一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法

摘要

本发明提供一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法，属于生物制药领域。该粘膜免疫增强剂含有质量比为（0.2‑4）:1的非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白和不耐热肠毒素B亚基，所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白、不耐热肠毒素B亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明还提供一种口蹄疫疫苗，含有灭活的口蹄疫病毒、25‑80μg/mL非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白和25‑80μg/mL不耐热肠毒素B亚基。本发明粘膜免疫增强剂，能够显著提高免疫动物对抗原的免疫应答，尤其是黏膜免疫应答；含有所述免疫增强剂的灭活疫苗免疫后能够诱导高滴度IgG和sIgA，免疫效果好。

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

口蹄疫（Foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-MouthDisease Virus, FMDV）引起的一种使偶蹄类动物发生的急性、热性高度接触性的传染病，以口腔粘膜和蹄部皮肤水泡和溃疡为主要临床症状。我国将FMD列为第一类动物疾病。目前，疫苗接种仍然是我国预防口蹄疫的主要手段。现在使用的口蹄疫疫苗主要以灭活疫苗为主，但是现有灭活疫苗的缺点很明显，抗体水平较低、不能诱导产生粘膜抗体。FMDV主要经粘膜感染，而预防接种主要以注射为主，如果能在注射的同时，诱导产生粘膜抗体，则会筑起预防口蹄疫病毒感染的第一道防线，而且大大降低防治工作的人力成本。

IgA（免疫球蛋白A ）主要分布在唾液、泪液、肠胃液、乳汁以及呼吸道分泌液等外分泌液当中，是黏膜免疫产生的主要抗体。细菌鞭毛蛋白（Flagella, F）和不耐热肠毒素（Labile toxin, LT）是具有良好免疫增强效果的佐剂，单一使用时能在一定程度上提高血清中和抗体效价，但诱导产生的IgA抗体滴度较低，甚至检测不到。

发明内容

本发明的目的：一是提供一种粘膜免疫增强剂，能够显著提高免疫动物对抗原的免疫应答，尤其是黏膜免疫应答； 二是提供含有所述免疫增强剂的灭活疫苗，其免疫后能够诱导高滴度IgG和sIgA，免疫效果好。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂，含有质量比为（0.2-4）:1的非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白和不耐热肠毒素B亚基，所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述不耐热肠毒素B亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

在本发明中，所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白采用如下方法制备：将非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白的编码基因插入表达载体，然后转化大肠杆菌，获得重组菌；诱导重组菌表达非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白，纯化后得到。

在本发明中，所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO：3所示。

在本发明中，所述不耐热肠毒素B亚基采用如下方法制备：将不耐热肠毒素B亚基的编码基因插入表达载体，然后转化大肠杆菌，获得重组菌；诱导重组菌表达不耐热肠毒素B亚基，纯化后得到。

在本发明中，所述不耐热肠毒素B亚基的编码基因序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供一种口蹄疫疫苗，含有灭活的口蹄疫病毒、25-80μg/mL非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白和25-80μg/mL不耐热肠毒素B亚基，所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述不耐热肠毒素B亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供所述口蹄疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：将含有质量比为（0.2-4）:1的非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白和不耐热肠毒素B亚基的水溶液与灭活口蹄疫病毒液按照体积比为10:90进行混合，得到疫苗水相；将疫苗水相与ISA206佐剂按照体积比1:1混合，乳化，得到口蹄疫疫苗；所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述不耐热肠毒素B亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

有益效果：

采用本发明提供的粘膜免疫增强剂制备的口蹄疫疫苗，皮下免疫能够同时诱导高滴度IgG和IgA，解决了现有口蹄疫灭活疫苗仅诱导产生IgG，不能诱导产生高滴度粘膜抗体的问题。本发明粘膜免疫增强剂制备的口蹄疫疫苗由于诱导产生了较高的IgA抗体水平，防控口蹄疫病毒感染的第一道防线，降低侵入门户-口咽部和鼻咽部的带毒量，大大降低防治工作的人力成本。

附图说明：

图1：纯化后的重组蛋白F的SDS-PAGE电泳图，M：中分子量蛋白质Marker；1：纯化后的重组蛋白F。

图2：纯化后的重组蛋白LTB的SDS-PAGE电泳图，M：低分子量蛋白质Marker；1：纯化后的重组蛋白LTB。

图3：仔猪免疫后血清中平均IgG抗体水平。

图4：仔猪免疫后猪鼻拭子中平均IgA抗体水平。

具体实施方式

实施例1：制备鞭毛蛋白（F）和不耐热肠毒素B亚基（LTB）

1、重组质粒的构建

非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白（缩写为F）的完整氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。不耐热肠毒素B亚基（缩写为LTB）的完整氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。申请人利用计算机软件对F和LTB的编码基因进行了密码子优化，优化后的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。将密码子优化后的F和LTB编码基因送金斯瑞公司合成。将两条合成序列分别克隆到pCold I载体的EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pCold>

2、重组菌的构建及鉴定

将获得的重组质粒pCold I-F和pCold I-LTB分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养。挑取平板上的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒，经EcoRⅠ与SalⅠ双酶切鉴定，然后用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。pCold>

将空质粒pCold I转化大肠杆菌BL21感受态细胞，得到对照菌株pCold I/BL21。

3、重组蛋白的诱导表达

分别诱导重组菌pCold I-F/BL21和pCold I-LTB/BL21表达重组蛋白F和LTB，阴性对照为对照菌株pCold I/BL21。具体方法如下：

（1）挑取重组菌的单菌落，接种于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB 液体培养基（含有10g/L 胰蛋白胨，5g/L 酵母粉，10g/LNaCl）中，37℃过夜培养。

（2）取步骤（1）得到的重组菌培养液100μl，接种于新鲜的含有100μg/mL氨苄青霉素的LB 液体培养基中，在37℃培养2-3h，使OD₆₀₀达到1.0-2.0。

（3）向OD₆₀₀达到1.0-2.0的菌液中加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，16℃继续培养24h。

（4）将诱导表达后的重组菌pCold I-F/BL21、pCold I-LTB/BL21和对照菌株pColdI/BL21在4℃、12000rpm 条件下离心10min，收集菌体；将菌体用PBS 缓冲液（0.05M，pH7.2）洗涤2 次后进行重悬。

（5）将菌体悬液置于冰浴中，用超声波裂解菌体，功率为200W，超声裂解5s，停顿5s，直至菌液澄清，得到各重组菌的裂解液。

（6）将各重组菌的裂解液，在4℃、12000rpm 条件下离心15min，分别收集各重组菌的裂解液上清。采用His Trap^TMHP柱（GE公司）纯化重组蛋白F和LTB。采用SDS-PAGE电泳检测重组蛋白F和LTB的纯化效果，并测定蛋白浓度。

从图1可以看到，在纯化后的重组蛋白F泳道上出现了大小约为51kDa的条带，纯度达到85%以上。从图2可以看出，在纯化后的重组蛋白LTB泳道上出现了大小约为12kDa的条带，纯度达到95%以上。

实施例2 口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂及对照免疫增强剂的配制

重组蛋白F和LTB按照实施例1中方法制备，FMDV灭活病毒液（猪O 型口蹄疫病毒缅甸98株，4ug/ml）由兰州兽医研究所提供，ISA206由上海Seppic公司提供。PBS缓冲液（磷酸盐缓冲液，pH=7.4, 0.01mM）是含有磷酸二氢钾 0.27g/L、磷酸氢二钠 1.42g/L、氯化钠 8g/L和氯化钾 0.2g/L的水溶液，购自南京助研生物科技有限公司。

1.口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂及采用该免疫增强剂制备的疫苗

（1）配制粘膜免疫增强剂A、B和C

配制重组蛋白F母液：用PBS缓冲液将实施例1中纯化后的重组蛋白F配制成浓度为2.0mg/mL 的溶液，备用。

配制重组蛋白LTB母液：用PBS缓冲液将实施例1中纯化后的重组蛋白LTB配制成浓度为2.0 mg/mL 的溶液，备用。

将重组蛋白F母液和重组蛋白LTB母液分别按照体积比为2:5、5:2和1:1混合，制备得到粘膜免疫增强剂A、B和C，具体见表1。

表1 各黏膜免疫增强剂及其组成和含量

黏膜免疫增强剂编号F母液：LTB母液（V/V）F浓度LTB浓度A2:50.57mg/mL1.43mg/mLB5:21.43mg/mL0.57mg/mLC1:11.00mg/mL1.00mg/mL

（2）配制口蹄疫疫苗A、B和C

将FMDV灭活病毒液分别与粘膜免疫增强剂A、B和C按照体积比为90:10进行混合，得到疫苗水相；将各疫苗水相分别与ISA206（Seppic 公司）按照体积比1:1混合，乳化，制备成剂型为W/O/W的口蹄疫疫苗A、B和C。口蹄疫疫苗编号与采用的粘膜免疫增强剂编号相对应。

2.配制对照疫苗

对照疫苗1：将重组蛋白F母液采用PBS缓冲液稀释到1mg/ml，然后将该稀释液与FMDV灭活毒液按照体积比10:90进行混合，得到疫苗水相；将疫苗水相与ISA206按照体积比1:1混合，乳化，制备对照疫苗1。

对照疫苗2：将重组蛋白LTB母液采用PBS缓冲液稀释到1mg/ml，然后将该稀释液与FMDV灭活毒液按照体积比10:90进行混合，得到疫苗水相；将疫苗水相与ISA206按照体积比1:1混合，乳化，制备对照疫苗2。

对照疫苗3：取FMDV灭活毒液与PBS缓冲液按照体积比90:10混合制备水相溶液，再与ISA206按照体积比1:1混合，乳化，制备对照疫苗3。

对照疫苗4：ISA206佐剂。

实施例3：口蹄疫疫苗A、B和C对猪的免疫效果

免疫方法：取60日龄、健康的FMDV阴性仔猪35头，随机分成7组，每组5只。将口蹄疫疫苗A、口蹄疫疫苗B、口蹄疫疫苗C、对照苗1、对照苗2、对照苗3、对照苗4各免疫一组仔猪，免疫剂量均为2 ml/头。分别于免疫后14天、28天和56天，采血测定IgG抗体水平，采集鼻拭子检测IgA抗体水平。

检测方法：采用口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒（韩国金诺）检测IgG抗体水平，方法参照说明书，OD₄₅₀小于0.6>450大于0.6判为阴性。采用间接ELISA法检测鼻拭子中IgA滴度，当S/N大于2.1时待检样品最大稀释倍数的倒数即为IgA抗体滴度，其中S是待检测样品（Sample）的OD₄₅₀，N是阴性对照的OD₄₅₀。间接ELISA法检测IgA滴度的步骤：将鼻拭子放置500μl>450。

结果分析：

（1）疫苗的免疫效力-血清平均IgG抗体水平

血清平均IgG抗体水平检测结果见图3。从图3可见，仔猪免疫疫苗A、B和C后28天，所有猪只血清的OD₄₅₀均远远小于0.6，均一度良好，抗体阳转率为100%，所有猪只血清的平均OD₄₅₀均远远小于0.6，说明免疫后仔猪产生了FMDV特异性的IgG；仔猪免疫对照疫苗1、2、3和4后28天，大部分猪只血清的OD450处于临界值，阳转率低。对照疫苗4，为阴性对照（只免疫佐剂），无阳转；对照疫苗1、2和3阳转率介于40%-60%。

（2）疫苗的免疫效力-鼻拭子中平均IgA滴度

鼻拭子中平均IgA滴度的检测结果见图4。从图4可见，仔猪免疫疫苗A、B和C后28～56天，鼻拭子中IgA滴度在76-140之间，而对照苗1、2、3和4免疫后的仔猪IgA滴度在1.4-10.4之间。

上述结果说明，重组蛋白F和LTB复配后作为口蹄疫疫苗的佐剂，能够诱导高滴度的IgG和IgA，尤其是IgA滴度水平是对照疫苗免疫后的至少7倍以上，说明本发明口蹄疫疫苗免疫佐剂能够显著提高免疫动物对抗原的黏膜免疫应答。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法

<130> 20170626-2

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<213> 非致病性大肠杆菌

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agtatggaaa ac 372