酚氧类氮氧化物作为去乙酰化酶抑制剂的抗肿瘤应用

摘要

本发明公开了酚氧类酚氧类氮氧化物作为去乙酰化酶抑制剂的抗肿瘤应用，该类化合物结构通式如式(Ⅰ)，该类化合物对HDAC有潜在抑制剂效果；因此，可进一步对ZBG提供更多的氮氧、linker进行多个长度的考察等在现有的基础上进行结构修饰，以期发现对HDAC亚型具有良好选择性的抑制剂及其他靶点的作用。本发明合成原料相对便宜、工艺简洁，纯度较高、成本较低，所用试剂都较为安全。有望成为选择性强、高效低毒的新型HDAC抑制剂类抗肿瘤药物。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及酚氧类氮氧化物作为新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂的制备、用途及其衍生物，包含此化合物的药物组合物，涉及所述化合物的制备方法及所述化合物的抗肿瘤应用，涉及所述化合物在疾病，例如抗肿瘤细胞的应用。

背景技术

HDAC抑制剂已经在临床上用于治疗肿瘤疾病，并表现出良好的临床应用前景。HDAC抑制剂对肿瘤细胞的生理功能可以产生多种影响，如抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞周期阻滞，诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤新血管的生成等。HDAC 抑制剂在作用机制上既区别于传统细胞毒类药物，也不同于典型的靶向药物。此外HDAC抑制剂作用于对其他药物产生耐药性的肿瘤细胞时仍然具有较好的抑制活性。HDAC抑制剂既可以单独用于治疗肿瘤疾病，也可以与很多其他作用机制的抗肿瘤药物联合使用，都表现出显著的抗肿瘤作用。HDAC抑制剂作为一类新型的抗肿瘤药物具有重要的研发价值。

目前，HDAC抑制剂主要分为五类：异羟肟酸(hydroxam ic acid)类，如 SAHA、环氧酮结构的环四肽类如trapoxin A、苯甲酰胺(b enzam ides)类，如M S-275、不含环氧酮结构的环肽类、短链和芳香脂肪酸类，如丁酸钠、苯丁酸钠、杂环化合物类，如depudecin。其中已经上市的HDAC抑制剂包Vorinostat(SAHA, Zolina)、romidepsin(Istodax,FK228,FR901228，depsipeptide、belinostat (Beleodaq,PXD-101)、Panobinostat(LBH-589，Farydak)、西达本胺(Chidamide)。根据已经上市的HDAC抑制剂的结构特点，其主要包含锌离子鳌合部分(ZBG)、连接部分(Linker)和表面部分(Surface Recognition，Cap)三个部分。ZBG部分与活性口袋底部的锌离子进行配位，通常为异羟肟酸、苯甲酞胺、梭酸或亲电酮等。 Linker主要占据疏水管状通道，以保证其他两部分的正确取向，通常为链状烷烃、肉桂酞基、芳香基或杂环芳香基等。Cap与结合口袋入口处的氨基酸残基紧密接触，产生相互作用。以SAHA为例，其结构如图3所示.

随着分子生物学研究的不断深入，HDAC抑制剂的抗肿瘤作用机制逐渐被揭示，但仍然存在HDACs对别的分子靶标是否有作用，对HDACs亚型具有选择性的HDAC抑制剂，提高HDAC抑制剂的体内稳定性等问题。因此设计合成酚氧类氮氧化物作为新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂，以已经上市的结构特点为基础，对ZBG、Linker部分进行修饰以期发现对HDAC亚型具有选择性的HDAC 抑制剂以及对别的分子靶标的相互作用等。选择抗肿瘤活性的化合物进一步的进行HDAC亚型的选择以及其他分子靶标的相互作用。因此，根据羟肟酸类化合物的结构特点进行修饰，主要是ZBG部分换为酚类氮氧化合物作为一类新的 HDAC抑制剂，以期发现对HDAC亚型具有良好选择性的化合物，为HDAC抑制剂的后续靶向药物开发提供重要理论依据，从而开发出药效更好，特异性更强、选择性更好的HDAC抑制剂。

发明内容

本发明的目的是通过酚氧类氮氧化物作为新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂，来寻找对HDAC亚型具有良好的选择性的抑制剂。本发明实现该目的的技术方案是提供酚氧类氮氧化物作为新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂及药物组合的制备方法和应用，解决HDAC抑制剂对HDAC亚型选择性等问题。

为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：本发明的酚氧类氮氧化物作为新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂，该化合物的结构通式如下：

其中：n可为1-14个碳；可为不饱和键。

R：为羟基；

R₁：可为H及酚氧类化合物；

R₂、R₃:取代基可以为卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、1-4个碳原子的烷基、1-4个碳原子的烷氧基、1-4个碳原子的烷氨基、1-4个碳原子的氨烷基、2-4>

R₄、R₅、R₆、R₇、R₈：可以同时有1-4个取代基；当其中之一为卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、磺酰基、烷氧基、酰基、2-4个碳原子的酰基、2-4个碳原子的酰胺基、1-4个碳原子的硫代烷基、1-4个碳原子的全氟烷基、1-4个碳原子的氟烷氧基、1-4个碳原子的羧基、1-4个碳原子的烷氧基羧基时；其余分别为卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、磺酰基、烷氧基、酰基、2-4个碳原子的酰基、2-4个碳原子的酰胺基、1-4个碳原子的硫代烷基、1-4个碳原子的全氟烷基、1-4个碳原子的氟烷氧基、1-4个碳原子的羧基、1-4个碳原子的烷氧基羧基；其中R₄、R₅、R₆、R₇、R₈也可以为苯环或杂环；

其中，本发明所述的杂环，是指含一个或多个杂原子(包括氮、氧、硫)的饱和或不饱和杂环，如四氢吡啶、二氢吡诺、二氢吡唑、哌啶、咪唑、吡啶等；

本发明所述的卤素，为氟、氯、溴、碘；

本发明所述的1-4个碳原子的烷基，包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基等；

本发明的酚氧类氮氧化物作为新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂的合成方法的合成路线如下：

合成路线1：

合成路线2：

合成路线3：

合成路线4：

本发明制得的酚氧类氮氧化物作为新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂对人肺癌细胞(A549),人乳腺癌细胞(MCF7)等多种肿瘤细胞生长抑制均较好，可应用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

附图说明

图1是HDAC抑制剂的筛选示意图；

图2是胰酶抑制剂的筛选示意图；

图3是SAHA结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明。

1.化合物Y-1的合成：

取100mL茄型瓶烘干，称取对羟基苯甲酸(1160mg，8.40mmol)，加入四氢呋喃(THF，10mL)溶解，搅拌，冰浴下加入苯胺(PhNH₂，1mL)和二氯亚砜>2,0.874mL)0.5h后，置于常温反应26h，反应完毕，浓缩，硅胶柱用二氯甲烷：甲醇＝60:1,50:1,40:1梯度洗脱分离得白色粉末Y-1>1H-NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm):7.80-7.77(m,2H)7.61-7.59(d,2H,J＝8Hz)>13C-NMR(300Hz,>

2.化合物Y-2的合成：

取上述所得Y-1(300mg，1.41mmol)加入乙醇(EtOH，10mL)溶解，搅拌，加入二甲胺(Me₂NH，0.2mL)和甲醛(HCHO,0.09mL)，油浴78℃回流反应4天，反应完毕，将茄型瓶置于室温，浓缩，硅胶柱用洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝100:1，60:1，30:1梯度洗脱分离得白色粉末Y-2>1H-NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm):7.86(s,1H)7.67-7.54(m,4H)7.37-7.26(m,>13C-NMR(300Hz,DMSO)δ(ppm):164.76,161.30,136.64,128.54,127.40,122.31,>

3.化合物Y-3的合成：

取上述所得Y-2(31mg，0.11mmol)加入碳酸钾(K₂CO₃，32.6mg)，用四氢呋喃(THF，5mL)溶解，搅拌，冰浴下缓慢滴加用TFH溶解的间氯过氧苯甲酸(mCPBA，25mg)，继续反应40min，反应完毕，将茄型瓶置于室温，浓缩，硅胶柱用洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝30:1，20:1，10:1梯度洗脱分离得白色粉末Y-3>1H-NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm):7.88-7.84(m,1H)>13C-NMR(300Hz,DMSO)δ(ppm)165.89,165.23,139.61,133.44,130.77,128.64,123.25,122.27,120.27,118.66,117.39,71.58,56.98,55.00。

4.化合物Y-4的合成

取100mL茄型瓶烘干，称取对羟基苯乙酸(1000mg,6.57mmol)，加入四氢呋喃(THF，10mL)溶解，搅拌，冰浴下加入苯胺(PhNH₂，0.9mL)和二氯亚砜(SOCl₂，0.794mL)反应0.5h后，置于常温反应26h，反应完毕，浓缩，硅胶柱用洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝1:0，60:1梯度洗脱分离得白色粉末Y-4>1H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):7.40-7.38(d,2H,J＝8Hz)>13C-NMR(300Hz,CDCl₃)δ(ppm):169.70,155.26,137.41,130.91,130.47,128.95,126.15,124.54,119.79,116.16,115.43,52.08,43.90,40.24。

5.化合物Y-5的合成：

取上述所得Y-4(200mg，0.70mmol)加入乙醇(10mL)溶解，搅拌，加入二甲胺(Me₂NH，0.146mL)和甲醛(HCHO，0.108mL)，回流反应4天，反应完毕，将茄型瓶置于室温，浓缩，硅胶柱用洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝60:1，40:1，20:>1H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):7.42-7.40(d,2H,J＝8Hz)7.30-7.26(m,3H)>13C-NMR(300Hz,CDCl₃)δ(ppm)169.71,157.66,137.59,129.91,129.56,128.93,>

6.化合物Y-6的合成：

取Y-5(50mg，0.17mmol)加入碳酸钾(K₂CO₃，62mg),用四氢呋喃(THF，10mL)溶解，搅拌，冰浴下缓慢滴加用THF溶解的间氯过氧苯甲酸(mCPBA，>1H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):7.53-7.51(m,1H)7.43-7.41m,1H)>13C-NMR(300Hz,CDCl₃)δ(ppm):165.43,161.85,138.14,129.02,128.36,127.42,>

7.化合物Y-7的合成：

取100mL茄型瓶烘干，称取对羟基苯丙酸(1010mg,6.08mmol)，加入四氢呋喃(THF，10mL)溶解，搅拌，冰浴下加入苯胺(PhNH₂，1.6mL)和二氯亚砜(SOCl₂，1.45mL)，0.5h后，常温反应10h，反应完毕，浓缩，硅胶柱用洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1，8:1，5:1梯度洗脱分离得白色粉末Y-7>1H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):7.52(m,2H)7.24-7.2(m,2H)>13C-NMR(300Hz,CDCl₃)δ(ppm):170.55,155.49,139.28,131.21,129.12,128.69,>

8.化合物Y-8的合成：

取上述所得Y-7(300mg,1.24mmol)加入乙醇(10mL)溶解，搅拌，加入二甲胺(Me₂NH，0.2mL)和甲醛(HCHO，0.09mL)回流反应4天，反应完毕，将茄型瓶置于室温，浓缩，硅胶柱用洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝100:1，60:1， 30:1梯度洗脱分离得白色粉末Y-8>1H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):7.60-7.58(d,2H,J＝8Hz)7.32-7.28(m,2H)7.05-6.97(m,3H)6.67-6.65(d,1H,J＝8Hz)3.55-3.51(s,2H)2.82-2.78(m,2H)>13C-NMR(300Hz,CDCl₃)δ(ppm)170.57,>

9.化合物Y-9的合成：

取上述所得Y-8(40mg，0.15mmol)加入碳酸钾(K₂CO₃，30mg),用四氢呋喃(THF，5mL)溶解，搅拌，冰浴下缓慢滴加用四氢呋喃溶解的间氯过氧苯甲酸(mCPBA，23mg)，继续反应1h，反应完毕，将茄型瓶置于室温，浓缩，硅胶柱用洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝50:1，30:1，20:1梯度洗脱分离得白色粉末>1H-NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm):7.61(s,1H)7.49-7.43>13C-NMR(300Hz,DMSO)δ(ppm):170.74,158.38,137.84,132.70,131.82,130.50,128.93,124.18,119.63,118.87,117.05,72.99,57.62,39.90,30.61。

10.化合物Y-10的合成：

取上述所得Y-7(300mg，1.24mmol)加入乙醇(10mL)溶解，搅拌，加入二甲胺(Me₂NH，0.4mL)和甲醛(HCHO，0.18mL)，回流反应2天，继续加入二甲胺(Me₂NH，0.4mL)甲醛(HCHO，0.18mL)反应2天，反应完毕，将茄型瓶置于室温，浓缩，硅胶柱用洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝100:1，50:1，25:1，>1H-NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm):7.52-7.50(m,2H)7.27-7.07(m,3H)7.07-7.04(s,>13C-NMR(300Hz,DMSO)δ>

11.化合物Y-11的合成：

取上述所得Y-10(27mg，0.76mmol)加入碳酸钾(K₂CO₃,338mg),用四氢呋喃(THF，5mL)溶解，搅拌，冰浴下缓慢滴加用THF溶解的间氯过氧苯甲酸(mCPBA，36.6mg)继续反应1h，反应完毕，将茄型瓶置于室温，浓缩，硅胶柱用洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝60:1，30:1，10:1，5:1，2:1梯度洗脱分离得白色粉末Y-11>1H-NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm):8.36(s,1H)>13C-NMR(300Hz,DMSO)δ(ppm):170.61,>

12.化合物Y-12的合成：

取苯酚(510mg，5.41mmol)加入乙醇(10mL)溶解，搅拌，加入二甲胺 (Me₂NH，0.7mL)和甲醛(HCHO，0.2mL)常温反应4天，反应完毕，浓缩，硅胶柱用洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝1:0，50:1梯度洗脱分离得Y-12>1H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):7.17-7.13(d,1H)>13C-NMR(300Hz,CDCl₃)δ(ppm):158.19,128.89,128.48,122.08,>

13.化合物Y-13的合成：

取Y-12(50mg，0.33mmol)加入碳酸钾(K₂CO₃，101mg)，用四氢呋喃>1H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):7.30-7.26(m,1H)6.99-6.96(d,2H)>13C-NMR(300Hz,CDCl₃)δ(ppm):160.33,132.23,132.04,118.95,118.21,117.20,93.58,58.00,53.43,29.68。

14.化合物Y-14的合成：

取N,N-二甲基苄胺(0.1mL)，加入碳酸钾(K₂CO₃，112mg)，用四氢呋喃>1H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):8.09-7.98(d,3H,J＝8Hz)>13C-NMR(300Hz,CDCl₃)δ(ppm):135.62,130.05,129.81,127.75,60.86,41.88。

本发明化合物抗肿瘤活性的实验方法与结果如下：

(1)组蛋白去乙酰化酶为靶标的氮氧化合物的抗肿瘤试剂对组蛋白去乙酰化酶活性的测定,采用荧光方法检测：

培养A549细胞，从中提取核蛋白，获取含HDAC的活性生物样本，进行活性测试；

实验方法：

HDAC抑制剂的筛选

在EP管中加入反应体系需要的溶液(两控制组也要加入相应的DMSO)，最后加核提取物37℃孵育1h,(第一个样品加入后间隔30s，再加入第二个样品中)，反应完成后，30s取一个插冰上，再加入2×胰酶继续孵育1h，反应完成后， 30s取一个插冰上，再取120ul加入96孔板中，360nm,460nm处测荧光。部分数据见图1。

从实验结果中可以看出Y-3、Y-6、Y-9、Y-11分别比Y-2、Y-5、Y-8、Y-10 的抑制效果好，说明经过氧化后的化合物比未经氧化的化合物的抑制剂效果作用强，通过Y-3、Y-6、Y-9、Y-11的荧光强度比较说明linker的长短对化合物的有较大的影响，linker相对较长抑制效果相对明显。其中部分化合物有明显的抑制剂作用，可能潜在的HDAC抑制剂。由于本实验涉及两步反应，不确定是抑制了HDAC还是胰酶，所以，下一步针对是否是胰酶的方面的原因，进行了胰酶抑制筛选的实验。

胰酶抑制剂的筛选：

在EP管中加入反应体系需要的溶液(两控制组也要加入相应的DMSO)，胰酶50ul(不加蛋白组加50ul水)，37℃孵育1h(第一个样品加入后间隔30s，再加入第二个样品中)，反应完成后，30s取一个插冰上,再取120ul加入96孔板中，在360nm,460nm处使用酶标仪检测荧光。部分数据见图2。

根据如图结果所示，虽然胰酶对该批药物有轻微抑制作用，但是经过图1图2对比可知该批药物对HDAC有抑制作用。

(2)氮氧化物作为新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂的细胞活性测试

采用公认的可用于大规模抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验测定的四甲基氮唑蓝比色法(MTT)评价目标化合物对5种人癌细胞株的抗增殖活性。阳性对照药为临床上广泛使用的抗肿瘤药物阿霉素(ADR)及Vorinostat(SAHA)。

细胞株：人肺癌细胞A549,人乳腺癌细胞MCF7，人肝癌细胞Hep G2，人结肠癌细胞SW480，脑胶质瘤细胞U87，宫颈癌细胞Hela。

细胞增殖抑制率＝(阴性对照组OD值—药物组OD值)*100％/阴性对照组 OD值。

表1为本发明化合物对肿瘤细胞增殖的抑制率％(100μmol/L)

部分实验测试结果如表1：

*：SAHA的浓度为10μmol/L；其余化合物浓度为100μmol/L。

由实验数据可知所有化合物与阳性SAHA对照，所有的化合物的抑制剂率都相对较低，其中Y-6、Y-8、Y-9、Y-10、Y-11对A549、MCF7、Hep G2、U87、 Hela肿瘤细胞抑制效率较其他化合物相对较好；Y-2、Y-5、Y-8、Y-10分别与 Y-3、Y-6、Y-9、Y-11相比抑制剂率相对偏低，说明氧化后的化合物相对未氧化的化合物抑制剂率较好；Y-3、Y-6、Y-9、Y-11、Y-13、Y-14的抑制率相比，说明linker的长短影响化合物的抑制剂率。故，该类化合物具有较大的发展潜力。进一步考察linker部分的长短及结构修饰，有望能得到活性较好的化合物。

综上所述，本发明的优点在于：本发明提供了一种酚氧类氮氧化合物作为新型HDAC抑制剂的抗肿瘤应用及其制备方法，根据活性测试实验数据显示：该类化合物对HDAC有潜在抑制剂效果；因此，可进一步对ZBG提供更多的氮氧、linker进行多个长度的考察等在现有的基础上进行结构修饰，以期发现对 HDAC亚型具有良好选择性的抑制剂及其他靶点的作用。本发明合成原料相对便宜、工艺简洁，纯度较高、成本较低，所用试剂都较为安全。有望成为选择性强、高效低毒的新型HDAC抑制剂类抗肿瘤药物。

当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。