一株抑制镰刀菌生长及产毒的粘质沙雷氏菌SerEW01及其应用

摘要

本发明首次从蚯蚓体表分离出一株具有抑制镰刀菌生长和产毒作用的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01，其能有效抑制串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)、层生镰刀菌(F.proliferatum)孢子萌发及菌丝生长；该菌株具有几丁质酶基因(chiA,chiB),能够合成几丁质酶，具有降解镰刀菌细胞壁的活性；该菌对伏马毒素B1的产生有明显的抑制作用，在农作物镰刀菌防治方面，具有很高的应用价值，为有效控制和降低农产品、饲料中伏马毒素B1的污染提供新的思路，对于提高农产品质量安全有重要意义，具有很高的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于微生物及生物技术领域，具体涉及一株抑制镰刀菌生长及产毒的粘质沙雷氏菌SerEW01。

背景技术

伏马毒素是一类真菌毒素，由不同的多羟醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物，分子极性较强，能溶于水和其他极性溶剂。伏马毒素主要由串珠镰刀菌(Fusariumverticillioides)和层生镰刀菌(F.proliferatum)丝状植物病原真菌产生。伏马毒素经常污染玉米和玉米制品，人摄食被伏马毒素污染的玉米食品会引起疾病。此外，动物取食被伏马毒素污染的玉米饲料也会引起疾病。伏马毒素B1(FB1)，其化学结构式见下，是最普遍的伏马毒素并对人和动物的营养和健康存在危险。此外，伏马毒素B1被证明能够致癌致畸，有研究证实与食道癌的发生成正相关，也会导致儿童神经管缺陷。

对自然界存在的能够产生伏马毒素的土传病原菌镰刀菌(Fusarium spp.)污染进行有效抑制以减少真菌毒素的产生，以及对已存在的真菌毒素进行有效的降解成为科学界迫切需要解决的问题。近年来，利用生防菌或生物源活性物质抑制镰刀菌产生毒素的研究已引起研究人员的重视。如叶火春等(叶火春,赖先文,王艳丽,等.1株抑制镰刀菌生长及产生伏马菌素链霉菌的分离和鉴定[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2013,41(7):150-156.)等从采自深圳近海红树林泥土中分离筛选到抑制再育镰刀菌生长和产生伏马菌素B1(FB1)的菌株；杨鹏飞等(杨朋飞,常晓娇,伍松陵,等.一株伏马毒素降解菌的筛选与鉴定[J].中国粮油学报,2017,32(4):110-115.)以富集培养法分离一株鞘氨醇盒菌ASAG22，该菌株能够以伏马毒素FB1为唯一碳源对伏马毒素进行降解利用。然而迄今尚未发现粘质沙雷氏菌具有抑制镰刀菌生长及产毒作用的报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，从蚯蚓体表筛选出一株能够抑制镰刀菌生长及产毒的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01，经试验验证，其能够有效抑制串珠镰刀菌和层生镰刀菌孢子萌发和菌丝生长，对镰刀菌菌丝细胞壁具有明显的降解作用，对伏马毒素B1的产生有明显抑制作用。本发明可以丰富抗菌资源库，为镰刀菌的生物防治和有效控制伏马毒素对能产品的污染提供理论基础。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一株具有抑制镰刀菌生长及产毒作用的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01，该菌株已于2017年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：CGMCC NO.13952。

本发明所述粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01，从蚯蚓体表分离出来，该菌株在NA培养基上的菌落表面凸起，中心不透明，边缘不规则，产红色色素。

本发明的第二个方面，提供上述粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01的培养方法，包括将粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01置于NB液体培养基中培养，培养条件为28℃下有氧培养，如摇床(28℃，120rpm)振荡培养。

其中，所述NB培养基配方(g/L)为：牛肉浸膏3.0；蛋白胨5.0；葡萄糖2.5；pH7.0±0.2；

本发明的第三个方面，提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括上述粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01的培养物。所述微生物菌剂具有抑制镰刀菌生长及产毒作用。

作为优选，微生物菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂；

作为优选，微生物菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。本发明对所述农药学上可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。

本发明的第四个方面，提供了所述粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01或微生物菌剂在抑制镰刀菌孢子萌发和/或菌丝生长中的应用；

其中，所述镰刀菌为串珠镰刀菌和/或层生镰刀菌；

本发明的第五个方面，提供了所述粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01或微生物菌剂在抑制镰刀菌产生伏马毒素B1中的应用；

其中，所述镰刀菌为串珠镰刀菌和/或层生镰刀菌。

本发明的有益效果：本发明首次从蚯蚓体表分离出一株具有抑制镰刀菌生长和产毒的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01，其能有效抑制串珠镰刀菌(Fusariumverticillioides)、层生镰刀菌(F.proliferatum)孢子萌发及菌丝生长；该菌株具有几丁质酶基因(chiA,chiB),能够合成几丁质酶，具有降解镰刀菌细胞壁的活性；该菌对伏马毒素B1的产生有明显的抑制作用，在农作物镰刀菌防治方面，具有很高的应用价值，为有效控制和降低农产品、饲料中伏马毒素B1的污染提供新的思路，对于提高农产品质量安全有重要意义，具有很高的应用价值。

附图说明

图1为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01在NA培养基平板上的菌落形态；

图2为菌株SerEW01Biolog微生物自动分析系统分析结果图；

图3为菌株SerEW01菌液抑制镰刀菌孢子萌发，其中图A为对照组，图B为处理组；

图4为菌株SerEW01菌液抑制镰刀菌F6S-S菌丝生长；

图5为菌株SerEW01活性物质降解镰刀菌F6S-S菌丝细胞壁，其中图A为对照组，图B为处理组；

图6为菌株SerEW01菌液抑制产生伏马毒素B1镰刀菌株88473菌丝在大米基质上的生长，其中左侧三角瓶为处理组，右侧三角瓶为对照组；

图7为产毒菌株88473侵染大米产生的毒素量；

图8为加入SerEW01抑制菌后产毒菌株88473侵染后大米产生的毒素量。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的一种具体实施方式中，提供一株具有抑制镰刀菌生长及产毒作用的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01，该菌株已于2017年3月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：CGMCC NO.13952。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01的培养方法，包括将粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01置于NA液体培养基中培养，培养条件为28℃下有氧培养，如摇床(28℃，120rpm)振荡培养。

其中，所述NB培养基配方(g/L)为：牛肉浸膏3.0；蛋白胨5.0；葡萄糖2.5；pH7.0±0.2；

本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括上述粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)SerEW01的培养物。所述微生物菌剂具有抑制镰刀菌生长及产毒作用。

微生物菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂；

本发明的又一具体实施方式中，所述微生物菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、湿润剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。本发明对所述农药学上可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。

其中，所述分散剂为阴离子型分散剂和/或非离子型分散剂，可选自木质素磺酸钠、萘磺酸钠甲醛缩合物、亚甲基双萘磺酸钠、甲醛缩合物硫酸盐、聚羧酸盐、烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯和脂肪酸聚氧乙烯酯中的一种或多种；

所述湿润剂可选自十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、皂角粉、无患子粉、茶枯粉和拉开粉BX中的一种或多种；

所述崩解剂可选自膨润土、硫酸铵、氯化铝、尿素、氯化镁和葡萄糖中的一种或多种；

所述粘结剂可选自淀粉、硅藻土、环糊精、松香、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素和羧甲基纤维素盐中的一种或多种；

所述消泡剂可选自C8～C20脂肪醇类化合物、C10～C20饱和脂肪酸类化合物、环氧大豆油、乙醇、硅酮类化合物和有机硅油中的一种或多种；

所述抗冻剂可选自山梨醇、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇、尿素和氯化钠中的一种或多种；

所述增稠剂可选自明胶、黄原胶、聚乙二醇和聚乙烯醇中的一种或多种；

所述填料可选自轻质碳酸钙、硅藻土、膨润土、凹凸棒土和白炭黑中的一种或多种；

所述溶剂可选自水(优选为去离子水)或油酸甲酯；

本发明的又一具体实施方式中，提供了所述粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)SerEW01或微生物菌剂在抑制镰刀菌孢子萌发和/或菌丝生长中的应用；

其中，所述镰刀菌为串珠镰刀菌和/或层生镰刀菌；

本发明的又一具体实施方式中，提供了所述粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)SerEW01或微生物菌剂在抑制镰刀菌产生伏马毒素B1中的应用；

其中，所述镰刀菌为串珠镰刀菌和/或层生镰刀菌。

实施例1 SerEW01菌株的分离筛选

实验用蚯蚓从山东省青岛市崂山区土壤中采得，7g赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)先用去离子水洗净，然后用灭菌水冲洗3次，洗净后放入灭菌的50ml离心管中，倒入30ml灭菌水，涡旋5min，取500μl上清液加入到500μl LB培养基毒素管中。28℃恒温摇床培养48h后，在超净工作台中，将培养液稀释成1:100,1:1000倍后，分别取100μl稀释后的培养液均匀涂布于NA培养基上，28℃恒温培养，观察菌落的生长情况。将生长出的菌落进行抑菌试验，选出抑菌能力强的进行鉴定和后续的试验。

实施例2 SerEW01菌株的形态学、生理生化指标及16S rDNA的鉴定

1.菌落形态观察：将NA平板上的一个SerEW01菌落，在超净工作台中用接种环均匀涂布于NA平板上，生长2-3d后，观察菌落的形态及颜色，菌株在NA培养基上的菌落表面凸起，中心不透明，边缘不规则，产红色色素，实验结果见图1。

2.生理生化指标测定：运用Biolog对筛选出的菌种进行生理生化指标的鉴定具体操作步骤如下：将100μL菌液用L型玻璃棒均匀涂布在NA培养基上，28℃恒温箱培养24h后备用。打开浊度仪，在没有放任何标准液的情况下，透明度T为60-70％表示浊度仪可用，然后将IF-A培养液放在浊度仪，显示为100％透明。取无菌棉签在接种液中蘸湿，将棉签在菌落表面滚动，粘取菌体。然后将棉签在接种管液面上方沿内壁转动棉签，使菌体附着在内壁上，同时将菌体均匀打散，再次测定培养液的浓度，使透明度在95-98％之间(培养24h的菌落，挑取2个单菌落，培养48h的菌落，挑取1个单菌落，以防透明度减小)，将制备好的菌悬液混匀倒入加样槽中,使用八道的电动移液器,将其接种于微平板的96孔中革兰氏阴性菌使用GENⅢ鉴定微平板，接种量为100μL/孔，将96孔微平板置于33℃避光恒温培养箱48h后观察，得到的分析结果如图2。

3.16S rDNA的鉴定：将筛选出的目标菌株用细菌DNA试剂盒提取DNA，具体操作步骤如下：细菌的裂解(取28℃过夜培养的革兰氏阴性菌1ml置于灭菌的2ml离心管中，12,000×g离心1min，尽量弃上清液；然后加入100μl LB11和10μl Proteinase K，振荡至菌体彻底悬浮；置于55℃孵育15min)，在细菌的裂解液中加入10μl RNaseA降解掉RNA，混匀静置2min后，加入400μl BB11并涡旋30s，然后将全部的溶液加入到离心柱中，12,000×g离心30s，弃流出 液。加入500μl CB11,12,000×g离心30s，弃流出液(重复加入500μl CB11一次)；然后加入500μl WB11,12,000×g离心30s，弃流出液(重复加入500μl WB11一次)，12,000×g离心2min，彻底除去残留的WB11。将离心柱置于以一干净的离心管中，在柱中央加入100μl预热的EB，室温静置2min，12,000×g离心1min，洗脱DNA。洗脱的DNA于-20℃保存备用。

PCR扩增：运用细菌16S rDNA通用引物：27F 5’-3’:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,1492R5’-3’TACGGYTACCTTGTTACGACTT进行PCR扩增，反应体系50μl，25μl 2×Easy Taq SupperMix，1μl细菌DNA模板，1.5μl 27F引物，1.5μl 1492R引物，21μl dd水。PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；72℃后延伸10min。扩增的到的序列经DNAMAN软件拼接，得16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。通过使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)核苷酸BLAST比对，发现本发明的CGMCC NO.13952菌16S rDNA的基因序列与NCBI注册的多株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)16S rDNA基因序列具有高度同源性，说明CGMCC NO.13952菌株是一株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。

实施例3 SerEW01发酵液对镰刀菌孢子萌发、菌丝生长的抑制

1.孢子萌发的抑制：此试验在双凹载玻片上进行。配制不同浓度的SerEW01菌株发酵液与镰刀菌(串珠镰刀菌或层生镰刀菌)孢子悬浮液的混合物。细菌发酵液对于镰刀菌孢子萌发的显微镜下统计萌发和未萌发的孢子数，观察100个孢子，三次重复，计算孢子萌发率及萌发时间的差异，对照组以液体PDB培养基代替SerEW01菌株。SerEW01菌株发酵液对孢子萌发的抑制见图3。

孢子萌发率＝(萌发孢子数/观察孢子总数)×100％

2.菌丝生长的抑制：此试验采用平板对峙法。不同的镰刀菌菌株在超净工作台中接种到PDA平板上。28℃恒温培养4d(HWS型恒温恒湿箱，宁波东南仪器厂)，从PDA平板上镰刀菌生长健壮的区域，打取直径6mm的菌饼，此外打取同样大小的NA培养基平板，其上分别接种50μl发酵液、上清液，灭菌的发酵液和灭菌水作为对照。SerEW01菌株发酵液对菌丝生长的抑制见图4。

实施例4 SerEW01发酵液对镰刀菌菌丝细胞壁的降解作用

通过显微镜观察镰刀菌F6S-S菌丝形态，比较经不同浓度细菌菌体处理后的菌丝形态与对照菌丝的区别，观察菌丝细胞壁的变化，并进行拍照记录。SerEW01菌株发酵液对孢子萌发的抑制见图5。

大量文献证明，粘质沙雷氏菌是一种高产几丁质酶的菌种。几丁质酶(Chitinase)属于一种糖基水解酶，专一降解几丁质。真菌细胞壁的主要成分是几丁质已被证实。我们推断粘质沙雷氏菌SerEW01菌株发酵液能够降解镰刀菌菌丝的细胞壁。为证明我们的推断，我们对SerEW01菌株基因组DNA提取后，运用几丁质酶特异性引物(见表1)进行PCR扩增。对得到的PCR结果进行测序，序列结果经DNAMAN拼接，chiA序列结果如SEQ ID NO.2所示，chiB的序列结果如SEQ ID NO.3所示。

表1生防菌活性物质相关的基因

实施例5 SerEW01菌株抑制伏马毒素B1的产生

1.样品的制备：将大米(黑龙江,五常)用灭菌水浸泡18h后，沥水，称取20g分装到灭菌的锥形瓶中，再往锥形瓶中加入4ml的灭菌水(补给高温灭菌过程中蒸发掉的水分)后高温灭菌(121℃,15min)。待灭菌后的大米冷却到室温，处理一：将6ml的镰刀菌孢子悬浮液+3ml灭菌水接种到灭菌的大米上；处理二：将6ml的镰刀菌孢子悬浮液(10⁶～10⁷)+3mlSerEW01(10⁷)菌液接种到灭菌的大米上；对照组大米用灭菌水代替孢子悬浮液。

2.样品的收集及研磨：分别在0，3，5，7d取未侵染大米，被镰刀菌侵染的大米及镰刀菌和细菌同时接种的大米约1g，将收集的大米样品在-80℃冻存，然后在-48℃冷冻干燥仪中干燥48h使样品充分干燥。使用组织研磨仪(Qiagen，TissuelyserⅡ)将收集到的大米样品粉碎。研磨仪的转速为3000rpm/min,时间为2min。查看被样品的磨碎情况，若研磨不充分，可以重复研磨一次。SerEW01在大米基质上对菌丝生长的抑制见图6。

3.伏马毒素B1的提取：称量100mg已经磨细的样品的粉末，放到2ml 的离心管中，加入1ml的甲醇/水(75:25,甲醇为HPLC级别)后，充分涡旋离心管，使样品完全悬浮在萃取剂中并震荡过夜。次日，将离心管以12000rpm的转速离心10min后，用移液枪移取800μl上清液到新的离心管中，然后加入800μl的环己烷去脂，涡旋使环己烷和上清液充分混匀，然后取600μl底层的液体到新的离心管中，储存在-20℃，待检测。上样前将样品超声混匀。

色谱条件:Waters ACQUITY UPLC^TM>18柱(50mm×2.1mm,粒径1.7μm)；流动相：A:乙腈+0.1％甲酸B:水+0.1％甲酸溶液，梯度洗脱(见表2)；流速:0.4mL/min；进样量:10μL；柱温:35℃。

表2流动相梯度洗脱程序

质谱条件：离子化模式:电喷雾电离正离子模式(ESI⁺)；质谱扫描方式:多反应监测(MRM)；毛细管电压:3.5kV；去溶剂气温度:350℃；锥孔反吹气流速:50L/h；去溶剂气流速:500L/h；离子源温度:110℃；碰撞气压力：3.2x10³mbar；伏马毒素B1的质谱条件参数见表3。

表3伏马毒素B1的质谱条件参数

*表示定量离子

根据实验数据，未侵染的大米检测到的伏马毒素B1的量可以忽略，产毒菌株88473侵染的大米产生伏马毒素B1的量在5d达到最高值为18.86ppm，统计结果见图7；在加入SerEW01抑制菌后，伏马毒素B1的产量机会为零，结果显示SerEW01有很好的抑制毒素产生的能力，统计结果见图8。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院烟草研究所

<120> 一株抑制镰刀菌生长及产毒的粘质沙雷氏菌SerEW01及其应用

<130> 2010

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1443

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)

<400> 1

cggggcggca gcttacacat gcagtcgagc ggtagcacag ggggagcttg ctccctgggt 60

gacgagcggc ggacgggtga gtaatgtctg ggaaactgcc tgatggaggg ggataactac 120

tggaaacggt agctaatacc gcataacgtc gcaagaccaa agagggggac cttcgggcct 180

cttgccatca gatgtgccca gatgggatta gctagtaggt ggggtaatgg ctcacctagg 240

cgacgatccc tagctggtct gagaggatga ccagccacac tggaactgag acacggtcca 300

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<210> 2

<211> 1664

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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aagccgacca tcgcctgggg caacaccaag ttcgccatcg ttgaagttga ccaggcggct 120

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caccgggccg gtcaaaggca cctgggagaa cggcatcgtg gactaccgcc aaatcgccgg 1440

ccagttcatg agcggcgagt ggcagtatac ctacgacgcc acggcggaag cgccttacgt 1500

gttcaagcct tccaccggcg atctgatcac cttcgacgat acccgctcgg tgcaggccaa 1560

aggcaagtac gtgctggata agcagctggg cggcctgttc tcctgggaga tcgacgcgga 1620

taacggcgat attctcaaca gcagaacgcc aatcctgcaa cccg 1664

<210> 3

<211> 1442

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtttttttca ccaaccaaat caataattac accgagaccg atacgtccgt cgtgccattc 60

ccggtttcca acattacgcc ggccaaagcc aaacagctga cgcacatcaa cttctcgttc 120

ctggatatca acagcaacct ggaatgcgcc tgggatccgg ccaccaacga cgccaaggcg 180

cgcgatgtgg tcaaccgttt gaccgcgctc aaagcgcata accccagcct gcgcatcatg 240

ttctccatcg gcggctggta ctactccaac gatctgggcg tatcgcacgc caactacgtc 300

aacgcaggtg aaaaccccgg cgtcgcggcg ccaaggtcgc ccaatcctgc gtgcgcatca 360

tgaaggatta cggtttcgac ggtgtggaca tcgactggga gtatccgcag gcggccgaag 420

tggacggctt catcgccgcg ctgcaggaga tccgcacctt gctgaatcag caaaccgtcg 480

ccgacggccg ccaggcgctg ccgtatcagt tgaccatcgc cggcgccggg cggcgccttc 540

ttcctgtcgc gctattacag caagctggcg cagatcgtcg cgccgctcga ttacatcaac 600

ctgatgacct acgatctggc cggcccctgg gagaaggtaa ccaaccacca ggcggcgctg 660

ttcggcgacg cggccgggcc gaccttctac aacgcgctgc gcgaagccaa tctgggctgg 720

agctgggaag agctgacccg cgccttcccc agcccgttca gcctgacggt cgacgccgcg 780

gtgcagcagc acctgatgat ggaaggcgtg ccgagcgcca aaatcgtcat gggcgtgccc 840

ttctatggcc gcgccttcaa gggcgtcagc ggcggcaacg gtgggcaata cagcagccac 900

agcacgccgg gcgaagatcc gtatccgagc accgactact ggctggtggg ctgcgaagag 960

tgcgtgcgcg acaaggatcc gcgcatcgcc tcctatcgcc agttggagca gatgctgcag 1020

ggcaactacg gctatcagcg gttgtggaac gacaagacca aaacccctta tctgtatcat 1080

gcgcagaacg ggctgttcgt cacctatgac gatgccgaga gcttcaaata caaagcgaag 1140

tacatcaagc agcagcagct gggcggcgtg atgttctggc atctggggca agacaaccgc 1200

aacggcgatc tgctggccgc gctggatcgc tatttcaacg ccgcggacta cgacgacagc 1260

cagctggata tgggcaccgg gctgcgctac accggcgtcg gccccggcaa cctgcctatc 1320

atgaccgcgc cggcctatgt gccgggcacc acttacgcgc agggcgcgct ggtgtcctac 1380

cagggctacg tctggcagac caagtggggt tacatcacct ctgcaccggt ccagacgccc 1440

ct 1442