放线菌JY‑22抗真菌成分分离方法及其在复配剂中的应用

摘要

本发明公开了放线菌JY‑22抗真菌成分分离方法，包括如下步骤：JY‑22菌株发酵液抗真菌成分的初步提取、大孔树脂D101富集活性物质、硅胶柱层析分离纯化抗生素JY‑22、SephadexLH‑20柱层析、高效液相色谱制备分离、高效液相色谱分析即分离提纯到放线菌JY‑22抗真菌成分；本发明还公开了放线菌JY‑22抗真菌成分的复配剂：所述复配剂按体积分数计，浓度为3mg/L‑4mg/L的吡唑醚菌酯1‑2份，浓度为120mg/L‑130mg/L的放线菌JY‑22粗提浸膏6‑7份。本发明提供了一种新的吸水链霉菌JY‑22抗真菌活性物质分离工艺，该抗真菌活性物质对多种有害真菌具有很好抑制作用。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物天然产物抗生素分离技术领域，尤其涉及一种放线菌JY-22抗真菌成分分离方法及其在复配剂中的应用。

背景技术

放线菌(Actinomycesbovis)是一类重要的原核生物，主要呈菌丝状生长并以孢子繁殖，大部分属于革兰氏阳性细菌,能产生大量抗生素，在工、农、医药、食品、环境治理等领域广泛应用。据统计,从放线菌中发现的生物活性物质已经超过13700余种,占已发现天然活性物质的40％以上，目前在医、农使用的抗生素达150多种，其中2/3来自放线菌，放线菌中链霉菌属(streptomyces)在植物病害防治方面发挥巨大作用。

从土壤放线菌中研制新的生物农药是一种有效途径，如井冈霉素，农抗120和多种抗生素等9种，临时登记的有生菌素、宁南霉素，都是开发成功的案例。近几十年来，人们只研究和分离了1％-2％的土壤放线菌，对于土壤放线菌尚有较大的研究潜力，特别是放线菌抗真菌成分的研究和分离工艺。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一是提供放线菌JY-22抗真菌成分分离方法，该分离工艺可以得到纯的抗菌物质。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

放线菌JY-22抗真菌成分分离方法，包括如下步骤：

S1：JY-22菌株发酵液抗真菌成分的初步提取，取菌株JY-22发酵液离心并收集上清液，旋转蒸发得到浓缩发酵液，在浓缩发酵液中加入乙醇并沉降过夜，离心后取上清液旋转蒸发得到二次浓缩液，然后用石油醚萃取二次浓缩液，再用正丁醇萃取二次浓缩液，最后收集正丁醇部分旋转蒸干，得到粗提浸膏；在浓缩发酵液中加入乙醇主要是为了除去发酵液中蛋白质及多糖等部分杂质，用石油醚萃取二次浓缩液是为了除去部分脂溶性物质，正丁醇可以有效的萃取出活性成分,效果优于二氯甲烷、乙酸乙酯。二次浓缩液后，相比一般的直接萃取活性物质，本发明采取先用石油醚萃取除去了极性小的脂溶性杂质，可以减少后续杂质的分离难度。

S2：大孔树脂D101富集活性物质，将粗提浸膏用去离子水溶解后上样于装有大孔树脂的玻璃柱，静置吸附2-3h，依次用2-3倍柱体积的去离子水、浓度为30％-35％的乙醇、浓度为90％-95％的乙醇洗脱，流速控制在2BV/h，收集90-95％乙醇部分，60℃减压旋转蒸干后用甲醇溶解得到粗提物A；将粗提物上样于大孔树脂吸附要优于传统的用大孔树脂处理发酵液，由于发酵液杂质较多，用大孔树脂直接处理发酵液，会使得含有活性组分的收集液中杂质含量提高，由于发酵液体积较大，直接吸附洗脱时造成活性物质损失相比粗提物吸附洗脱较多。

S3：硅胶柱层析分离纯化抗生素JY-22，用适量甲醇溶解粗提物A得到样品一，然后按照200-300目硅胶与样品一的质量比例为1:1进行混匀伴样，然后按照硅胶与样品一的质量比例为45：1进行装柱，再以6-8份体积分数的甲醇、2-3份体积分数的氯仿、0.1-0.3份体积分数的氨水、剩下的以水补齐作为溶媒和流动相，然后用薄层板点板合并相同组分，再用抑菌圈法检测活性，收集活性组分得到粗提物B；

S4：SephadexLH-20柱层析，用适量甲醇溶解粗提物B得到样品二，将样品二缓慢加入装有聚糖凝胶LH-20的玻璃柱中，再用甲醇洗脱，薄层层析点板合并相同组分，抑菌圈检测活性，收集活性组分一后用5-6份体积分数的甲醇、4-5份体积分数的水的混合液溶解，缓慢加入装有葡聚糖凝胶LH-20的玻璃柱中，再用5-6份体积分数的甲醇、4-5份体积分数的水的混合液洗脱，用薄层层析点板合并相同组分得到粗提物C；

S5：高效液相色谱(HPLC)制备分离，对粗提物C进行液相分离，以变化浓度的甲醇与水(0.5％浓氨水)作为流动相，流动相洗脱条件:0-30min70％-80％甲醇，30-40min90％-95％甲醇，C18柱作为固定相，200-400nm检测，收集各个明显单峰，抑菌圈检测活性；

S6：高效液相色谱分析，Shimadzu LC-20AD型高效液相色谱仪用Inertsil C18柱，洗脱剂选择甲醇和去离子水(0.5％浓氨水)，流动相洗脱条件0-15min80％-85％甲醇，15-25min90％-95％甲醇，检测波长220nm，进样量12μL。

进一步，在S3步骤中的薄层板点板分析和抑菌圈法检测活性中，具体操作方法为：在标记各个斑点后，在超净工作台中进行操作，用少量石油醚涂布薄层板后，刮取各个斑点的硅胶，将硅胶置于涂有真菌孢子悬浮液的PDA培养皿内，培养观察抑菌圈，判断是否具有活性。硅胶板直接刮取斑点检测活性，可以快速判断具有抑菌活性物质的基本特性、在活性组分中的位置(RF值)和相对极性大小；由于所述活性物质在石油醚中不溶解，则用石油醚涂布薄层硅胶板起到灭菌作用且不会出现斑点扩散移动，避免造成外界接触过的硅胶板带入杂菌污染，同时因石油醚易挥发也不会给试验带来误差，该方法使得活性检测简便易行，缩短了整体试验时间，判断准确性提高。

进一步，在S2步骤中，大孔树脂的预处理方法为：

用90％-95％乙醇浸泡大孔树脂，不断搅动使其充分溶胀，除去小的杂质及颗粒后装柱，再用90％-95％乙醇以2BV/h冲柱至流出乙醇不再混浊，之后再用去离子水以2BV/h的流速洗脱至流出液不再有白色且无乙醇味，用1mol/L-1.5mol/L2BV的HCL的溶液以4BV/h左右的流速通过树脂并浸泡3h，用去离子水洗至流出液PH中性，再同样用1mol-1.5mol的NaOH的处理洗至PH中性。

进一步，在S3步骤中，装柱前2d将200-300目硅胶按质量比加入10％-15％去离子水密封每隔段时间混匀一次，装柱采用湿法装柱，采用以6-8份体积分数的甲醇、2-3份体积分数的氯仿、0.1-0.3份体积分数的氨水、剩下的以水补齐作为溶媒，硅胶与样品比例＝45：1装柱，待柱子沉降压实完全后，将样品均匀铺在柱床表面，并覆盖2-3cm厚的硅胶层，并用以6-8份体积分数的甲醇、2-3份体积分数的氯仿、0.1-0.3份体积分数的氨水、剩下的以水补齐作为洗脱剂洗脱，每100ml收集一份，薄层板点板合并相同组分，抑菌圈法检测活性，确定活性组分。

进一步，S4步骤中，葡聚糖凝胶LH-20在装柱前用甲醇洗脱充分溶胀，容器中甲醇体积大于凝胶体积，溶胀过程搅拌除去凝胶中的气泡，避免过分搅拌破坏凝胶粒表面，静置过夜，溶胀后装柱，将甲醇与凝胶的混悬液加入100cm×1cm的玻璃柱中，使凝胶沉降均匀完全。

本发明的目的之二是提供放线菌JY-22抗真菌成分的复配生物农药，对多种有害真菌具有很好抑制作用。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

含有放线菌JY-22抗真菌成分的复配剂，所述复配剂按体积分数计，浓度为3mg/L-4mg/L的吡唑醚菌酯1-2份，浓度为120mg/L-130mg/L的放线菌JY-22粗提浸膏6-7份。该复配剂对棉花枯萎病菌、小麦纹枯病菌、柑橘青霉、马铃薯干腐病菌等多种有害真菌具有很好抑制作用，抑菌谱广。

本发明的有益效果：(1)本发明提供了一种新的吸水链霉菌JY-22抗真菌活性物质分离方法，该分离方法简单、提取率高，为进一步开发应用吸水链霉菌JY-22活性成分提供技术支持；(2)本发明提供了含有放线菌JY-22抗真菌成分的复配剂，该复配剂对棉花枯萎病菌、小麦纹枯病菌、柑橘青霉、马铃薯干腐病菌等多种有害真菌具有很好抑制作用，抑菌谱广。

附图说明

图1是本发明的工艺流程图；

图2是本发明实施例一中活性组分的硅胶层析TLC结果；

图3是本发明实施例一中活性组分的Sephadex LH-20TLC结果；

图4是本发明实施例一中JY-22活性成分的HPLC分析图；

图5是本发明实施例一中活性物质的HPLC TLC结果；

图6是本发明实施例二中JY-22粗提物不同溶剂系统的薄层展开效果图。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明进行详细说明：

实施例一：

放线菌JY-22抗真菌成分分离方法，包括如下步骤：

S1：JY-22菌株发酵液抗真菌成分的初步提取：

取菌株JY-22发酵液，室温下以10000r/min的转速离心并收集上清液，在原始PH条件下，在60℃中旋转蒸发浓缩10倍得到浓缩发酵液，再向浓缩发酵液中加入95％乙醇，使乙醇含量占70％，再于4℃条件下沉降过夜，室温下以10000r/min的转速离心去除沉淀得到上清液，再将刚得到的上清液旋转蒸发除去乙醇得到二次浓缩液，然后用石油醚萃取二次浓缩液除去部分脂溶性物质，再用正丁醇萃取二次浓缩液，收集正丁醇部分旋转蒸干，得到粗提浸膏；

S2：大孔树脂D101富集活性物质：

首先对大孔树脂做预处理，用95％乙醇浸泡大孔树脂，不断搅动使其充分溶胀，除去小的杂质及颗粒后装柱，再用95％乙醇以2BV/h的流速冲柱至流出乙醇不再混浊，之后再用去离子水以2BV/h的流速洗脱至流出液不再有白色且无乙醇味，用1mol/l 2BV的HCL的溶液以4BV/h的流速通过树脂并浸泡3h，用去离子水洗至流出液PH中性，再同样用1mol的NaOH的处理洗至PH中性。上述处理后的大孔树脂用柱长60cm直径4cm的玻璃柱，湿法装柱，用去离子水平衡；

然后进行上样与洗脱：将粗提浸膏用15mL去离子水溶解上样，上样时应保持柱床表面平稳，加样完毕后关闭旋塞，静置吸附2h，之后依次用2BV体积的去离子水、30％浓度的乙醇、95％浓度的乙醇洗脱，流速控制在2BV/h，除去去离子水洗脱部分与30％乙醇，收集95％乙醇部分，在60℃减压旋转蒸干后用甲醇溶解得到粗提物A，并于4℃下保存；

S3：硅胶柱层析分离纯化抗生素，用适量甲醇溶解粗提物A得到样品一，然后按照200-300目硅胶与样品一的质量比例为1:1进行混匀伴样，装柱前2d将200-300目硅胶按质量比加入15％去离子水密封每隔段时间混匀一次，挥干至无甲醇气味后进行装柱；

采用湿法装柱，采用甲醇：氯仿：氨水：水＝8：2：0.2：水饱和作为溶媒，硅胶与样品比例＝45：1进行装柱，待柱子沉降压实完全后，将样品均匀铺在柱床表面，并覆盖2-3cm厚的硅胶层，再以甲醇：氯仿：氨水：水＝8：2：0.2：水饱和作为洗脱剂洗脱，100mL收集一份用薄层板点板合并相同组分(活性组分的硅胶层析TLC结果见图2)，再用抑菌圈法检测活性，具体操作方法为：在标记各个斑点后，在超净工作台中进行操作，用少量石油醚涂布薄层板后，刮取各个斑点的硅胶，将硅胶置于涂有真菌孢子悬浮液的PDA培养皿内，培养观察抑菌圈，收集活性组分得到粗提物B；

S4：SephadexLH-20柱层析：

SephadexLH-20在装柱前用甲醇洗脱充分溶胀，容器中甲醇体积大于凝胶体积，溶胀过程搅拌除去凝胶中的气泡，避免过分搅拌破坏凝胶粒表面，静置过夜，溶胀后将甲醇与凝胶的混悬液加入100cm×1cm的玻璃柱中，使凝胶沉降均匀完全；

用适量甲醇溶解粗提物B得到样品二，将样品二缓慢加入装有SephadexLH-20的玻璃柱中，再用甲醇洗脱，流速6滴/min，每3mL收集一份，薄层层析点板合并相同组分，抑菌圈检测活性，收集活性组分一后用甲醇：水＝6：4的混合液溶解，缓慢加入装有葡聚糖凝胶LH-20的玻璃柱中，再用甲醇：水＝6：4的混合液洗脱，流速6滴/min，每1mL收集一份，用薄层层析点板合并相同组分得到粗提物C(活性组分的Sephadex LH-20TLC结果见图3)；

S5：高效液相色谱(HPLC)制备分离，对粗提物C进行液相分离，以变化浓度的甲醇与水(0.5％浓氨水)作为流动相，流动相洗脱条件:0-30min75％甲醇，30-40min95％甲醇，C18柱作为固定相，220nm检测，收集各个明显单峰，抑菌圈检测活性，得到抗真菌成分(JY-22活性成分的HPLC分析图见图4)；

S6：高效液相色谱分析，对S5步骤中的活性峰进行分析高效液相检测，ShimadzuLC-20AD型高效液相色谱仪用Inertsil C18柱，洗脱剂选择甲醇和去离子水(0.5％浓氨水)，流动相洗脱条件0-15min85％甲醇，15-25min95％甲醇。检测波长220nm，进样量12μL(活性物质的HPLC TLC结果见图5)。

在实施例一中，S1步骤获得活性粗提浸膏中，分别对乙醇沉淀、石油醚提取液、正丁醇提取液及水相进行生物测定，具体操作方法为：通过在PDA培养皿中央接种烟草赤星病菌，采用牛津杯碟法测定乙醇沉淀、石油醚提取液、正丁醇粗提浸膏及水相的抑菌活性，取上述去离子水溶解液各150μL加入牛津杯，7d后测抑菌半径。检测结果表明：从表一中可以看出，正丁醇部分抑菌圈半径最大为:2.1cm，可见乙醇沉淀能够有效除去发酵液中的蛋白质多糖等部分杂质，保留活性组分，同时沉淀也表现出一定的抑菌性，可能由于在乙醇沉淀的时难免由于蛋白质多糖沉淀吸附包裹部分活性组分，由此可以认为抑菌物质的活性组分还是主要存在于正丁醇的粗提物中。

表一 提取液和沉淀的抑菌活性

实施例二：

S1：操作同实施例一中的S1步骤；

S2：大孔树脂D101富集活性物质：首先对大孔树脂做预处理，处理方法采用实施例一中S2步骤中的预处理方法，上述处理后进行上样与洗脱，将粗提浸膏用15mL去离子水溶解上样，上样时应保持柱床表面平稳，加样完毕后关闭旋塞，静置吸附2h，之后依次用2BV体积的去离子水、30％浓度的乙醇、50％浓度的乙醇、70％浓度的乙醇、95％浓度的乙醇、丙酮洗脱，流速控制在2BV/h，每个梯度收集样品并进行生物活性检测。

由表二可以看出，随着乙醇体积百分比增加抑菌圈增大，在乙醇体积达到70％时，洗脱圈直径最大，95％乙醇抑菌圈直径下降，0％及30％乙醇和丙酮抑菌圈为0；由此可以得出：在乙醇浓度为95％时能够将大孔树脂D101吸附的活性成分洗脱完全，达到最好洗脱效果，因此，将洗脱剂条件确定为：去离子水，浓度为30％的乙醇，浓度为95％的乙醇，每个浓度2BV体积，流速2BV/h洗脱，收集95％乙醇部分，旋转蒸干。

表二 不同体积分数乙醇洗脱液的抑菌圈直径

实施例三：

S1：操作同实施例一中的S1步骤；

S2：操作同实施例一中的S2步骤；

S3：采用薄层层析(TLC)分析方法，用毛细管点样粗提物A，点样斑点直径小于4mm，将样品用展开剂在层析缸中上行展开，用碘显色和紫外观察判断展开情况，其中展开剂系统的最优选择为甲醇：氯仿：氨水：水＝8.5：1.5：0.2：饱和，选择展开效果相对较好的薄层板，在超净工作台中，用少量石油醚涂布薄层板后，刮取各个斑点的硅胶，将硅胶置于涂有真菌孢子悬浮液的PDA培养皿内，培养观察抑菌圈，判断是否具有活性,确定活性区域RF值。

通过薄层层析能够进行硅胶柱层析之前预先判断。本发明对多种展开剂系统进行试验，由表三和图6可见，当甲醇：氯仿：氨水：水＝8.5：1.5：0.2：饱和作为展开剂时，展开效果较为均匀，将薄层板硅胶层刮取，抑菌圈法检测活性，显示有活性组分的区域RF值在0.3左右，图6中红色小框区域，满足硅胶柱层析条件，为最佳展开系统进行硅胶柱层析进行分离化合物的代谢产物。

表三 不同溶剂系统的薄层展开结果

实施例四：

含有放线菌JY-22抗真菌成分的复配剂，所述复配剂最佳复配比为，浓度为4mg/L的吡唑醚菌酯2mL，浓度为125mg/L的放线菌JY-22粗提浸膏6mL。

从表四中可见，浓度为125mg/L的JY-22正丁醇粗提浸膏浓度、浓度为4mg/L的吡唑醚菌酯对烟草赤星病菌均有较佳的生长抑制效果。

表四 两种不同药剂对烟草赤星病的室内试验结果

将125mg/L的JY-22正丁醇粗提物与4mg/L的吡唑醚菌酯25％乳油，以不同体积进行复配，联合毒力测定结果见表五。数据显示将V(吡唑醚菌酯)：V(JY-22正丁醇粗提物)＝1：6作为最佳复配比。

表五 不同药剂混配对烟草赤星病菌毒力回归方程

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。