人工设计结构密码子优化及化学合成基因rdh及其表达产物多肽G1的制备和应用

摘要

本发明公开了一种人工设计结构密码子优化及化学合成的基因rdh及其表达的多肽G1的制备与应用。所述重新设计结构化学合成的基因rdhc具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。这种基因rdh序列在自然界是不存在的。该基因rdh表达的产物多肽G1具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。该多肽G1氨基酸序列在自然界是不存在的。本发明所述的重新设计人工化学合成基因rdh的表达产物——多肽G1的生物学效价大幅提高，稀释500倍能达到某对照产品稀释300倍的效果。这可以降低产品成本，减少农民负担。多肽G1生物制品，在促进植物生长发育、增产、增强植物抗逆性及抗病驱虫等方面应用效果良好。无毒、环保，在我国无公害农业应用前景广阔，有巨大的社会效益和经济效益。

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，专利发明者人工设计结构，密码子优化及化学合成了基因rdh.包括涉及基因结构的设计，化学合成，重组质粒构建，工程菌转化，工程菌培养，筛选，表达及多肽产物G1的制备，以及该基因和表达的多肽产物在农业生产，基因工程等方面的应用。

背景技术

基因的结构研究及设计，密码子优化及产物表达和应用，是生物工程及医学工程的重要课题。基因的来源分为自然存在和人工合成。至今已有大量自然基因被分离，克隆，并得到了专利保护。但在2013年6月13日美国最高法院裁定：人类自身的基因DNA片段因为是自然界存在的，所以不得申请专利，但人工合成的基因，可受到专利保护。

多肽是两个以上的氨基酸残基联起来的一大类生物活性物质，无高级结构的。它们与蛋白质的最根本区别在于蛋白质有高级结构。多肽具有很强的活性，也叫做活性肽。生物体中产生的多肽的种类成千上万，如胰岛素，生长激素，干扰素，等等。对生物的代谢起着重要的调控作用。人们已经分离出了许多活性多肽并应用于农业，医学诊断治疗。

在农业生产中多肽也有着很重要的应用。多肽类物质在植物细胞内快速传递信号，对植物的生长发育有重要的调控作用。多肽可以诱导植物的有益基因正表达，激发植物的系统抗性，激发植物的原始野性，提高农作物免疫能力，达到驱虫抗病抗逆效果。

我们从2010年前就开展了基因的人工设计，化学合成，质粒构建，工程菌重组构建，工程菌培养，筛选，表达及多肽产物的制备，农业上的应用等方面的研究。并在2014年9月申请发明专利。2016年5月25日得到发明名称为《一种人工设计化学合成的基因及其表达的多肽产物的制备与应用》的《发明专利证书》。专利号ZL2014 1 0477638.4。

从科学发明的角度讲，人工设计化学合成一个基因，是有风险且难度很大。因为基因是三联体核苷酸密码组成，一组密码子编码一个氨基酸，由许许多多的氨基酸残基构成多肽或蛋白质。而密码子错误会导致氨基酸的不同，多肽或蛋白质分子链条中氨基酸的不同，又会导致其化学性质及生物效价的改变。

大量试验证明，人工设计化学合成的基因其表达的多肽产物，有着比天然蛋白有更优良的性质，更有效的生物效价。会对我国的无公害农业发展及生态保护起到更积极的作用。

在此基础上，我们又重新设计一种基因结构，密码子优化及人工化学合成得到了rdh基因，用该基因构建工程质粒Pet28a(+),再转化构建基因工程菌E.coli.JM109(DE3)。经过数百次的试验及测试工作，培养、筛选，诱导基因表达，得到活性极高的多肽产物.我们命名为多肽G1。

其特点：1.这种人工设计密码子优化及化学合成基因rdh序列在自然界的动植物体内是不存在的。

2.该基因rdh表达的产物多肽G1本质上不是天然多肽，自然界也不存在这种多肽。

3.多肽G1分子无高级结构。

4.这种多肽G1分子量小，细胞内移转快，作用持久，生物学效价显著提高。

5.多肽G1极大地促进植物的生长发育功能及光合作用。显著提高植物抗病驱虫及抵抗不良气候条件如旱涝熱寒等等的能力。无毒环保，对环境友好，将在无公害农业生产方面有广泛的用途。

发明内容

本发明所要解决的技术问题，是提供一种人工设计结构密码子优化及化学合成的基因rdh.为下列序列之一：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；及其表达的多肽G1，以及由该多肽G1制得的生物制品在促进植物的生长发育及增产、提高植物的抗病抗逆及驱虫等免疫功效方面的应用。

本发明通过下述技术方案实现：

提供一种人工设计结构密码子优化及化学合成的基因rdh，为下列序列之一：1)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；2)将SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加，且与SEQ ID No.1具有相同编码产物的核苷酸序列。

由上述人工设计结构化学合成基因编码的多肽G1，具有下列氨基酸序列之一：1)如SEQ ID No.2所示的由SEQ ID No.1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且与具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽活性相同的由SEQ ID No.2序列衍生的多肽。

该人工设计结构密码子优化的基因rdh.可采用化学合成方法及PCR扩增法制备。

化学合成基于SEQ ID No.1所示核苷酸序列或用PCR方法获得含有SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列或其衍生物，酶切连接该基因rdh入原核表达载体或真核表达载体，如pET28a或其他类型的表达载体中。转化重组载体进入宿主菌，如：大肠杆菌等，构建基因表达工程菌。通过工程菌的实验室摇瓶培养诱导产生多肽G1产物或工业规模发酵生产多肽G1产物。也可将含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列克隆至植物表达载体，在植物中表达该含SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽G1等。

包含上述基因rdh序列(即，SEQ ID No.1所示序列)的重组质粒。

包含上述基因rdh序列(即，SEQ ID No.1所示序列)的工程菌。

在本发明的一个具体实施例中，提供了一种包含上述基因序列的大肠杆菌。

本发明提供了一种由包含SEQ ID No.1所示rdh基因序列的工程菌通过发酵制得的多肽G1。本发明提供包括小规模的实验室发酵和大规模的工业化发酵两种方式获得含有SEQ ID No.2所示序列的多肽G1，该方法产率高、获得的产品纯，活性更高。

上述人工设计结构密码子优化及化学合成基因rdh编码的多肽G1在制备生物制品方面的应用。具体如在制备生物农药、生物肥料等方面的应用。

在一个具体实施例中，通过发酵获得具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽G1或其衍生物，将该多肽G1稀释或者是添加其他物质(如氨基酸、微量元素等，微量元素包括铁、锰、锌等)配制后，用作生物农药或生物肥料等生物制品，通过喷洒、灌根、浸种等方式，促进植物的生长发育、增产、提高植物抵抗病驱虫、抗逆性等。

试验证明：多肽G1及其生物制品比同类产品有更高的生物效价。在一个对比实验中，某知名产品在稀释300倍达到最佳效果，而多肽G1稀释500倍仍能达到最佳效果。高效价可降低制品成本，可惠及农民，更可扩大产品在农业及生态建设方面的作用。

多肽G1生物制品在下述方面的应用：1)促进植物生长发育；2)促进植物增产，增加产品的自然风味；3)提高植物的抗病性，具体地，包括提高植物对细菌、真菌以及病毒的抗性；4)增强植物的抗逆性，具体地，包括增强植物的抗干旱、抗冻、抗寒抗高温以及抗涝等抗逆性；5)增强植物的驱虫性。

包括但不限于使用以下方式对植物施以上述生物制品：喷洒、灌根、浸泡种子等方式。所述生物制品适用于所有植物，包括但不限于以下植物：蔬菜、瓜果、花木、粮食，茶叶等等经济作物。

一种培育转基因植物的方法：将上述基因序列rdh(即，SEQ ID No.1所示序列)导入目的植物，获得转基因植物。

按照SEQ ID No.1所示的基因rdh的核苷酸序列，设计一对PCR扩增引物，即：

上游引物P1：5’-TAAGCG^GATCCATGGGAGCTTCTCTGCAAAT-3’

下游引物P2：5’-TCGAGTGC^GGCCGCTTAGCTGGAGAGCTTCTTCAACC-3’

其中，5’G^GATCC 3’为引物的BamH1限制酶位切点，5'GC^GGCCGC 3'为NotI限制酶位切点。以rdh为模板进行PCR扩增。扩增条件：95℃预变形2min30sec,再按照95℃30sec，58℃30sec，68℃1min，程序扩增共30个循环。

本发明获得的化学合成基因rdh，具有SEQ ID No.1所示序列，其编码区共有999核苷酸，该基因编码的多肽产物G1，无高级结构，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，共有332个氨基酸残基，分子量为33.2kda。本发明中将人工设计结构基因rdh化学合成后，经PCR扩增，用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。将纯化产物和经限制性酶EcoRV消化处理的pEV质粒进行连接，得到pEV-rdh重组质粒。然后用该重组质粒转化大肠杆菌E.coli DH5a，在加有100mg/L氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基中37℃培养生长，通过选择压筛选出阳性克隆菌株E.coli DH5a-pEV-rdh。通过该菌株的培养可源源不断地提取得到质粒pEV-rdh。

将质粒pEV-rdh和pET28a质粒用BamH1和NotI双酶切，把rdh基因克隆到pET28a中，得到重组质粒pET28a-rdh。再用这重组质粒转化菌株E.coli JM109(DE3)。用加有50mg/L卡那霉素(Km)的LB培养基筛选得到阳性克隆的表达工程菌株E.coli JM109(DE3)-pET28a-rdh，即，含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的工程菌。

通过实验室的小规模发酵(50-1000ml三角摇瓶)或者是工业化的规模发酵(发酵罐设备)制得含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽G1。在实验室用三角摇瓶发酵培养工程菌株E.coli JM109(DE3)-pET28a-rdh，诱导表达多肽产物G1，诱导剂IPTG终浓度0.3mM/L。

工业化规模制备用1吨发酵罐设备。通过供气，补料，调酸碱发酵培养，用IPTG终浓度0.3mM/L诱导并制备多肽产物G1生物制品。

综上所述，本发明如SEQ ID No.1所示的基因序列rdh及其编码的如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽G1，无毒、环保，在促进植物生长发育、增产、提高植物抗病性、抗逆性及驱虫性等方面应用效果良好，应用前景广阔。

附图说明

图1为多肽G1的电泳图。

图中从左到右：泳道1,泳道2为多肽G1，分子量33.2kda。

泳道3：标准蛋白，分子量从上往下依次为66.2，31，20，14.4kda。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。

本发明所用的质粒及菌株都是商品化购得，其中，

大肠杆菌E.coli JM109(DE3)，购自Promega公司；

大肠杆菌E.coli DH5a购自北京博迈德科技发展有限公司；

pEV质粒由Polepola Biotech公司提供；

pET28a质粒购自Promega公司；

本申请的发明人人工设计密码子优化的基因rdh(如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列)委托PolepolaBiotech公司用化学合成的方法合成。具体采用先进的PCR的两步DNA合成法(PCR-based two-step DNA synthesis(PTDS))，该方法已在A simple,rapid,high-fidelity and cost-effective PCR-based two-step DNA synthesis method for long gene sequences.Xiong AS et al.(2004a)文献中有详尽的描述。该合成的基因rdh经ABI公司的3730XL测序仪测序，其核苷酸序列与SEQ ID No.1所示的序列相一致。

实施例1

基因rdh的PCR扩增及纯化:

按照SEQ ID No.1所示的基因rdh的核苷酸序列，设计一对PCR扩增引物，即：

上游引物P1：5’-TCGCG^GATCCATGGGAGCTTCTCTGCAAAT-3’

下游引物P2：5’-TCGAGTGC^GGCCGCTTAGCTGGAGAGCTTCTTCAACC-3’。

其中G^GATCC为引物的BamH1限制酶位切点,5'GC^GGCCGC 3'为NotI限制酶位切点。以rdh为模板进行PCR扩增。扩增条件：95℃预变形2min30sec,再按照95℃30sec，58℃30sec，68℃1min，程序扩增共30个循环。扩增产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。

实施例2

rdh基因克隆菌株的构建:

对实施例1中的PCR扩增纯化产物和经限制性酶EcoRV消化的pEV克隆载体进行连接，得到pEV-rdh质粒。然后用该重组质粒转化大肠杆菌E.coli DH5a，通过在加有100mg/L氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基中37℃培养生长，通过选择压筛选出阳性克隆菌株E.coli DH5a-pEV-rdh。通过该菌株的培养可源源不断地提取得到质粒pEV-rdh。

实施例3

rdh基因表达工程菌株的构建：

将质粒pEV-rdh和pET28a质粒用BamH1和NotI双酶切，把rdh基因克隆到pET28a中，得到重组质粒pET28a-rdh。再用这重组质粒转化E.coli JM109(DE3)，用加有50mg/L卡那霉素(Km)的LB培养基筛选得到阳性克隆的表达工程菌株E.coliJM109(DE3)-pET28a-rdh。

实施例4

rdh基因的表达及产物多肽G1检测：

将表达工程菌株E.coli JM109(DE3)-pET28a-rdh在加有Km 50mg/L的LB液体培养基中37℃震动培养至吸光值OD600＝0.7，加入诱导剂IPTG到终浓度0.3mM，继续培养4小时。8000rpm离心5分钟，收集菌体超声波破碎，12％SDS_PAGE凝胶电泳。凝胶经考马斯亮蓝染色后，如附图1。

图1所示为rdh基因表达产物多肽G1的条带.图中：泳道1,泳道2为多肽G1，分子量33.2kda

泳道3：标准蛋白，分子量从上往下依次为66.2，31，20，14.4kda。

实施例5

多肽G1的发酵制备及纯化：

发酵制备可分为实验室小量发酵制备和工业化规模发酵制备

5.1实验室制备：将表达工程菌种E.coli JM109(DE3)-pET28a-rdh，在加有Km 50mg/L的LB固体培养基的培养皿划线培养过夜，挑选生长良好的单菌落接种到50ml或1000ml三角瓶的上述液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养12h,加终浓度0.3mM IPTG诱导4小时。培养液经8000rpm离心5min，收集沉淀的菌体，加缓冲液超声波破碎，再离心去细胞碎片，得到较高纯度的多肽G1。

5.2工业化大规模发酵制备：采用二级或三级发酵程序，在发酵罐中加入70％体积的发酵培养基：每升含葡萄糖15克，酵母和蛋白胨浸提物20克，硫酸镁0.5克，磷酸二氢钾1克，磷酸氢二钾12克,PH7.2，灭菌30分(120℃,1.1MPa)。按4％体积比接入菌种液，37℃发酵，溶氧(DO)控制在30％左右，氨水调节pH在7.0左右。当工程菌进入对数生长后期，加入诱导剂IPTG至0.3mM，再诱导发酵4小时放罐。发酵液经90℃10分钟灭活菌体，快速降温并用高压均质破碎机破碎，按配方添加必需物质(包括铁、锰、锌等微量元素以及氨基酸)，制成多肽G1生物制品。

无论采用实验室制备或工业化大规模发酵制备，密码子优化后，该基因在工程菌中的表达量大幅提高。多肽G1的产量提高90％。这可以大大降低产品成本，减少农民负担。有利于我国无公害农业的发展。

实施例6

多肽G1生物制品的使用方法及效果：

上述实施例5制备的多肽G1生物制品可用于植物，尤其是农林大田蔬果方面大面积使用，使植物的生长发育、产量、抗病性、抗逆性、驱虫性等方面均得到有效提高及免疫功能增强。

以下各项试验中，实验组(即采用了多肽G1生物制品或多肽G1生物制品的稀释液)提及的各项性能的提高均是相对于对照组而言。如无特别说明，对照组均是指的采用与实验组相同的方法作用于植物，只是将多肽G1生物制品替换成清水。

6.1叶面喷洒：在作物生长期都可使用。将本多肽生物制品配成稀释500倍溶液，喷施叶面，每25天一次。可增加植物根茎叶产量15-35％，提高产量10-35％。其中：大白菜经3次喷洒后长势良好，叶片肥嫩，增产35％；玉米幼苗在3片眞叶时喷洒，10天后，平均株高比对照组玉米幼苗高9厘米左右，产量高出17％；西红柿幼苗喷施后，提前一周开花，座果率提高10％，果实提前一周上市。茶树喷施后，侧芽大量萌发，增加芽茶的采收次数，茶叶不长小叶螨。增加了茶农的收入，减少了农药的使用，降低了生产成本；桑树每25天喷一次，桑葚肥大甜美，桑叶产量增加15％；花椒嫩枝条易长蚜虫、叶片不能正常展开的，在喷施本多肽G1制品的一周左右，蚜虫绝大多数消失，叶片恢复生长；大棚里的蔬菜(黄瓜草莓)在喷施本品后，红蜘蛛明显减少,降低了病毒病的发生几率，长势好，增产。

6.2植物灌根：采用灌根效果明显，使用浓度为将多肽G1生物制品稀释500倍的溶液。苹果经灌根后生长速度提高20％，不长蚜虫，叶片大而厚，枝叶繁茂，开花期提前，座果率提高，苹果自然风味增加；大枣灌根后座果率增加，裂果减少，果实品质大幅度提高；柑橘树灌根后，控制了炭疽病的继续蔓延，产量没有受到影响；葡萄的整个生长期，灌根3-5次，葡萄生长繁茂，提高产量和果实的品质。

6.3浸种拌种:以本多肽G1生物制品500倍稀释液白天浸种4-6小时，沥干过夜，第二天播种。种子出苗整齐、根粗苗壮，抗病能力显著增加。例如玉米种子经多肽G1浸种，出芽率高达93％，而对照组的出芽率只有76％。打瓜种子经多肽G1浸种，出芽率高达100％，而对照组的出芽率只有88％。

6.4植物抗干旱：将玉米种子发芽长出3片真叶，喷洒多肽G1生物制品500倍稀释液，2周后停止浇水。一周后对照组的植株萎蔫而实验组植株正常。继续停止浇水，待两组都发生萎蔫后，恢复浇水，实验组大部分植株很快由萎蔫恢复正常生长，而对照组全部倒苗。表明该多肽G1制品抗干旱效果明显。

6.5植物抗病毒：烟草幼苗喷洒多肽G1生物制品500倍稀释液。95％以上植株没感染花叶病毒，而对照组只有45％没感染花叶病毒。

6.6提高植物抗逆性：植物喷施本多肽G1生物制品500倍稀释液后，对不良环境的抵抗能力显著增强。例如喷施本多肽G1生物制品500倍稀释液的小麦遭遇干热风后，产量非但没有减少反而增产10％；西瓜苗受到早春霜冻，喷施多肽G1生物制品500倍稀释液的苗恢复快，无需补苗，产量不受影响。说明多肽G1生物制品对提高植物的抗逆性有着良好的作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 蔡淑

<120> 人工设计结构密码子优化及化学合成基因rdh及其表达产物多肽G1的制备和应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgggtgcgc cagtcaagat tgcgattaaa gccggtggaa atggtggttt atttccctct 60

cagtcaagtc agaacggtgg gtctccgtca caatctgcat ttggaggaca gcgttctaat 120

attgctgagc agttatctga cataatgacc accatgatgt tcatgggtag tttagtttct 180

cgcggtatga gtggtggtct gggtggctta ttaggaggcg gtctgggtgg ttctggtctg 240

ggctcagccc tgggtggtgg cttaggcggt gctctgggcg ccggtatgaa cgcaatgaat 300

ccttcagcca tgatgggttc tttactgttt agtgccctga aacacgtact gggagggtct 360

gtaactaagc agcagggcgg tctgtttggc aataagcaac cttctagtac tcaagtcagt 420

gcatataccc agggagttaa tgacgcactg agtgcaatcc tgggtaacgg tctgtcacaa 480

accaaagggc agacctcacc gctgcaactg ggacaccatc gtgtcgaggg actgagtggt 540

gcgggagcct ttaatcaact gggcagtacg ctgggtatgt ctgtaggcca gaaagcgggc 600

ctgcaagagc tgaataatat tagtgcgcat catgagggca ccacccgtta tttcgtggac 660

aaagaagatc gcggcatggc caaagaaata gggcagttta tggatcagaa tacacagttc 720

ttcggcaagg cagaatatca gaaggacaac tggcagacag ctaaacagga agacaagtca 780

tgggctaagg cgctgtctaa acctatgacc actgtgggac cgcgcgcaag tatggacaag 840

tttatgaagg cagtcggcat gattaagagc gctatacgcg gtgacacagg aaataccaat 900

ctgagcgcac gtggtaatgg tggcgcatct ctgggagtgc atactacgat gattggtgat 960

cgcattgtta atatgggtct gaagaaactg tcttcataa999

<210> 2

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工合成基因的表达产物

<400> 2

M G A P V K I A I K A G G N G G L F P S

1 1020

Q S S Q N G G S P S Q S A F G G Q R S N

213040

I A E Q L S D I M T T M M F M G S L V S

415060

R G M S G G L G G L L G G G L G G S G L

617080

G S A L G G G L G G A L G A G M N A M N

8190100

P S A M M G S L L F S A L K H V L G G S

101 110 120

V T K Q Q G G L F G N K Q P S S T Q V S

121 130 140

A Y T Q G V N D A L S A I L G N G L S Q

141 150 160

T K G Q T S P L Q L G H H R V E G L S G

161 170 180

A G A F N Q L G S T L G M S V G Q K A G

181 190 200

L Q E L N N I S A H H E G T T R Y F V D

201 210 220

K E D R G M A K E I G Q F M D Q N T Q F

221 230 240

F G K A E Y Q K D N W Q T A K Q E D K S

241 250 260

W A K A L S K P D D H S V T K G S M D K

261 270 280

F M K A V G M I K S A I R G D T G N T N

281 290 300

L S A R G N G G A S L G V H T T M I G D

301 310 320

R I V N M G L K K L S S

321 330