一种利用固定化酶制备菊芋低聚果糖的方法

摘要

本发明公开了一种利用固定化酶制备菊芋低聚果糖的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)将菊粉粗提液进行脱色、脱苦、脱盐处理，得到菊粉精制液；(2)将步骤(1)得到的菊粉精制液加入固定化菊粉内切酶树脂柱，从固定化菊粉内切酶树脂柱的流出液再加入模拟移动床色谱分离装置进行分离纯化，以水为洗脱剂，所述模拟移动床包括I～IV个区；所述固定化菊粉内切酶树脂柱内填充壳聚糖/二氧化硅固定化菊粉内切酶。得到的低聚果糖的纯度高，总柱效高、流动相耗量少，可以实现操作连续化，提高了原料的利用率，降低了生产成本。

说明书

技术领域

本发明属于低聚果糖制备技术领域，具体涉及一种利用固定化酶耦合模拟移动床色谱技术制备菊芋低聚果糖的方法。

背景技术

菊芋为菊科菊芋属多年生草本植物，又名欧洲菊芋、咖啡草或法国苣荬菜，原产于欧洲、西亚、中亚和北美洲，我国西北、华北及东北等地区均有分布。菊芭营养价值高，抗病虫害且高产，再生能力强，是一种很有开发潜力的高产优质饲草。菊芋肉质根内含70％左右(干物质重)的菊粉，可作为菊粉、低聚果糖(FOS)及高果糖浆的生产原料。

果糖基系列产品是指D-果糖经β(1→2)糖苷键连接而成的多糖，末端常含有一个葡萄糖基，分子式表示为GFn，或是Fm，其中G为终端葡萄糖单位(Glucose)，F代表果糖分子(Fructose)，n或m则代表果糖单位数。通常，一个糖苷键为一个聚合度(DP)，菊粉的聚合度为2～100，聚合度大于20时为低聚果糖，低聚合度时(DP＝2～9)为低聚果糖，如蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、果果三糖、果果四糖、果果五糖等，当两个果糖相互连接而组成的环状二糖，则为双果糖酐。

目前，高纯度低聚果糖的主要制备方法有酶法，发酵法，色谱法和膜分离法。①酶法：Lamia等以果糖转移酶作用于蔗糖制得的低聚果糖为原料，将葡萄糖氧化酶及过氧化氢酶协同作用于30％的总糖，得到纯度为86.92％的低聚果糖。Kyung等曾通过补加葡萄糖氧化酶至常规的FOS反应体系中，利用果糖基转移酶和葡萄糖氧化酶双酶法提高低聚果糖净含量，通过这种方法低聚果糖的净含量可提高至90％。Valdivieso等将经活力重组菌株中的一株具有高复制葡萄糖氧化酶活性基因和高葡萄糖氧化酶的菌株用于制备葡萄糖氧化酶。通过添加孢外葡萄糖氧化酶至FOS合成反应中，以去除反应过程中生成的葡萄糖，避免真菌β-呋喃果糖苷酶被抑制，最终低聚果糖含量达90％。②发酵法：张涛等将筛选得到的酵母添加于固形物质量分数为25％的普通级低聚果糖(FOS)溶液中，以消除产品中的副产物葡萄搪，得到了不含葡萄糖且FOS质量分数达85.23％的产品。Lin等利用海藻酸钙固定Aspergillus japonicus and Aspergillus nige两种微生物菌丝体于生物反应器中从蔗糖制备高含量低聚果糖产品，最后得到的低聚果糖含量达90％。③色谱法：此方法在日本和韩国有很广泛的应用,该方法在50～60％低聚果糖的基础上,通过色谱分离柱进行分离的方法把产品中的单糖和蔗糖除去,得到低聚果糖含量达到95％以上。④膜分离法：冯文亮、孙蔚榕、张永刚等分别采用了一级分离法、二级分离法和三级分离法纯化低聚果糖，获得的低聚果糖的纯度均达到90％以上。武金良采用二级纳滤和反渗透耦合的方法纯化低聚果糖，可得90％以上纯度和50％以上纯度的低聚果糖，其产率分别为13.2％和74.2％。

模拟移动色谱(SMB)技术是目前国内外比较先进的纯化手段，广泛的应用于糖醇、生物及医药等领域，这种技术可以实现连续化、自动化的生产，在热敏性、同分异构体物质的分离上具有独到之处。国内的SMB技术刚刚起步，还处于发展阶段，目前只有极少的几家公司和大学进行了研究，取得了一定的成果。在进行SMB分离试验时，需要根据制备色谱实验的结果，在其数据的基础上设计分区和计算初始参数，并通过实验调整进行工艺参数的优化。SMB技术可以实现大规模的产业化生产，可以实现连续化、自动化的控制，较制备色谱具有较大的优势。但现有技术中的模拟移动色谱技术其进料浓度低一般只有20％、产品折光低，导致浓缩成本的增加。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是，提供一种利用固定化酶制备菊芋低聚果糖的方法，以解决现有技术中低聚果糖纯度不高的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种利用固定化酶制备菊芋低聚果糖的方法，该方法包括如下步骤：

(1)将有菊芋制备得到的菊粉粗提液进行脱色、脱苦、脱盐处理，得到菊粉精制液；

(2)将步骤(1)得到的菊粉精制液加入固定化菊粉内切酶树脂柱，从固定化菊粉内切酶树脂柱的流出液再加入模拟移动床色谱分离装置进行分离纯化，以水为洗脱剂，所述模拟移动床包括I～IV个区，每一个区包括1～6根色谱柱，其中Ⅰ区、Ⅱ区色谱柱填充弱酸型阳离子交换树脂，Ⅲ区、Ⅳ区色谱柱填充阳离子分子筛；

所述固定化菊粉内切酶树脂柱内填充壳聚糖/二氧化硅固定化菊粉内切酶；

(3)将得到的低聚果糖溶液减压蒸发浓缩，既得到低聚果糖。

步骤(1)中，菊粉粗提液脱色、脱苦、脱盐的方法如下：将菊粉粗提液依次通过活性炭、壳聚糖、阳离子大孔树脂、纳滤膜。

步骤(2)中，模拟移动床色谱分离装置的工艺参数如下：

运行温度为35℃～50℃，压力为0.1～0.4Mpa，进料液流量20～100mL/min，洗脱剂的流量为50～130mL/min，设定I区流速为30cm/h～50cm/h，II区流速为20cm/h～50cm/h，III区流速为30cm/h～50cm/h，IV区流速为20cm/h～30cm/h；

作为优选，所述的阳离子大孔树脂为H103。

作为优选，所述的纳滤膜为DL8040F。

其中，所述的弱酸型阳离子交换树脂为D-85。

其中，所述阳离子分子筛的类型为Y型分子筛。

作为优选，模拟移动床色谱分离装置的工艺参数如下：

运行温度为45℃，压力为0.2Mpa，进料液流量50mL/min，洗脱剂的流量为70mL/min，设定I区流速为45cm/h，II区流速为35cm/h，III区流速为45cm/h，IV区流速为25cm/h。

其中，所述减压蒸发浓缩，其压力为-0.098Mpa。

其中，壳聚糖/二氧化硅固定化菊粉内切酶的制备方法如下：

(1a)取介孔二氧化硅1～10g、壳聚糖5～20g于100～150mL乙醇中，在50～100℃下反应10～24h，过滤，用乙醇洗涤，干燥，得到壳聚糖修饰的二氧化硅载体；

(2a)将步骤(1a)得到的壳聚糖修饰的二氧化硅载体加入体积分数为1％～4％的戊二醛水溶液中，反应2～10h，过滤，用水洗涤滤出物，再将滤出物加入内切菊粉酶的浓度为1～5mg/L的磷酸水溶液中，在30～40℃条件下反应1～10h，抽滤，得到壳聚糖/二氧化硅固定化菊粉内切酶。

有益效果：

本发明公开了一种利用固定化酶制备菊芋低聚果糖的方法，将固定化菊粉内切酶的树脂柱与模拟移动床色谱技术耦合，得到的低聚果糖的纯度高，可以实现操作连续化，提高了原料的利用率，降低了生产成本。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：菊粉精制液的制备。

取500g新鲜菊芋菊芋洗净、去皮、研磨压碎；将压碎的菊芋加入含有果胶酶的Tris-HCl缓冲液中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为1mol/L，pH为6.8，果胶酶的添加量是1000U/L，在35摄氏度下搅拌3h，然后将提取液加热至100℃，搅拌5h；过滤菊粉提取液，得到菊粉粗提液；

对菊粉粗提液进行脱色、脱苦、脱盐处理，将菊粉粗提液依次通过活性炭、壳聚糖、阳离子大孔树脂、纳滤膜，所述的阳离子大孔树脂为H103，所述的纳滤膜为DL8040F，得到菊粉精制液。

实施例2：

本发明中使用的菊粉内切酶购自诺维信公司，壳聚糖/二氧化硅固定化菊粉内切酶的制备方法如下：

(1a)取介孔二氧化硅1～10g、壳聚糖5～20g于100～150mL乙醇中，在50～100℃下反应10～24h，过滤，用乙醇洗涤，干燥，得到壳聚糖修饰的二氧化硅载体；

(2a)将步骤(1a)得到的壳聚糖修饰的二氧化硅载体加入体积分数为1％～4％的戊二醛水溶液中，反应2～10h，过滤，用水洗涤滤出物，再将滤出物加入内切菊粉酶的浓度为1～5mg/L的磷酸水溶液中，在30～40℃条件下反应1～10h，抽滤，得到壳聚糖/二氧化硅固定化菊粉内切酶。

实施例3：戊二醛浓度对固定化菊粉酶的酶活影响。

固定化载体制备和固定化方法参考实施例1～3，所不同的是，在固定化酶时，戊二醛体积浓度为0、1％、2％、3％、4％、5％。

表1戊二醛浓度对固定化菊粉酶的酶活影响

实施例4：固定化时间对固定化内切菊粉酶的酶活影响。

固定化载体制备和固定化方法参考实施例1～3，所不同的是，在固定化酶时，固定化时间为1h、2h、4h、8h、10h、12h。

表2固定化时间对固定化内切菊粉酶的酶活影响

固定化时间(h)固定化内切菊粉酶酶活(U/g)18712884486689571089912881

实施例5：内切菊粉酶浓度对固定化内切菊粉酶的酶活影响。

固定化载体制备和固定化方法参考实施例1～3，所不同的是，在固定化酶时，1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L。

表3内切菊粉酶浓度对固定化内切菊粉酶的酶活影响

内切菊粉酶浓度mg/L固定化内切菊粉酶酶活(U/g)18562932394749815878

在最有的条件下，该固定化菊粉酶能够将95％以上的低聚果糖水解为低聚果糖，固定化酶在使用20批次后酶活还能保持80％以上，具有较好的应用前景。

实施例6：模拟移动床色谱分离装置分离纯化低聚果糖。

从固定化菊粉内切酶树脂柱的流出液再加入模拟移动床色谱分离装置进行分离纯化，以水为洗脱剂，所述模拟移动床包括I～IV个区，每一个区包括1～6根色谱柱，其中Ⅰ区、Ⅱ区色谱柱填充D-85弱酸型阳离子交换树脂，Ⅲ区、Ⅳ区色谱柱填充Y型分子筛；将得到的低聚果糖溶液在-0.098Mpa减压蒸发浓缩，既得到高纯度低聚果糖。

模拟移动床色谱分离装置的工艺参数如下：

运行温度为45℃，压力为0.2Mpa，进料液流量50mL/min，洗脱剂的流量为70mL/min，设定I区流速为45cm/h，II区流速为35cm/h，III区流速为45cm/h，IV区流速为25cm/h。

得到低聚果糖溶液中低聚果糖含量为99％，低聚果糖提取效率为95％。

实施例7：

其他条件与实施例6相同，所不同的是，调节模拟移动床色谱分离装置的运行温度为35℃、40℃、45℃、50℃。检测低聚果糖流出口低聚果糖的含量及聚合度，检测结果如下表。

表4温度对低聚果糖分离效率的影响

实施例8：压力对低聚果糖分离效率的影响。

其他条件与实施例2相同，所不同的是，调节模拟移动床色谱分离装置的运行压力为0.1～0.4Mpa。检测低聚果糖流出口低聚果糖的含量及聚合度，检测结果如下表。

表5压力对低聚果糖分离效率的影响

实施例8：I区流速对低聚果糖分离效率的影响。

表6I区流速对低聚果糖分离效率的影响

实施例9：II区流速对低聚果糖分离效率的影响。

表7II区流速对低聚果糖分离效率的影响

实施例10：III区流速对低聚果糖分离效率的影响。

表8III区流速对低聚果糖分离效率的影响

实施例11：IV区流速对低聚果糖分离效率的影响。

表9IV区流速对低聚果糖分离效率的影响