一种诱导巴蜀报春无菌苗快速繁殖的方法

摘要

本发明公开了一种诱导巴蜀报春无菌苗快速繁殖的方法，包括以下步骤：1）外植体的采集及预处理：将从野外采集回来的巴蜀报春幼苗进行修整，把不需要的部分去掉，取生长状况良好的叶片、叶柄、茎尖以及根做为外植体，自来水冲洗30min，用干净的滤纸将水分吸干；2）外植体的消毒：用10%NaClO消毒10min，期间搅拌，无菌水冲洗3‑4遍，将无菌水倒干净，备用；3）接种：用经过高温高压灭菌的镊子夹取将灭菌完的外植体接种到MS+0.6mg/L KT+0.1mg/L 2,4‑D+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉培养基上，培养于14h/d光照，温度22℃培养室中。本发明通过组织培养的方法对其进行繁殖，解决了巴蜀报春依靠其种子自然萌发来繁殖后代的方式效率很低的问题。

说明书

技术领域

本发明属于植物脱毒与组织培养快繁技术领域，具体地涉及一种诱导巴蜀报春无菌苗快速繁殖的方法。

背景技术

巴蜀报春（Primula>）,是报春花科报春花属多年生草本植物。是一种重要的观赏花卉，其繁殖方式主要依靠种子繁殖，也可以用分株法进行繁殖。但其种子的寿命很短，发芽力丧失快，例如春天采收的种子在秋天播种，发芽率会下降一半，陈种子的发芽率更低，有的甚至不发芽。并且其种子很小，又是喜光发芽的种子，因此依靠其种子自然萌发来繁殖后代的方式效率很低。

近年来，虽然有文献对报春花的组织培养技术进行了研究，但目前为止，对巴蜀报春的相关研究还尚未报道，包括巴蜀报春的组织培养快繁技术。巴蜀报春目前仅在湖北省宜昌市有发现，其他地区未见有报道，而且对其研究的文献暂时也没有。由于其种子繁殖率低，现已被列入濒危保护物种。故我们希望可以通过组织培养的方式可以实现其快速繁殖的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诱导巴蜀报春无菌苗快速繁殖的方法，以解决巴蜀报春依靠其种子自然萌发来繁殖后代的方式效率很低的问题。

本发明的目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：一种诱导巴蜀报春无菌苗快速繁殖的方法，其操作流程包括以下步骤：

1）外植体的采集及预处理：将从野外采集回来的巴蜀报春幼苗进行修整，把不需要的部分去掉，取生长状况良好的叶片、叶柄、茎尖以及根做为外植体，自来水冲洗30min，用干净的滤纸将水分吸干；

2）外植体的消毒：用10%NaClO消毒10min，期间搅拌，无菌水冲洗3-4遍，将无菌水倒干净，备用；

3）接种：用经过高温高压灭菌的镊子夹取将灭菌完的外植体接种到MS+0.6mg/L KT+0.1mg/L 2,4-D +30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉培养基上，培养于14h/d光照，温度22℃培养室中。

上述的步骤1）采用野生巴蜀报春的茎尖为最佳外植体。

上述的步骤3）用经过高温高压灭菌的镊子夹取已经过灭菌处理的外植体。

上述的步骤3）培养基PH为5.8。

上述的步骤3）20Day后可以肉眼可见长出无菌苗。

本发明与现有技术相比具有明显的优点和优异效果。由以上技术方案可知，本发明通过组织培养的方法对其进行繁殖，以解决巴蜀报春依靠其种子自然萌发来繁殖后代的方式效率很低的问题，为对巴蜀报春的研究奠定基础，可以弥补这一物种在对报春花科的研究中的空缺，具有一定的经济效益和社会效益。

具体实施方式

以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种诱导巴蜀报春无菌苗快速繁殖的方法具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。

一种诱导巴蜀报春无菌苗快速繁殖的方法，其操作流程包括以下步骤：

1）外植体的采集及预处理：将从野外采集回来的巴蜀报春幼苗进行修整，把不需要的部分去掉，取生长状况良好的叶片、叶柄、茎尖以及根做为外植体，自来水冲洗30min，用干净的滤纸将水分吸干；

2）外植体的消毒：用10%NaClO消毒10min，期间搅拌，无菌水冲洗3-4遍，将无菌水倒干净，备用；

3）接种：用经过高温高压灭菌的镊子夹取将灭菌完的外植体接种到MS+0.6mg/L KT+0.1mg/L 2,4-D +30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉培养基上，培养于14h/d光照，温度22℃培养室中。

上述的步骤1）采用野生巴蜀报春的茎尖为最佳外植体。

上述的步骤3）用经过高温高压灭菌的镊子夹取已经过灭菌处理的外植体。

上述的步骤3）培养基PH为5.8。

上述的步骤3）20Day后可以肉眼可见长出无菌苗。

上述方法和参数是通过以下实验优选最佳方案得出的：

1.1.实验材料

贵州省施秉县云台山采取野生巴蜀报春幼苗。

1.2.材料预处理

茎尖、叶片，叶柄、根分开诱导，用流动自来水小水流冲洗30min，备用。

1.3.外植体的消毒

植物组织培养用的外植体大部分取自田间，表面上附着大量的微生物，这是组织培养的一大障碍。因此在材料接种培养前必须要消毒处理，消毒一方面要求把材料表面上的各种微生物杀灭，同时又不能损伤或只轻微损伤组织材料而不影响其生长。因此，外植体的消毒处理是植物组织培养工作中的重要一环。

1.3.1.常用的消毒剂

常用的消毒剂如下所示。理想的消毒剂应具有消毒效果好，易被无菌水冲洗掉或能自行分解，对材料损伤小，对人体及其他生物无害，来源广泛，价格低廉。

常用消毒剂的使用方法及效果

①酒精

酒精是最常用的表面消毒剂，以70%-75%酒精杀菌效果最好，95%或无水酒精会使菌体表面蛋白质快速脱水凝固，形成一层干燥膜，阻止了酒精的继续渗入，杀菌效果大大降低。

酒精具有较强的穿透力，使菌体蛋白质变性，杀菌效果好。同时它还具有较强的湿润作用，可排除材料上的空气，利于其他消毒剂的渗入。但酒精对植物材料的杀伤作用也很大，浸泡时间过长，植物材料的生长将会受到影响，甚至被酒精杀死，使用时应严格控制时间。但酒精不能彻底消毒，一般不单独使用，多与其他消毒剂配合使用。

②升汞

又称氯化汞，Hg²⁺可以与带负电荷的蛋白质结合，使蛋白质变性，从而杀死菌体。升汞的消毒效果极佳，但易在植物材料上残留，消毒后需用无菌水反复多次冲洗。升汞对环境危害大，对人畜的毒性极强，使用后应做好回收工作。

③次氯酸钠

次氯酸钠是一种较好的消毒剂，它可以释放出活性氯离子，从而杀死菌体。其消毒能力很强，不易残留，对环境无害。但次氯酸钠溶液碱性很强，对植物材料也有一定的破坏作用。

④漂白粉

漂白粉的有效成分是次氯酸钙[Ca(ClO)₂]，消毒效果很好，对环境无害。它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封保藏。

⑤过氧化氢

也称双氧水，消毒效果好，易清除，又不会损伤外植体，常用于叶片的消毒。

⑥新洁尔灭

这是一种广普表面活性消毒剂，对绝大多数植物外植体伤害很小，杀菌效果好。

1.3.2.最佳消毒方法的筛选

在本次发明中选择0.1%升汞、10%NaClO以及70%酒精三种灭菌剂，分别设定不同的灭菌时间，以便筛选巴蜀报春外植体最适宜的灭菌方式，具体实验方案见表1。

巴蜀报春外植体分别采用以上12种方式进行灭菌处理，其他因素皆相同。

1.4.巴蜀报春培养基的选择

1.4.1.6-BA、NAA激素配比的选择

以MS培养基作为基本培养基，选择6-BA、NAA两种植物生长调节剂，分别设定7个不同浓度水平进行试验以筛选巴蜀报春外植体最适宜诱导无菌苗的培养基，详细实验方案见表2。

1.4.2.KT、2,4-D激素配比的选择

以MS培养基作为基本培养基，选择KT、2,4-D两种植物生长调节剂，分别设定不同浓度水平进行试验以筛选巴蜀报春外植体最适宜诱导无菌苗的培养基，详细实验方案见表3。

1.1.5 巴蜀报春接种：

接种时，要穿好工作衣，戴好工作帽和口罩，不准说话或对着植物材料或培养容器口呼吸。打开包塞纸和瓶塞、瓶盖时注意不要污染瓶口。在近酒精灯火焰处打开培养瓶瓶口，并使培养瓶倾斜，以免微生物落入瓶内。瓶口可以在拔塞、开盖前灼烧灭菌，接种工作宜在近火焰处进行。手不能接触接种器械的前半部分（即直接切割、触碰植物材料的部分），接种操作时（包括拧开或拧上培养瓶盖时），培养瓶、试管或三角瓶宜水平放置或倾斜一定角度（45度以下），避免直立放置而增大污染机会。手和手臂应避免在培养基、植物材料、接种器械上方经过。已消毒的植物材料接种时不慎掉在超净工作台上，不宜再用。接种期间如遇停电等事件使超净工作台停止运转，重新启动时应对接种器械及暴露的植物材料重新消毒。

将接种好的材料放入培养室中，其中14h/10h光照，22℃培养，每隔三天拍照记录。约20天后长出无菌苗。

1.6.实验结果与分析

接种5Day后统计12种灭菌方式的染菌率，具体实验结果见表4。

用10%NaClO消毒10min，污染率最低，虽然0.1%升汞灭菌效果较好，但由于其毒性较大，对外植体的损伤较大，故采用10%NaClO消毒10min的方式对巴蜀报春外植体进行灭菌。

接种20Day后，统计不同外植体的出苗情况，具体实验结果见表5。

以上实验结果证明，巴蜀报春最适宜的外植体为茎尖。

接种20Day后，统计各种培养基中巴蜀报春的出苗情况，具体实验结果见表6-1、表6-2、表7-1和表7-2。

通过以上实验结果证明诱导巴蜀报春无菌苗最适宜的培养基为MS+0.6mg/LKT+0.1mg/L 2 ,4-D+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，PH为5.8。

本发明建立了巴蜀报春脱毒培养的技术体系，为大规模生产无病毒种苗，为巴蜀报春的繁殖提供了一种可行的方式，为弥补巴蜀报春在报春花科研究中的空白奠定了基础。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变换材质、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

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