高等优势得到了非常广泛的应用，也大大降低了基因编辑的门槛，所以我们选择依托这项技术来研究靶基因自身的功能和该基因在某些疾病里的作用。 本课题由两个部分构成，技术上都运用了 CRISPR/Cas9基因编辑技术。第一部分是通过实验室前期工作，发现KDM2A基因在哮喘模型中存在着表达量降低的现象，但是对该基因自身的功能和作用并不十分清楚。所以在本文中利用CRISPR/Cas9技术构建KDM2A基因敲除细胞系来研究该基因的功能，并取得了如下研究结果： 1.对KDM2A基因转录本分析和比较，选择KDM2A-212进行设计，成功得到4条sgRNA，即hk2-1、hk2-3、hk2-5、hk2-7。 2.分析CRISPR/Cas9载体后，选择pX458为打靶载体，成功将4条sgRNA构建入pX458质粒中，组成KDM2A-pX458融合载体。经测序证明，载体正确重组且无突变。 3.通过脂质体转染和流式细胞仪筛选，获得4株单克隆细胞。 4.将获得的4株单克隆细胞进行测序鉴定后，得到1株KDM2A基因成功敲除的细胞株。经过Real-time PCR和Western Blotting检测后发现敲除细胞株表达KDM2A蛋白的能力也相应缺失。 5.采用细胞增殖检测（CCK8）实验后发现，与野生型细胞株相比，KDM2A基因敲除细胞株的生长速率显著下降。 6.为了研究KDM2A基因对细胞增殖和凋亡的具体影响，在分别运用EdU法和Tunel法检测后确定，突变细胞株与野生型比较，出现增殖下调，而凋亡上调的现象。 7.利用Real-time PCR筛选到TGF-β2细胞增殖相关因子在突变细胞株中表达量下调，符合预期结果。 第二部分是基于CRISPR/Cas9技术构建的S100A9基因敲除小鼠。该基因是在实验室前期工作中利用小鼠哮喘模型及转录组测序分析筛选得到，且在小鼠急性和慢性哮喘模型中的表达量均上调，但尚未对该基因在哮喘疾病中可能具有的作用进行研究。因此，我们决定构建S100A9基因敲除小鼠模型，以此研究该基因在哮喘疾病中的作用，并取得了如下成果： 1.对S100A9基因转录本进行分析和比较，筛选得出6条sgRNA。 2.在进行现有CRISPR/Cas9载体分析后，选择lentiCRISPR v2为载体骨架， PCR扩增得到6条sgRNA体外转录模板。 3.通过体外转录，将 DNA模板最终转化为 RNA，经过琼脂糖凝胶电泳，验证sgRNA无降解。 4.将sgRNA和Cas9 mRNA混合后显微注射入受精卵胞质中，经体外培养得到28枚囊胚，其中5枚敲除成功，敲除效率为17.85%。该结果证明sgRNA的设计、合成正确，显微注射有效。 5.胚胎移植后得到20只F0小鼠，其中有2只小鼠基因编辑成功，敲除效率为10%。

目录

声明

第一章 前言

1.1 KDM2A基因

1.2 CRISPR/Cas9技术原理与应用

1.3 本文构想

第二章 实验材料、仪器和试剂

2.1 实验材料

2.2 实验仪器和耗材

2.3 实验所需试剂及耗材

2.3 溶液配制

第三章 实验方法

3.1 KDM2A基因靶位点设计与载体构建

3.2 敲除细胞筛选与鉴定

3.3 细胞生长速率测定

3.4 流式检测细胞增殖与凋亡

第四章 实验结果

4.1 敲除载体构建

4.2 单克隆细胞筛选与鉴定

4.3 敲除细胞系增殖与凋亡

4.4 细胞增殖相关因子检测

第五章 讨论

5.1 关于KDM2A基因转录本的分析

5.2 打靶载体的选择

5.3 转染方式的比较

5.4 关于敲除细胞的鉴定

5.5 关于脱靶效应在细胞株以及小鼠中的比较

第六章 小结

主要研究结果

后续研究安排

第一章 前言

1.1 哮喘

1.2 S100A9基因

1.3本文构想

第二章 实验材料和方法

2.1 实验动物及材料

第三章 实验方法

3.1 靶位点设计

3.2 sgRNA合成

3.3 显微注射

3.4 囊胚鉴定

3.5 胚胎移植

3.6 F0代小鼠基因型鉴定

第四章 实验结果

4.1 sgRNA合成

4.2 胚胎显微注射

4.3 囊胚鉴定

4.4 胚胎移植

4.5 F0代小鼠基因型鉴定

第五章 讨论与展望

5.1 sgRNA设计策略

5.2 显微注射质量控制

5.3 靶位点活性分析

5.4 代孕小鼠品系的讨论

5.5 关于胚胎移植方法的讨论

5.6 展望

致谢

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录