虾青素脂质抗氧化活性的测定方法

摘要

本发明提供了一种虾青素组合物抗脂质过氧化活性的测定方法，所述测定方法包括：将虾青素抗氧化组合物、10.0mg/mL蛋黄卵磷脂、5.0mg/mL胆固醇和环己烷混合，超声至溶液澄清，得到成膜溶液；将所述成膜溶液滴涂于载体上，干燥后得到虾青素组合物‑双层磷脂膜薄层；将含有虾青素组合物‑双层磷脂膜薄层的载体浸入自由基发生体系溶液中反应，之后取出；在上述自由基发生体系溶液中加入0.9‑1.1mL1％TBA溶液，水浴后将其在533nm处进行吸光度测定；本测定方法能够准确、可靠的评介虾青素的抑制脂质过氧化能力，克服了已有方法溶解特征不同的虾青素组合物的水溶液自由基脂质过氧化反体系，无确定的计量关系，无法用于准确、可靠评介虾青素组合物抑制脂质过氧化能力的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及虾青素组合物抗脂质过氧化活性的测定方法。

背景技术

虾青素(Astaxanthin,3,3′-二羟基-4,4′-二酮-β,β′-胡萝卜素)，又名虾黄质、龙虾壳色素，是一种动物界中分布最广泛的脂溶性类胡萝卜素。虾青素不溶于水，是迄今自然界中发现的最强的氧化剂，其抗氧化能力比β胡萝卜素高10倍以上，比维生素E高550倍以上。虾青素还具有很强的抑制肿瘤生长、增强免疫功能、抵御紫外线伤害等多种生理功效，因而广泛应用于食品、医药、化妆品、保健品、水产养殖等领域。虾青素与其它抗氧化剂如生物黄酮等的组合可以充分发挥虾青素与其它抗氧化剂的协同抗氧化作用，明显增加虾青素的活性，已万为虾青素产品研发的重点，但由于虾青素是脂溶性，而多数抗氧化剂是水溶性或醇溶性，很难找到这类溶解特征不同的抗氧化剂组合物的评价体系，制约了虾青素组合物的筛选。

脂质过氧化作用是指在氧化条件下多不饱和脂肪酸和脂质的氧化变质，这种作用对细胞膜、脂蛋白以及其他含脂质结构产生严重的损伤，包括细胞膜流动性以及渗透性的改变、DNA以及蛋白质的损伤，进而影响细胞正常功能。许多重大疾病，如肿瘤发生、心脑血管、糖尿病、及衰老等都涉及自由基诱导的脂质过氧化作用，因此，寻找筛选脂质过氧化作用抑制剂具有重要意义。目前脂质过氧化抑制剂的评价方法有体外和体内的方法，体内方法需要进行大量动物试验，成本高周期长，体外试验方琳基于水溶液自由基与细胞生物膜或者卵磷脂囊泡的脂质过氧化反应，通过检测脂质过氧化反应产物如丙二醛(MBA)类似物实现脂质过氧化抑制活性的评价。

虾青素具有明显的脂质过氧化抑制活性，但目前的数据多是动物试验的结果，原因在于虾青素具有明显疏水性，在已有的水溶液自由基体系中，很难均匀、快速和稳定的参与抑制自由基对细胞膜脂质的过氧化作用，因此，难于准确、可靠评介虾青素组合物的抑制脂质过氧化能力。

综上所述，发展稳定准确的水溶液自由基体系中，虾青素与其它溶解特征不同的抗氧化剂组合物的脂质过氧化评价方法，对于虾青素研究和虾青素制剂的开发具有重要价值，对于其它溶解特征不同的的抗氧化剂组合研究亦具有重要应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种虾青素组合物抗脂质过氧化活性的测定方法，本测定方法能够准确、可靠的评介溶解特征不同的虾青素组合物的抑制脂质过氧化能力，克服前述已有的脂质过氧化反体系，无确定的计量关系，无法用于准确、可靠评介溶解特征不同的虾青素组合物抑制脂质过氧化能力的问题。

为了达到上述目的，本发明提供了一种虾青素组合物抗脂质过氧化活性的测定方法，所述测定方法包括：

(1)将虾青素组合物、10.0mg/mL蛋黄卵磷脂、5.0mg/mL胆固醇混合于和环己烷，超声至溶液澄清，得到成膜溶液；

(2)将所述20～50μL成膜溶液滴涂于载体上，干燥后得到虾青素-双层磷脂膜薄层；

(3)将含有虾青素组合物-双层磷脂膜薄层的载体浸入自由基发生溶液体系中反应，之后取出；其中，所述自由基发生体系溶液由 0.45-0.55mL浓度为75mmol/L的Fe²⁺-EDTA、0.45-0.55mL浓度为150mmol/L的H₂O₂溶液和1.45-1.55mL浓度为0.75mol/L的PBS缓冲溶液组成；

(4)在上述自由基发生体系溶液中加入0.9-1.1mL1％硫代巴比妥酸(TBA)溶液，水浴后将其在533nm处进行吸光度测定；

(5)根据步骤(4)所测过得的吸光度值计算脂质过氧化抑制率，式中，A₀为空白样吸光度值，A_样为样品的吸光度值。

优选地，所述载体为直径8mm长6cm光谱纯石墨棒，并采用四氟乙烯管包裹，光胶封装。

优选地，所述载体在使用前需用砂纸打磨至光亮，并用乙醇和清水超声清洗、吹干。

优选地，步骤(3)中反应的温度为36-38℃，反应的时间为 10-30min。

优选地，步骤(4)中水浴的温度为85-88℃，水浴的时间为 18-22min。

优选地，所述PBS缓冲溶液的pH值为7.3-7.5。

有益效果：本发明提供了一种虾青素组合物脂质抗氧化活性的测定方法，克服前述已有的溶解特征不同的虾青素组合物的水溶液自由基脂质过氧化反体系，无确定的计量关系，无法用于准确、可靠评介虾青素组合物抑制脂质过氧化能力的问题；同时，利用卵磷脂的助溶解作用，将溶解特征不同的虾青素与其它抗氧化剂均匀分散于双层磷脂膜中并形成良好反应性薄层，与已报道的自由基水溶液发生体系、与脂质过氧化产物分光光法检测体系具有良好的适配性。本发明所述技术方案易于实现，可靠性好，实现了溶解特征不同的虾青素组合物抑制脂质过氧化能力的测定，抑制脂质过氧化能力是抗氧剂最重要的活性指标之一，本发明为高价值的虾青素组合抗氧剂开发提供了技术支持。

具体施方式

下面详细说明本发明的优选实施方式。

实施例1

将1：2(w/w)虾青素-芦丁组合物、10.0mg/mL蛋黄卵磷脂、 5.0mg/mL胆固醇混合于和环己烷，超声至溶液澄清，得到成膜溶液；将所述成膜溶液滴涂于载体(载体为光谱纯石墨棒，并采用四氟乙烯管包裹，光胶封装，载体在使用前需用砂纸打磨至光亮，并用乙醇和清水超声清洗、吹干)上，干燥后得到虾青素组合物-双层磷脂膜薄层；将含有虾青素组合物-双层磷脂膜薄层的载体浸入自由基发生体系溶液中反应(反应的温度为36℃，反应的时间为10min)，之后取出；其中，所述自由基发生体系溶液由0.45mL浓度为75mmol/L的 Fe²⁺-EDTA、0.45mL浓度为150mmol/L的H₂O₂溶液和1.45mL浓度为0.75mol/L的PBS缓冲溶液组成；在上述自由基发生体系溶液中加入0.9mL1％TBA溶液，水浴(水浴的温度为85℃，水浴的时间为>

实施例2

将1：2(w/w)虾青素-维生素C组合物、10.0mg/mL蛋黄卵磷脂、5.0mg/mL胆固醇混合于和环己烷，超声至溶液澄清，得到成膜溶液；将所述成膜溶液滴涂于载体(载体为光谱纯石墨棒，并采用四氟乙烯管包裹，光胶封装，载体在使用前需用砂纸打磨至光亮，并用乙醇和清水超声清洗、吹干)上，干燥后得到虾青素组合物-双层磷脂膜薄层；将含有虾青素组合物-双层磷脂膜薄层的载体浸入自由基发生体系溶液中反应(反应的温度为38℃，反应的时间为30min)，之后取出；其中，所述自由基发生体系溶液由0.55mL浓度为 75mmol/L的Fe²⁺-EDTA、0.55mL浓度为150mmol/L的H₂O₂溶液和>

对比例1

将1：2(w/w)虾青素-芦丁组合物、10.0mg/mL蛋黄卵磷脂、 5.0mg/mL胆固醇混合于和水，超声至完全分散，加入自由基发生体系溶液中反应(反应的温度为30℃，反应的时间为8min)，之后取出；其中，所述自由基发生体系溶液由0.4mL浓度为75mmol/L的 Fe²⁺-EDTA、0.4mL浓度为150mmol/L的H²O²溶液和1.4mL浓度为>

对比例2

将1：2(w/w)虾青素-维生素C组合物将芦丁、10.0mg/mL蛋黄卵磷脂、5.0mg/mL胆固醇混合于和环己烷，超声至完全分散，加入自由基发生体系溶液中反应(反应的温度为30℃，反应的时间为 8min)，之后取出；其中，所述自由基发生体系溶液由0.4mL浓度为75mmol/L的Fe²⁺-EDTA、0.4mL浓度为150mmol/L的H²O²溶液和1.4mL浓度为0.75mol/L的PBS缓冲溶液组成；在上述自由基发生体系溶液中加入0.7mL1％TBA溶液，水浴(水浴的温度为80℃，水浴的时间为15min)后用过滤头吸取清液在533nm处进行吸光度测定。

测试例

上述实施例1-2虾青素组合物五次平行测定的最大脂质过氧化抑制率平均值分别为77.2％的和74.5％，相对标准偏差分别为6.4％和 4.2％，对比例1、2中，相同用量的虾青素组合物五次平行测定的最大脂质过氧化抑制率平均值为42.4％和51.6％，相对标准偏差分别为 21.3％和17.5％，利用下述计算公式计算出实施例1-2和对比例1、2 的脂质过氧化抑制率。

计算公式：

式中，A₀为空白样吸光度值，A_样为样品的吸光度值。

通过计算可以得到，实施例1的最大脂质过氧化抑制率为77.2％，相对标准偏差分别为6.4％，实施例2的最大脂质过氧化抑制率为 74.5％，相对标准偏差为4.2％，相同用量，对比例1的脂质过氧化抑制率为42.4％，相对标准偏差为21.3％，对比例2的脂质过氧化抑制率为51.6％；相对标准偏差为17.5％。通过上述数据可以看出，在本发明范围内得到的虾青素组合物脂质过氧化抑制率具有更好的代表性，且偏差较低，而本发明范围外得到的虾青素组合物脂质过氧化抑制率代表性较差，且偏差明显较高。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。