两种具有免疫调节的铁皮石斛叶多糖的制备方法及其应用

摘要

本发明涉及两种从铁皮石斛叶分离的多糖及其制备方法和用途，属于天然高分子领域。其优点表现在：利用GPC测定平均相对分子量和GC‑MS分析单糖组成，发现本发明铁皮石斛叶多糖A‑11平均相对分子量为28342Da，主要由半乳糖，阿拉伯糖和鼠李糖组成，摩尔比为3.21:1.11:0.23，还发现痕量的木糖，葡萄糖和甘露糖；铁皮石斛叶多糖A‑22平均相对分子量为41143Da，主要由葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比为3.23:1.02，还发现痕量的木糖、阿拉伯糖。同时，本发明的铁皮石斛叶多糖A‑11，A‑22都可以显著提高巨噬细胞吞噬中性红的能力，并显著促进巨噬细胞产生NO。

说明书

技术领域

本发明涉及天然高分子技术领域，具体地说，是两种具有免疫调节的铁皮石斛叶多糖的制备方法及其应用。

背景技术

铁皮石斛为兰科石斛属植物铁皮石斛的干燥茎，因表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛作为一种价值极高的珍贵传统中药材，具有生津养胃、退热润肺等滋补功效，素有“千金草”之称。2015版《中华人民共和国药典》中规定铁皮石解的茎作为药用部位，叶为非药用部位。铁皮石斛的茎通常加工成干品，如铁皮枫斗、铁皮石斛功能性饮料等；另外，铁皮石斛的鲜茎可直接食用，或炖汤，或泡茶，或浸酒。然而，铁皮石斛叶常作为废弃物，被焚烧或当肥料，造成了严重的资源浪费。最近几年人们发现铁皮石斛叶对高血压，高血糖，高血脂等症状有较好的辅助疗效，并作为保健茶饮用。因此，我们有必要对铁皮石斛叶资源进行深入研究并合理利用。

铁皮石斛主要含有多糖类、生物碱类，研究表明，多糖与铁皮石斛的药理活性，如提高机体免疫，抗氧化，抗肿瘤，抗衰老等密切相关。目前，人们对铁皮石斛多糖的研究几乎全部集中在茎部，对铁皮石斛叶的研究报道却较少。

中国专利文献CN104740335A、CN104740336A公开了一种具有降尿酸、降压作用的铁皮石斛叶提取物，通过以下方法制备得到：铁皮石斛叶洗净、干燥后，机械粉碎，用体积百分比浓度为0～30％的乙醇溶液回流提取1～3次，每次1～3h，每次用量分别为药材重量的5～20倍，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩得铁皮石斛叶提取物。中国专利文献CN105534831A公开了一种具有保湿功效的铁皮石斛叶提取物，由如下步骤的方法制备得到：S1.将铁皮石斛叶以1g:5～20ml的料液比加水回流提取1～5次，每次20～180min，得铁皮石斛叶水提液；S2.将铁皮石斛叶水提液浓缩，然后加入乙醇，使铁皮石斛叶水提液中的乙醇体积浓度达到50％～90％，沉淀8～36h，离心取沉淀即得。中国专利文献CN106581441A公开了一种铁皮石斛叶提取物的制备方法，将新鲜的铁皮石斛叶经过初步筛选去除杂质之后洗净；将干净的铁皮石斛叶进行粉碎；将铁皮石斛叶按固液比6-10倍加入溶剂中，进行微波处理48-60小时，后将处理过的溶液加热回流，加热2-3小时，回流提取，收集滤液，减压浓缩得铁皮石斛叶提取物。但是关于本发明的两种具有免疫调节的铁皮石斛叶多糖的制备方法及其应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供两种具有免疫调节的铁皮石斛叶多糖。

本发明的再一的目的是，提供两种具有免疫调节的铁皮石斛叶多糖的制备方法。

本发明的另一的目的是，提供两种具有免疫调节的铁皮石斛叶多糖的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种铁皮石斛叶多糖，所述的铁皮石斛叶多糖由以下步骤的制备方法制得：

(1)将干燥铁皮石斛叶研磨、粉碎、过20目筛，随后向铁皮石斛叶粉末加入5倍量的石油醚，搅拌使充分接触，静置2h，弃上层石油醚，重复操作3次，最后将石油醚减压挥干，得铁皮石斛叶脱脂粉末；加水，铁皮石斛叶脱脂粉末按照料液比1:30，70℃提取2h，得水提液，60℃减压浓缩，得浓缩液；

(2)向浓缩液加入3倍体积的Sevage试剂，所述的Sevage试剂为氯仿:正丁醇＝3:1，剧烈振荡30min，4000rpm离心20min，取上清，重复操作5次；随后60℃减压浓缩除去有机试剂并将溶液浓缩；

(3)向浓缩液加入3倍体积的85％乙醇，室温下静置48h沉淀多糖，4000rpm、20min、4℃离心收集沉淀；将沉淀物溶解于蒸馏水中，冷冻干燥得粗多糖；

(4)取粗多糖0.2g，配置成浓度为100mg/mL的溶液，上样量为2mL，经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6mol/L NaCl，溶液洗脱，自动部分收集器收集，流速为1mL/min，4min每管；收集第3-15管，合并后经浓缩、透析、冷冻干燥得多糖A-1；

(5)多糖A-1配置成浓度为100mg/mL的溶液，上样量为2mL，经Sephadex G-100柱分离，用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，自动部分收集器收集，流速为1mL/min，4min每管；采用苯酚-硫酸法检测，收集第9-14管，合并后经浓缩、透析、冷冻干燥得铁皮石斛叶多糖。

进一步地，所述的铁皮石斛叶多糖平均相对分子量为28342Da，主要由摩尔比为3.21:1.11:0.23的半乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖组成，以及痕量的木糖、葡萄糖和甘露糖。

进一步地，所述的铁皮石斛叶多糖的紫外图谱如附图9所示，红外图谱如附图10所示。

另一种铁皮石斛叶多糖，所述的铁皮石斛叶多糖由以下步骤的制备方法制得：

(1)将干燥铁皮石斛叶研磨、粉碎、过20目筛，随后向铁皮石斛叶粉末加入5倍量的石油醚，搅拌使充分接触，静置2h，弃上层石油醚，重复操作3次，最后将石油醚减压挥干，得铁皮石斛叶脱脂粉末；加水，铁皮石斛叶脱脂粉末按照料液比1:30，70℃提取2h，得水提液，60℃减压浓缩，得浓缩液；

(2)向浓缩液加入3倍体积的Sevage试剂，所述的Sevage试剂为氯仿:正丁醇＝3:1，剧烈振荡30min，4000rpm离心20min，取上清，重复操作5次；随后60℃减压浓缩除去有机试剂并将溶液浓缩；

(3)向浓缩液加入3倍体积的85％乙醇，室温下静置48h沉淀多糖，4000rpm、20min、4℃离心收集沉淀；将沉淀物溶解于蒸馏水中，冷冻干燥得粗多糖；

(4)取粗多糖0.2g，配置成浓度为100mg/mL的溶液，上样量为2mL，经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6mol/L NaCl，溶液洗脱，自动部分收集器收集，流速为1mL/min，4min每管；收集第66-71管，合并后经浓缩、透析、冷冻干燥得多糖A-2；

(5)多糖A-2配置成浓度为100mg/mL的溶液，上样量为2mL，经Sephadex G-100柱分离，用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，自动部分收集器收集，流速为1mL/min，4min每管；采用苯酚-硫酸法检测，收集第14-19管，合并后经浓缩、透析、冷冻干燥得铁皮石斛叶多糖。

进一步地，所述的铁皮石斛叶多糖平均相对分子量为41143Da，主要由摩尔比为3.23:1.02的葡萄糖和半乳糖组成，以及痕量的木糖和阿拉伯糖。

进一步地，所述的铁皮石斛叶多糖的紫外图谱如附图9所示，红外图谱如附图10所示。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种铁皮石斛叶多糖的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：(1)铁皮石斛叶经粉碎机器粉碎，再过20目筛得到铁皮石斛叶粉末；(2)铁皮石斛叶粉末经石油醚浸泡脱脂得到脱脂铁皮石斛叶粉末；(3)脱脂铁皮石斛叶粉末水提得到铁皮石斛叶水提液；(4)铁皮石斛叶水提液经Sevage法除蛋白，85％乙醇沉淀，最后冷冻干燥获得粗多糖；(5)粗多糖经阴离子交换柱层析得到洗脱液；(6)第(5)步的洗脱液浓缩、透析、冷冻干燥获得多糖A-1；(7)多糖A-1经凝胶柱层析得到洗脱液；(8)第(7)步的洗脱液浓缩、透析、冷冻干燥得到铁皮石斛叶多糖。

另一种铁皮石斛叶多糖的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：(1)铁皮石斛叶经粉碎机器粉碎，再过20目筛得到铁皮石斛叶粉末；(2)铁皮石斛叶粉末经石油醚浸泡脱脂得到脱脂铁皮石斛叶粉末；(3)脱脂铁皮石斛叶粉末水提得到铁皮石斛叶水提液；(4)铁皮石斛叶水提液经Sevage法除蛋白，85％乙醇沉淀，最后冷冻干燥获得粗多糖；(5)粗多糖经阴离子交换柱层析得到洗脱液；(6)第(5)步的洗脱液浓缩、透析、冷冻干燥获得多糖A-2；(7)多糖A-2经凝胶柱层析得到洗脱液；(8)第(7)步的洗脱液浓缩、透析、冷冻干燥得到铁皮石斛叶多糖。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的铁皮石斛叶多糖在制备免疫调节剂中的应用。

进一步地，所述的免疫调节剂促进巨噬细胞的吞噬作用。

进一步地，所述的免疫调节剂增加巨噬细胞的一氧化氮的产生量。

所述的铁皮石斛叶多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明优点在于：

1、本发明首次从铁皮石斛叶中分离出两种多糖，分别测定其平均相对分子量，分析其单糖组成并确定其具体的活性用途。

2、铁皮石斛叶多糖A-11，A-22，经GPC测定，A-11，A-22的平均相对分子量分别为28342Da和41143Da。经GC-MS分析，A-11主要由半乳糖，阿拉伯糖和鼠李糖组成，摩尔比为3.21:1.11:0.23，还发现痕量的木糖，葡萄糖和甘露糖；A-22主要由葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比为3.23:1.02，还发现痕量的木糖，阿拉伯糖。

3、铁皮石斛叶多糖A-11，A-22都可显著促进巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的能力，A-11在5-500μg/mL浓度范围内，A-22在50-800μg/mL浓度范围内，与对照组相比都有显著性差异(P<0.05)，并且A-11促进巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的能力明显强于A-22。另外铁皮石斛叶多糖A-11，A-22都可显著促进巨噬细胞RAW264.7产生NO，A-11在125-500μg/mL浓度范围内，A-22在大于400μg/mL浓度范围内，与LPS对照组相比都有显著性差异(P<0.05)，并且A-11促进巨噬细胞RAW264.7产生NO的能力明显强于A-22。

附图说明

附图1：铁皮石斛叶多糖的提取流程图。

附图2：铁皮石斛叶多糖A的DEAE-52柱洗脱曲线。

附图3：铁皮石斛叶多糖A-1的Sephadex G-100柱洗脱曲线。

附图4：铁皮石斛叶多糖A-2的Sephadex G-100柱洗脱曲线。

附图5：铁皮石斛叶多糖紫外分光图谱。

附图6：铁皮石斛叶多糖红外分光图谱。

附图7：铁皮石斛叶多糖A-11对巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的影响图。

附图8：铁皮石斛叶多糖A-22对巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的影响图。

附图9：铁皮石斛叶多糖A-11对巨噬细胞RAW264.7产生NO的影响图。

附图10：铁皮石斛叶多糖A-22对巨噬细胞RAW264.7产生NO的影响图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1 铁皮石斛叶多糖A-11的制备

将干燥铁皮石斛叶研磨、粉碎、过20目筛，随后向铁皮石斛叶粉末加入石油醚(料液比为1:5)，搅拌使之与石油醚充分接触，静置2h，弃上层石油醚，重复上述操作3次，最后将石油醚减压挥干，得铁皮石斛叶脱脂粉末。加水，铁皮石斛叶脱脂粉末按照料液比1:30，70℃提取2h，得水提液，60℃减压浓缩，得浓缩液。

利用Sevage法除蛋白，向浓缩液加入3倍体积的Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝3:1)，剧烈振荡30min，4000rpm离心20min，取上清，重复上述操作5次。随后60℃减压浓缩除去有机试剂并将溶液浓缩。

向浓缩液加入3倍体积的85％乙醇，室温下静置48h沉淀多糖，4000rpm、20min、4℃离心收集沉淀。将沉淀物溶解于蒸馏水中，冷冻干燥得粗多糖。

取上述粗多糖0.2g，配置成浓度为100mg/mL的溶液，上样量为2mL，经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6mol/L NaCl，溶液洗脱，自动部分收集器收集，流速为1mL/min，4min每管；采用苯酚-硫酸法检测，以试管号为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线，收集第3-15管，合并后经浓缩、透析、冷冻干燥得多糖A-1。

上述多糖A-1配置成浓度为100mg/mL的溶液，上样量为2mL，经Sephadex G-100柱分离，用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，自动部分收集器收集，流速为1mL/min，4min每管；采用苯酚-硫酸法检测，以试管号为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线，收集第9-14管，合并后经浓缩、透析、冷冻干燥得铁皮石斛叶多糖A-11。

实施例2 铁皮石斛叶多糖A-22的制备

将干燥铁皮石斛叶研磨、粉碎、过20目筛，随后向铁皮石斛叶粉末加入石油醚(料液比为1:5)，搅拌使之与石油醚充分接触，静置2h，弃上层石油醚，重复上述操作3次，最后将石油醚减压挥干，得铁皮石斛叶脱脂粉末。加水，铁皮石斛叶脱脂粉末按照料液比1:30，70℃提取2h，得水提液，60℃减压浓缩，得浓缩液。

利用Sevage法除蛋白，向浓缩液加入3倍体积的Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝3:1)，剧烈振荡30min，4000rpm离心20min，取上清，重复上述操作5次。随后60℃减压浓缩除去有机试剂并将溶液浓缩。

向浓缩液加入3倍体积的85％乙醇，室温下静置48h沉淀多糖，4000rpm、20min、4℃离心收集沉淀。将沉淀物溶解于蒸馏水中，冷冻干燥得粗多糖。

取上述粗多糖0.2g，配置成浓度为100mg/mL的溶液，上样量为2mL，经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.05、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6mol/L NaCl，溶液洗脱，自动部分收集器收集，流速为1mL/min，4min每管；采用苯酚-硫酸法检测，以试管号为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线，收集第66-71管，合并后经浓缩、透析、冷冻干燥得多糖A-2。

多糖A-2配置成浓度为100mg/mL的溶液，上样量为2mL，经Sephadex G-100柱分离，用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，自动部分收集器收集，流速为1mL/min，4min每管；采用苯酚-硫酸法检测，以试管号为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线，收集第14-19管，合并后经浓缩、透析、冷冻干燥得铁皮石斛叶多糖A-22。

实施例3 两种铁皮石斛叶多糖的表征

一)多糖平均相对分子量的测定

A-11和A-22的平均相对分子量分别通过Waters 2695(7.8×300mm)凝胶渗透色谱系统(GPC)测定，该系统配备HR3，HR4，HR5柱和Waters 2414折射率检测器。上样50μL，流动相为纯水，流速1mL/min，柱温40℃，PEG为标样做标准曲线。

表1 铁皮石斛叶多糖A-11和A-22的GPC测定的结果

二)多糖的单糖组成分析

1、水解多糖为单糖：准确称取铁皮石斛叶纯化多糖A-11、A-22各5.0mg，分别放入两个安瓿瓶中，加入2.0mL三氟乙酸(TFA)溶液，密封，120℃水解8h。将水解产物置于减压真空干燥箱中快速干燥，依次加入甲醇2mL，减压蒸干，重复三次，直至TFA无残留，干燥产物备用。

2、水解单糖的衍生化：上述水解产物中依次加入0.1mL吡啶、5mg盐酸羟胺，通风橱中90℃加热30min，小心混匀冷却至室温，加入1.0mL乙酸酐，继续水浴30min，完成乙酰化衍生后减压浓缩干燥。每管加入色谱级氯仿1mL,振荡溶解，0.45μL微孔滤膜过滤后，进样上机分析。标准品单糖(鼠李糖，阿拉伯糖，岩藻糖，木糖，阿洛糖，甘露糖，葡萄糖和半乳糖)衍生化同以上操作。

3、上机分析条件GC-MS体系Agilent，77890A-5975C,USA；DB-5MS(30mm×0.25mm×0.25μm,Agilent)；N₂流速1mL/min，温度程序设置为：进样口温度为270℃，离子源温度230℃，柱温100℃保持2min，然后以20℃/min增加到190℃，再以20℃/min增加到260℃，最终以10℃/min升温到300℃，保持4min。

表2 铁皮石斛叶多糖A-11的GC-MS分析的结果

表3 铁皮石斛叶多糖A-22的GC-MS分析的结果

三)紫外光谱分析

取一定量除去蛋白的多糖溶于重蒸水中，制成浓度为0.5mg/mL溶液，在紫外可见光谱记录仪上扫描分析，波长范围：190nm-700nm；结果如图5，其在260nm和280nm处均无特征吸收峰，表明多糖无蛋白质和核酸。

四)红外光谱分析

准确称取干燥A-11和A-22各2mg，加入干燥的溴化钾粉末混匀研磨，倒入压片模具压片1min，置于样品扫描窗口，在4000～400cm^-1的范围内进行红外光谱扫描。结果如图6所示，可以看出：红外光谱分析显示，组分A-11和A-22都在3300～3500cm^-1有糖分子-OH伸缩振动引起的特征峰，是-OH形成的分子内、间氢键；2800cm^-1左右出现了较强吸收峰，是糖分子-CH、-CH₂、-CH₃伸缩振动引起的信号峰，这两组峰都为糖类的特征吸收峰，所以两种组分都是糖类物质；在1000～1200cm^-1处，两种组分都有明显的吸收峰，为C-O-C环内醚中的C-O伸缩振动，和C-O-H的O-H变角振动是C-H的变角振动，由图谱可知多糖中可能含有3,6-内醚桥；812cm^-1处是C-O-S伸缩振动的特征吸收峰，组分中存在半乳糖；872cm^-1是D-Man的吸收峰；775cm^-1波数处出现比较弱的葡萄吡喃糖环残基吸收峰；在1875～1835cm^-1没有糖醛酸的特征峰，表明多糖为中性糖。

实施例4 两种铁皮石斛叶多糖的用途

材料与试剂：铁皮石斛叶多糖A-11，A-22(实施例1、实施例2制备)，DMEM培养基(Sigma)，LPS(Sigma)，胚牛血清(Sigma)，胰蛋白酶(Sigma)，Griess试剂(Sigma)。

仪器恒温培养箱(上海博迅实业公司)，酶标仪(日本CORONA公司)，显微镜(上海光学仪器厂)，96孔板(美国BD公司)。

一、A-11，A-22对巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红功能的影响

巨噬细胞RAW264.7加入到96孔板中(5×10⁵个/孔)，随后每孔分别添加PBS，不同浓度的组分多糖A-11(5、25、125、250、和500μg/mL)和A-22(50、100、200、400、和800μg/mL)进行处理，每个浓度3个平行组，在37℃、5％CO₂条件下培养24h。随后，弃上清液，PBS洗涤2次，再逐孔添加100μL>2条件下培养30min。随后每孔再弃上清液，并用PBS洗涤3次，添加100μL细胞裂解液至每孔，37℃裂解细胞6h，在酶标仪490nm波长测定吸光值，OD值表示为吞噬作用。结果如图7、图8所示，铁皮石斛叶多糖A-11，A-22在高浓度时都可显著得促进巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红能力。

二、A-11，A-22对巨噬细胞RAW264.7产生一氧化氮(NO)的影响

RAW264.7细胞加入到96孔板中(5×10⁵个/孔)，随后每孔分别添加DMSO(空白对照组)，LPS(阳性对照组)，不同浓度的组分多糖A-11(5、25、125、250、和500μg/mL)和A-22(50、100、200、400、和800μg/mL)进行处理，每个浓度3个平行组，在37℃、5％CO₂条件下培养24h。之后加入100μL>

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。