一种尿液中细胞染色后快速显色的染色剂及其使用方法

摘要

本发明提供一种尿液中细胞染色后快速显色的染色剂及其使用方法，其中，包括试剂A和试剂B，且试剂A和试剂B的质量比为0.25~4，在染色剂中，试剂A包括:中性红染料 0.6~1.2g；染料溶剂100g；试剂B包括:缓冲剂10mM~600mM；细胞膜损伤剂 0.1~8g；络合剂0~4g；pH调节剂0.01~10g；溶剂100g。该染色剂不需对尿液中细胞进行预处理就能对其直接染色，且显色时间短，操作简单、检测效率高；此外，该染色剂不影响具有病理意义的红细胞的形态，不会导致高浓度的红细胞样本发生聚集，有利于提高检测结果的准确性，可以实现自动化检测。

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，尤其涉及一种尿液中细胞染色后快速显色的染色剂及其使用方法。

背景技术

尿液中的有形成分包括红细胞、白细胞、管型、上皮细胞等多种成分。有形成分分析对泌尿系统、临近生殖系统以及其它系统疾病的检测具有重要意义。大量研究表明，尿液中的结晶、酵母菌会干扰尿红细胞的分析，大量的粘液丝和菌丝可引起管型计数的假阳，白细胞和小吞噬细胞以及细胞核不明显的白细胞和大红细胞、白细胞与滴虫、孢子和红细胞形态相近，而透明管型和精子为无色，出现误检漏检的几率较大，因此化学染色对病理意义颗粒的鉴别意义重大。虽然现有的尿液中有形成分的染色方法较多，但均存在不足，比如Sternheimer染色法、Sternheimer-Malbin染色法、Burhe-Muhlberg染色法和阿利新蓝-中性红染色法，不仅染色时间长（>1分钟），同种细胞显色不均一，且染色效果受尿液样本的pH值限制，此外，复合染料染色容易出现颗粒干扰物；May-Giemsa、瑞氏、吉氏、瑞吉复合染色法等固定染色法的样本制备工艺复杂，不利于提高检验的速度和实现自动化检验的目的；苏丹Ⅲ染色法、碘染色法、过氧化物酶染色法、含铁血黄素染色法等特殊染色法仅适用于尿液样本中某一类有形成分的分析。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种尿液中细胞染色后快速显色的染色剂及其使用方法，旨在解决现有的尿液细胞染色方法样本制备工艺复杂、染色时间长、红细胞形态受染色液影响且易发生聚集、以及不利于实现自动化检测的问题。

本发明的技术方案如下：

一种尿液中细胞染色后快速显色的染色剂，其中，包括试剂A和试剂B，且试剂A和试剂B用量的质量比为0.25~4，在染色剂中，

试剂A包括:

中性红染料0.6~1.2g；

染料溶剂100g；

试剂B包括:

缓冲剂10mM~600mM；

细胞膜损伤剂0.1~8g；

络合剂0~4g；

pH调节剂0.01~10g；

溶剂100g。

所述的尿液中细胞染色后快速显色的染色剂，其中，所述染料溶剂为纯化水和有机溶剂中的一种或多种。

所述的尿液中细胞染色后快速显色的染色剂，其中，所述有机溶剂可为甲醇、乙醇、乙二醇、戊醇、丙三醇、二甲基亚砜中的一种或其组合物。

所述的尿液中细胞染色后快速显色的染色剂，其中，所述缓冲剂为2-（N-吗啡啉）乙磺酸、1，3-二[（三羟甲基）甲氨基]丙烷、哌嗪-1，4-二乙磺酸、3-（N-吗啉基）丙磺酸、3-（N-吗啉基）-2-羟基丙磺酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷-盐酸、巴比妥钠-盐酸、丙酸-丙酸钠、乙酸-乙酸钠中的一组或几组的混合物。

所述的尿液中细胞染色后快速显色的染色剂，其中，所述细胞膜损伤剂为下列有机化合物中的一种或多种：

CH₃(CH₂)_n1COOR，n₁=0，1，2或3，其中R为Na、H或K；

所述的尿液中细胞染色后快速显色的染色剂，其中，所述络合剂为柠檬酸、柠檬酸盐或乙二胺四乙酸盐。

一种尿液中细胞染色后快速显色的染色剂的使用方法，其中，包括：

步骤S1、制备试剂A和试剂B；

步骤S2、先将制备的所述试剂A和试剂B按质量比为0.25~4的比例混合得到染色剂，再将所述染色剂滴加到浓缩后或非浓缩的尿液样本上；

步骤S3、染色5~30s后，得到染色后的尿液样本。

所述的尿液中细胞染色后快速显色的染色剂的使用方法，其中，试剂A和试剂B的制备方法分别为：

试剂A的制备：

A1、将溶液稀释剂、染料溶剂及化学染料按所述顺序加入到试剂瓶中，得到第一混合溶液A1；

A2、将上述含有第一混合溶液A1的试剂瓶置于摇床上充分溶解2~5小时，得到第二混合溶液A2；

A、对所述第二混合溶液A2进行过滤，将滤液标记为试剂A，并保存备用；

试剂B的制备：

B1、将缓冲剂、络合剂和细胞膜损伤剂加入纯化水中，使其充分溶解得到第一混合溶液B1；

B2、向所述第一混合溶液B1中加入pH调节剂调节pH值至4.8-7.0，得到第二混合溶液B2；

B、对所述第二混合溶液B2进行过滤，将滤液标记为试剂B，并保存备用。

所述的尿液中细胞染色后快速显色的染色剂的使用方法，其中，所述染色剂中试剂A和试剂B的质量比为0.25~4。

所述的尿液中细胞染色后快速显色的染色剂的使用方法，其中，所述染色剂与尿液样本的体积比为1~8。

有益效果：本发明提供的尿液中细胞染色后快速显色的试剂，不需对尿液中细胞进行预处理就能对其直接染色，且显色时间短，操作简单、检测效率高；此外，该染色剂不影响具有病理意义的红细胞的形态，不会导致高浓度的红细胞样本发生聚集，有利于提高检测结果的准确性和实现自动化检测的目的。

附图说明

图1、2、12为按照本发明中实施例4制备的染色剂及染色方法对尿液中的白细胞进行染色的效果图。

图3、4、5为按照本发明中实施例1制备的染色剂及染色方法对尿液中的上皮细胞（含线索细胞图4）进行染色的效果图。

图6、7、8为按照本发明中实施例2制备的染色剂及染色方法对尿液中的管型进行染色的效果图。

图9、10、11为按照本发明中实施例3制备的染色剂及染色方法对尿液中的红细胞进行染色的效果图。

具体实施方式

本发明提供一种尿液中细胞染色后快速显色的染色剂及其使用方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供的尿液中细胞染色后快速显色的染色剂，其中，包括试剂A和试剂B，且试剂A和试剂B的质量比为0.25~4，在染色剂中，

试剂A包括:

中性红染料0.6~1.2g；

染料溶剂100g；

试剂B包括:

缓冲剂10mM~600mM；

细胞膜损伤剂0.1~8g；

络合剂0~4g；

pH调节剂0.01~10g；

溶剂100g。

其中，化学染料选择能够扩散到细胞膜内部，并将细胞核细胞质区分的有机染料。化学染料与细胞相互作用的方式分为物理相互作用和化学相互作用，物理相互作用遵循相似相容原理，化学相互作用包括静电相互作用、氢键相互作用、范德华力、疏水力和共价键，其中静电相互作用最为常见，也是各种作用力中贡献最大的一种。染料的扩散速度受染料的分子量影响，分子量越大，扩散速度越慢。

基于上述作用原理，本发明中，化学染料优选中性红染料，作为一种弱碱性染料，其在近中性和碱性条件下带正电，与细胞内含负电基团的染色质分子上的磷酸基团，蛋白质分子上的羧基及细胞膜上的唾液酸分子相互作用显红色。细胞核内染色质致密，着色深，细胞质内染色质和蛋白分布疏松，着色浅。根据染色后的细胞形态可以清晰地分辨各种细胞类型。此外，该染料的适用范围广，能够对尿液中的白细胞、上皮细胞、红细胞、精子等多种成分进行染色。本发明中，中性红染料在A和B混合液中的质量分数为0.12%~0.96%，合适用量的中性红染料不仅能够将细胞进行快速染色，而且染色后的细胞中，细胞核与细胞质结构清晰，容易分辨，有利于提高检验效率。

本发明溶剂为纯化水和有机溶剂中的一种或多种，其作用是使化学染料能够长期稳定保存，并使制备的染色剂保持较好的染色效果。其中，纯化水有利于增加盐类的溶解度，同时能够对有机溶剂进行稀释，防止有机溶剂过多引起尿液样本中的红细胞变形。此外，纯化水用量的确定方法需满足两方面要求：其一是保证红细胞不发生形变，其二是确保染液无析出物。本发明中，试剂A在A和B混合液中的用量质量分数为20%~80%。所述染料溶剂的有机溶剂可为甲醇、乙醇、乙二醇、戊醇、丙三醇、二甲基亚砜（DMSO）或其组合物。如甲醇-乙醇、乙二醇-甲醇、DMSO-乙二醇、乙二醇-丙三醇或多种有机溶剂混合复配。有机溶剂与水之间也可以进行复配后作为染料溶剂，如甲醇-水、乙醇-水、乙二醇-水、戊醇-水、丙三醇-水、二甲基亚砜（DMSO）-水、乙二醇-甲醇-水、乙二醇-乙醇-水、乙二醇-丙三醇-水，丙三醇-甲醇-水，较佳的，乙二醇-水或乙二醇-甲醇-水作为染料溶剂的效果较好。

缓冲剂的主要作用是调节尿液pH值和渗透压，维持红细胞形态，同时保证相对恒定的染色环境，使染料对不同尿液样本中的细胞的染色效果相近。对于尿液体系，选择缓冲剂的缓冲范围在pH=4.8-7.0为宜，优选缓冲剂的缓冲范围在pH=4.8-6.8，较佳的，选择缓冲剂的缓冲范围在pH=5.0-6.2。缓冲剂可使用2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）、1，3-二[（三（羟甲基）甲氨基]丙烷（Bis-tris）、哌嗪-1，4-二乙磺酸（PIPES）、3-（N-吗啉基）丙磺酸（MOPS）、3-（N-吗啉基）-2-羟基丙磺酸（MOPSO）中的一种；也可以为磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠、Tris-盐酸、巴比妥钠-盐酸、丙酸-丙酸钠、乙酸-乙酸钠其中的一组，还可以为上述缓冲剂之间的复合缓冲体系。如选择1，3-二[（三（羟甲基）甲氨基]丙烷（Bis-tris）与丙酸-丙酸钠的复配体系，能够直接将尿液的pH值和渗透压调整为较合适的值，便于后续染色过程的进行。

缓冲剂发挥pH值调节作用时，在试剂A和试剂B混合后的溶液中，浓度为10mmol/L~600mmol/L较为合适；为保证较佳的染色效果，缓冲剂在试剂A和试剂B混合后的溶液中，浓度为10mmol/L~200mmol/L较为合适。

细胞膜损伤物质是一种能够破坏活细胞细胞膜屏障的有机化合物分子，其主要作用于磷脂双分子层，即，将自身的疏水端嵌入磷脂双分子层，使磷脂双分子层排列松散，这样，表面积增大的磷脂双分子层便于小分子扩散到细胞的内部，如染料分子，其可以从受损细胞膜自由扩散到细胞内部，对细胞核和细胞质染色。同时，要求细胞膜损伤物质在作用于磷脂双分子层时，不能影响细胞形态，尤其是不能影响脆弱的具有诊断意义的红细胞的形态。细胞膜损伤物质的用量以在显微镜下观察5分钟，红细胞无明显形变，红细胞计数不变为准。所述细胞膜损伤物质可以为以下三类，分别为：

CH₃(CH₂)_n1COOR，其中，n1=0，1，2或3，R可以是Na、H或者K；优选的，当n1=1或2时，细胞膜损伤物质的效果较好，且当细胞膜损伤物质在试剂A和试剂B混合后的溶液中，质量百分比为0.1%~8%时，优选1-4%时，细胞损伤物质能够在保证具有诊断意义的细胞形态不受影响的前提下，提高染料分子的跨膜速度，对尿液中的细胞进行快速染色。

络合剂能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶性络合物，其主要作用是减少尿液中无晶形盐类对染色过程的干扰。在本发明中，络合剂可以为柠檬酸盐或乙二胺四乙酸（EDTA）盐，络合剂的用量为，在试剂A和试剂B混合后的溶液中，质量浓度以0-4%为宜。

pH值调节剂，用来进一步调整染色剂的pH值，确保染色的pH值环境，染色剂能够快速对尿液中细胞进行染色，且不会对其形态造成影响。优选的，pH调节剂可以为乙酸、丙酸，盐酸等，以将试剂B的pH值调至4.8-7.0。

溶剂B的作用是将加入的盐类充分溶解，得到均一稳定的试剂B，便于与试剂A配合应用，进而对尿液中的细胞进行染色。本发明中，试剂B中的溶剂优选为纯化水，不仅对加入的不同物质均有较好的溶解性，且不会对尿液中的细胞造成影响。

此外，本发明还提供一种尿液中细胞染色后快速显色的染色剂的使用方法，包括：

步骤S1、制备试剂A和试剂B；

步骤S2、先将制备的上述试剂A和试剂B按质量比为0.25~4的比例混合得到染色剂，再将上述染色剂滴加到浓缩后的尿液样本上；

步骤S3、染色5~30s后，得到染色后的尿液样本。

较佳的，制备试剂A的步骤包括：向试剂瓶中先加入染料溶剂，再加入化学染料，得到第一混合溶液A1，将上述含有第一混合溶液A1的试剂瓶置于摇床上充分溶解2~5小时，得到第二混合溶液A2，将上述第二混合溶液A2进行过滤，将滤液标记为试剂A，并保存备用。制备试剂B的步骤包括：向溶剂纯化水中加入缓冲剂、络合剂和细胞膜损伤剂，充分溶解后得到第一混合溶液B1，然后用pH调节剂将上述第一混合溶液B1的pH值调至4.8-7.0，得到第二混合溶液B2，最后对上述第二混合溶液B2进行过滤，将滤液标记为试剂B，并保存备用。

将制备好的上述试剂A和试剂B按质量比为0.25~4的比例混合得到染色剂，再将上述染色剂滴加到非浓缩或浓缩后的尿液样本上。优选的，试剂A和试剂B的质量比为0.67~1.5，试剂A和试剂B按照上述比例进行混合时，染色剂溶液更加均一，性质更加稳定，染色速度更快。而染色剂与尿液样本加入的体积比为1~8，这是因为，当尿液与染色剂的体积比在上述范围内时，染色剂能够快速有效地将尿液中的细胞进行染色，且尿液中的细胞不会被加入的染色剂破坏原有的结构和形态，有利于提高检测结果的准确性。

向上述浓缩后的尿液中加入适量的染色剂后，染色5~30s，得到染色后的尿液样本。此外，本发明中的方法染色液，不仅适用于显微镜镜检，同时可以应用到流式数字图像分析技术中，有利于提高检测效率和检测结果的准确性。

实施例1

1、染色剂的制备

试剂A:

在棕色试剂瓶中按照先后顺序加入5.00g甲醇、95.00g乙二醇和1.20g中性红，得到第一混合溶液A1；之后，将装有上述第一混合溶液A1的棕色试剂瓶置于摇床上，中速溶解3小时，使得药品完全溶解，得到第二混合溶液A2；然后用0.22um滤膜对上述第二混合溶液A2进行过滤，将过滤后的溶液标记为试剂A，并置于棕色瓶中保存。

试剂B:

在试剂瓶中加入100.00g纯化水、4.20g（200mM）的1，3-二[（三（羟甲基）甲氨基]丙烷（Bis-tris）、8.00g丙酸钠，充分溶解后得到第一混合溶液B；向上述第一混合溶液B1中加入丙酸，使溶液B1的pH值至5.50±0.05范围内（25±1℃）；然后用0.22μm滤膜对上述第二混合溶液B2进行过滤，将过滤后的溶液标记为试剂B，并置于试剂瓶中保存。

2、染色方法

将上述试剂A与试剂B以1:1质量比例混合，摇匀配制成即用染色液。尿液样本可以通过离心的方法浓缩，先将浓缩的尿液样本放置在计数板中，然后将配好的染色液直接滴加到浓缩或非浓缩尿液样本，染液与尿液样本的比例为1：8，染色10s后即可得到染色后的尿液样本。

实施例2

1、染色剂的制备

试剂A:

在棕色试剂瓶中按照先后顺序加入100.00g乙二醇和1.20g中性红，得到第一混合溶液A1；之后，将装有上述第一混合溶液A1的棕色试剂瓶置于摇床上，中速溶解3小时，使得药品完全溶解，得到第二混合溶液A2；然后用0.22um滤膜对上述第二混合溶液A2进行过滤，将过滤后的溶液标记为试剂A，并置于棕色瓶中保存。

试剂B:

在试剂瓶中加入100.00g纯化水、2.10g（50mM）的2-（N-吗啉）乙磺酸一水合物（MES）、4.00g丙酸钠，4.00g EDTA-K₂充分溶解后得到第一混合溶液B1；用丙酸将第一混合溶液B1的pH值调节至6.00±0.05范围内（25±1℃）；然后用0.22μm滤膜对上述第二混合溶液B2进行过滤，将过滤后的溶液标记为试剂B，并置于试剂瓶中保存。

2、染色方法

将上述试剂A与试剂B以0.25：1的质量比进行混合，摇匀后配制成即用的染色液。将通过离心法浓缩的尿液样本放置在计数板中，然后将配好的染色液直接滴加到浓缩或非浓缩尿液样本中，染液与尿液样本的体积比为1：1，染色30s后即可得到染色后的尿液样本。

实施例3

1、染色剂的制备

试剂A:

在棕色试剂瓶中按照先后顺序加入100g丙三醇和0.6g中性红，得到第一混合溶液A；之后，将装有上述第一混合溶液A1的棕色试剂瓶置于摇床上，中速溶解3.5小时，使得药品完全溶解，得到第二混合溶液A2；然后用0.22um滤膜对上述第二混合溶液A2进行过滤，将过滤后的溶液标记为试剂A，并置于棕色瓶中保存。

试剂B:

在试剂瓶中加入100g纯化水、0.61g（50mM）的三羟甲基氨基甲烷（Tris）、8g丙酸钠和1.9g柠檬酸，充分溶解后得到第一混合溶液B1；用丙酸将第一混合溶液B1的pH值调节至6.70±0.05范围内（25±1℃）；然后用0.22μm滤膜对上述第二混合溶液B2进行过滤，将过滤后的溶液标记为试剂B，并置于试剂瓶中保存。

2、染色方法

将上述试剂A与试剂B以4：1的质量比进行混合，摇匀后即配制成即用的染色液。将通过离心法浓缩的尿液样本放置在计数板中，然后将配好的染色液直接滴加到浓缩或非浓缩尿液样本中，染液与尿液样本的体积比为3：7，染色5s后即可得到染色后的尿液样本。

实施例4

1、染色剂的制备

试剂A:

在棕色试剂瓶中按照先后顺序加入5g甲醇、95g乙二醇和0.8中性红，得到第一混合溶液A1；之后，将装有上述第一混合溶液A1的棕色试剂瓶置于摇床上，中速溶解4小时，使得药品完全溶解，得到第二混合溶液A2；然后用0.22um滤膜对上述第二混合溶液A2进行过滤，将过滤后的溶液标记为试剂A，并置于棕色瓶中保存。

试剂B:

在试剂瓶中加入100g纯化水、4g Bis-tris、8g丙酸钠，充分溶解后得到第一混合溶液B1；使用丙酸将第一混合溶液B1的pH值调节至5.00±0.05范围内（25±1℃）；然后用0.22μm滤膜对上述第二混合溶液B2进行过滤，将过滤后的溶液标记为试剂B，并置于试剂瓶中保存。

2、染色方法

将上述试剂A与试剂B以3：2的质量比进行混合，摇匀后即配制成即用的染色液。将通过离心法浓缩的尿液样本放置在计数板中，然后将配好的染色液直接滴加到浓缩或非浓缩尿液样本中，染液与尿液样本的体积比为1：6，染色20s后即可得到染色后的尿液样本。

实施例5

1、染色剂的制备

试剂A:

在棕色试剂瓶中按照先后顺序加入5g甲醇、95g乙二醇和1.2g中性红，之后，将装有上述第一混合溶液A1的棕色试剂瓶置于摇床上，中速溶解5小时，使得药品完全溶解，得到第二混合溶液A2；然后用0.22um滤膜对上述第二混合溶液A2进行过滤，将过滤后的溶液标记为试剂A，并置于棕色瓶中保存。

试剂B:

在试剂瓶中加入100g纯化水、3g Bis-tris、6g丙酸钠，充分溶解后得到第一混合溶液B1；用乙酸将第一混合溶液B1的pH值调节5.80±0.05范围内（25±1℃）；然后用0.22μm滤膜对上述第二混合溶液B2进行过滤，将过滤后的溶液标记为试剂B，并置于试剂瓶中保存。

2、染色方法

将上述试剂A与试剂B以2：3的质量比进行混合，摇匀后即配制成即用的染色液。将通过离心法浓缩的尿液样本放置在计数板中，然后将配好的染色液直接滴加到浓缩或非浓缩尿液样本中，染液与尿液样本的体积比为1：4，染色15s后即可得到染色后的尿液样本。

本发明中，从图1和图2可以看出，白细胞细胞核因染色质密集，染成深红色，细胞核边界清晰，细胞浆因染色质及蛋白成分相对较少，染色淡。

图3、4、5中可以看出，上皮细胞细胞核因染色质密集，染成深红色，细胞核边界清晰，细胞浆因染色质及蛋白成分相对较少，染色淡。

图6和图7中可以看出，管型表面糖蛋白染色淡，内含物因含有蛋白成分，染色深，清晰可辨。

图8中可以看出，滴虫淡染，染料增加了样本和背景的对比度，所以可见滴虫鞭毛和泡状核，易与染色后的白细胞鉴别；

图9中可以看出，染料增加了样本和背景的对比度，精子的核和尾巴染色后清晰可见，易与不染色的酵母菌鉴别。

图10和图11中可以看出，尿液中的红细胞不染色或淡染，红细胞轮廓清晰。

图12可以看出粘液丝和酵母菌不染色，但染色背景因染料的作用，略带颜色，照片对比度加深，使得不染色的酵母菌易与白细胞鉴别。

可以认为，本发明的尿液中细胞染色后快速显色的染色剂及其使用方法对于尿液中的不同细胞，均具有较好的染色效果。

综上所述，本发明提供了一种尿液中细胞染色后快速显色的试剂及其使用方法，该染色剂能够对尿液中的细胞进行快速染色，不损坏红细胞的形态，且使用方法简单，染色后的细胞显色均一，不仅能提高人工镜检的效率和准确度，对流式细胞-数码彩色成像技术的开发意义深远。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。