一套同时检测93种牛遗传缺陷基因和致死单倍型的引物组合及试剂盒

摘要

本发明公开了一套同时检测93种牛遗传缺陷基因和致死单倍型的引物组合及试剂盒。通过该套引物和试剂盒，可以一次性检测93种遗传缺陷基因(例如PIRM综合征、弯曲尾综合征、大疱性表皮松解症等)的因果突变位点(SNP、短片段的插入或缺失)及致死单倍型(HH1、HH3、HH4、HH5、JH1)，筛选出具有单基因遗传缺陷基因的携带者及致死单倍型携带者的牛，从而为种牛的选育和遗传评估、牛群的选种选配、群体遗传改良、新品种培育、遗传资源的保护提供精准的指导。本发明具有高通量、低成本、准确性高等特点，适用于肉牛和奶牛品种，可在牛的育种与繁殖领域广泛应用。

说明书

技术领域

本发明涉及畜牧业技术领域，涉及一种用于确定牛是否携带93种牛遗传缺陷基因和致死单倍型的检测方法，具体而言，即利用DNA提取、PCR多重扩增技术、单碱基延伸技术和飞行质谱技术，对93种遗传缺陷基因和致死单倍型同时进行基因分型，确定该牛是否携带隐性遗传缺陷基因和致死单倍型，涉及牛群隐性遗传缺陷基因和致死单倍型的剔除和个体标注、牛群的选种选配、β-酪蛋白特定型牛奶的奶牛等的筛选方法。

背景技术

迄今，牛已知的遗传缺陷有506种，属于孟德尔遗传的有233种，其中，已知因果突变的有133种(http://omia.angis.org.au/home/)，大多数突变是有害的。一些导致遗传缺陷的单基因的(孟德尔的)突变已经被揭示。由于携带者很容易被鉴定并从育种群排除，显性突变很容易从群体中清除。而针对隐性突变的管理则更加困难，一小部分携带者必然会保存在群体中。根据表型选择(自然选择或人工选择)清除纯合子(缺陷表型)的情况下，携带者的频率将趋近于零，出现遗传缺陷的概率极低。当顶级公牛是遗传缺陷的携带者，缺陷突变就会在群体中保持更高的频率，相关的遗传缺陷就会成为一个严重的问题，对别是对专用的乳用牛品种群体就更加危险，因为他们有着特殊的群体结构，例如，高度近交、更少的奠基者、有效群体大小持续下降、人工授精的广泛使用，这些因素使得现代牛对遗传缺陷更加易感(Pausch et al,2015)。对于隐性有害突变，通过鉴定携带者并从群体中剔除，或者应用有效的选种选配策略抵消有害突变的扩散，使其频率保持在较低的水平。

遗传缺陷可严重影响牛的生产性能和经济价值，基因出现纯合时甚至导致早期死亡，引起重大的经济损失。有的遗传缺陷基因和致死单倍型的携带者就会影响牛生产性能，给养牛业造成重大的经济损失。例如，脊柱畸形综合征(HHC)影响荷斯坦奶牛的乳中的脂肪量，并趾(Mulefoot)携带牛其体细胞评分更高，而且繁殖年限和基因组育种值更低。荷斯坦牛的单倍型0(HH0)携带者与脂肪和青母牛的受胎率有关，荷斯坦致死单倍型1(HH1)与产奶量、脂肪、蛋白、体细胞评分、单性状繁殖年限和繁殖力有关，荷斯坦牛致死单倍型2(HH2)与蛋白、繁殖年限、青年牛受胎率、母牛受胎率有关，荷斯坦牛致死单倍型4(HH4)与产奶、蛋白和繁殖力有关，荷斯坦单倍型5与蛋白量、女儿妊娠率有关。娟姗牛单倍型1(JH1)与表型效应无关，但脂肪、蛋白、繁殖年限、女儿妊娠率、成母牛受胎率和青年母牛受胎率的基因组育种值存在显著差异；娟姗牛单倍型2(JH2)仅与更低的成母牛受胎率有关，在美国奶牛群体中(约存栏900万头)，每年因遗传缺陷导致的繁殖力下降和犊牛早期死亡产生的经济损失约为1100万美元，其中，每头牛导致的妊娠损失约为200美元，犊牛早起死亡的损失约为342美元(假设在第21天死亡)，每延长1天，增加2美元的损失，另外，导致犊牛出生后或饲养早期死亡的遗传缺陷，其造成的经济损失尤其严重，因为其经济损失远远大于导致胚胎早期死亡的遗传缺陷。

鉴定遗传缺陷基因的突变携带者，可在育种中制定专门的控制牛的近交和遗传缺陷的选配方案计划，指导选种和计划选配，以降低携带者在群体中的频率，避免携带者交配。我们还可以根据检测结果，筛选出不携带特定遗传缺陷基因的群体。对于像A2型β-酪蛋白基因(β-酪蛋白有A1，A2，A3，B，C，D，E，F，H1，H2，I，G等遗传变体型)，还可以筛选出特定的突变体类型奶牛，组建单一基因或组合基因纯合的奶牛群体，进而培育新的品系、品种。而乳球蛋白AA型具有高的奶产量和乳清蛋白含量，而BB型具有高的酪蛋白和脂肪含量，其BB型更利于制备奶酪产品。除了育种之外，遗传缺陷的信息对于保种工作也有重要的价值，它可以避免携带者交配，特别是一些濒危品种，由于其近交的程度更大，出现遗传缺陷的风险也大(Williams et al,2016)。

携带者特定突变或致死单倍型的鉴定传统是通过个体的实验室检测，例如，SNP标记、微卫星标记、酪蛋白异构体、CVM的特异基因检测来完成，已知的遗传缺陷基因检测一般是针对特定的缺陷基因利用测序、PCR技术等方法来进行检测。这些方法一次一般只能检测单个的缺陷基因、检测的数量少、成本高，而且费事。而低密度的芯片可以一次性检测上百种的遗传缺陷基因型和单倍型型，一次检测的缺陷基因的种类多、成本更低，更加高效、方便和实用。

中国授权发明专利，CN201010225605.2，应用AS-PCR检测牛白细胞粘附缺陷的方法，该发明涉及应用AS-PCR方法在体外检测牛白细胞粘附缺陷的方法，制备了一种针对牛粘附缺陷基因CD18的检测方法的特异性PCR引物用于在体外开展牛粘附缺陷的致病基因的筛选，该发明只能检测单一的遗传缺陷基因。

中国发明申请专利CN201510569964.2，一种筛查荷斯坦奶牛白细胞粘附缺陷病携带者的分子检测方法，该发明提供了一种鉴定荷斯坦牛是否携带BLAD的竞争性等位基因特异性PCR成套引物，该发明利用KASP技术，通过设计一组针对BLAD突变位点的引物，进行反应，经过约1.5小时后通过配套的软件进行简单识别分析，即可准确获得所有待测样品的基因型，从而实现筛查BLAD携带者的目的，该发明只能检测单一的BLAD遗传缺陷基因。

中国发明专利申请CN201610262293.X，一种用于检测奶牛四种遗传病的核酸质谱的检测产品及应用，该发明公开了一种可以同时检测奶牛是否具有脊椎畸形综合症(CVM)、白细胞粘附缺陷症(BLAD)、尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)、瓜氨酸血症(CN)四种遗传病的引物系统，基于该引物系统所制备的产品，只能实现同时对奶牛CVM、BLAD、DUMPS、CN4种遗传病基因相关的4处多态性位点进行检测。

中国授权发明专利，CN200610150317.9，一种检测牛CVM有害基因的方法，该发明提供了一种检测牛脊椎畸形综合症(CVM)携带者的方法，该方法首先设计合成引物对牛的DNA样品进行聚合酶链式反应(PCR)，然后对PCR产物进行单链构象多态性(SSCP)分析，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果判断牛是否携带CVM有害基因，其不足之处是只能检测单一的CVM携带情况，且重复性较差。

中国授权发明专利，CN201310617444.5，一种牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因检测的引物组合物及其试剂盒和应用，该发明公开了一种牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因检测的引物组合物及其试剂盒和应用，该发明的检测的方法为首先提取牛血液中的全组DNA作为模板，进行巢式PCR(NestedPCR)扩增，所得PCR产物进行测序，根据测序结果可直接了解突变位点的碱基变化，其特点是，需要两次扩增、并对产物进行测序，易引入错误，且只能检测的单一缺陷基因。

中国授权发明专利，CN200910272954.7，发明了一种应用AS-PCR检测牛尿苷酸合酶缺乏症的方法，该发明属于动物疾病检测技术领域，具体涉及应用AS-PCR检测牛尿苷酸合酶缺乏症的方法，制备了一种用于牛尿苷酸合酶缺乏症检测方法的特异性PCR引物，在扩增产物的中引入错配碱基，需要应用电泳进行基因分型，由于产物长度较短，易导致错判，且不适合高通量得、大量的牛群检测。

中国授权发明专利CN201110440150.0，公开了一种筛查牛退化性轴突病携带者的方法及其试剂盒，该发明以待测牛的基因组DNA为模板，设计上游引物和下游引物对其进行PCR扩增反应，然后回收PCR扩增片段，用FastDigest限制酶TspRI进行酶切，在酶切反应体系酶切后进行凝胶检测，该筛查方法操作简单、快捷、费用低廉、但同样存在只能检测单一遗传缺陷基因的不足。

目前国内外尚无有关检测其他遗传缺陷基因及致死单倍型方法研究，更没有能同时检测上百种已知牛遗传缺陷基因因果突变的高通量检测方法研究。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明人经过创造性的劳动整合了93种牛遗传缺陷病的因果突变位点(SNP、短片段的插入或缺失)信息，得到了能够用于同时检测牛不同遗传缺陷病的引物组合及其试剂盒。所述引物组合及其试剂盒的特异性强、灵敏度高，能够快速、准确的检测93种牛遗传缺陷病，而且可以一次实验同时检测近百份奶牛样品，具有快速检测、通量高的特点。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

首先，本发明公开了一套同时检测牛93种遗传缺陷101个相关因果突变位点的引物，所述引物分为四组，具体如表1-表4所示。

本发明将检测93种遗传缺陷基因和致死单倍型相关101个因果突变位点所需的引物组合分成4个检测孔中，同时对不同遗传缺陷病进行检测。每个孔(1，2，3，4)所述引物的组合序列如下：

1孔引物组合：用于同时检测牛的PIRM综合征、球形红细胞症、β酪蛋白8、β酪蛋白4、Ⅰ型白细胞粘附缺陷征、契-东综合征、隐性红毛、β酪蛋白9、双肌、β酪蛋白1、先天性鱼鳞病、致死单倍型(HH1)、致死单倍型(HH3)、致死单倍型(HH4)、软骨发育异常侏儒症、脊柱畸形综合征、软骨成长不全、瓜氨酸血症、安格斯牛侏儒症、肠病性肢端皮炎、流产SLC37A2、生长激素缺乏型侏儒症、心肌病及绵状长毛病、伴有炎性病变合乎比例的侏儒症遗传缺陷基因的引物组合。其序列及相关信息如下表1所示：

表1

2孔引物组合：用于同时检测牛的多种眼部缺陷、弯曲尾综合征、α型甘露糖苷贮积症、流产(JH1)、退行性轴突病、雄性不育、β乳球蛋白异常低表达、致死单倍型(HH5)、β酪蛋白11、无汗性外胚层发育不良、黄脂病、乳球蛋白、流产SHBG、围产期弱犊牛综合征、先天性肌张力障碍I型、锌缺乏样综合征、并趾、蛋白多糖型侏儒症、致死性多器官发育不良、显性白与双侧耳聋、三甲基胺尿症、毛少色浅、蜘蛛腿综合征、先天性肌无力、隐性红毛373、β酪蛋白6遗传缺陷基因的引物组合。其序列及相关信息如下表2所示：

表2

3孔引物组合：用于同时检测牛的大疱性表皮松解症、β型甘露糖苷贮积症、脊髓髓鞘形成障碍、血小板紊乱、粘多糖贮积症ⅢB型、无角/有角、隐性红毛EBR、多肢畸形、马凡综合征、隐性红毛358、原卟啉症、β酪蛋白12、甲状腺肿、α型甘露糖苷贮积症、槭糖尿病-H、蛋白多糖型侏儒症、先天性假性肌强直、二类黄嘌呤尿、显性红毛、前肢至腰部肌肉异常、营养不良型大疱性表皮松解症、五型肝醣储积症、脊髓性肌萎缩遗传缺陷基因的引物组合。其序列及相关信息如下表3所示：

表3

4孔引物组合：用于同时检测牛的β酪蛋白3、隐性红毛、先天性假性肌强直、埃莱尔-当洛综合征、浅色少毛症、二型肝醣储积症(庞贝氏症)、A型血友病、β酪蛋白7、牙龈错构瘤型骨硬化病、Kappa酪蛋白、扩张型心肌病、二型肝醣储积症(庞贝氏症)、先天性肌张力障碍Ⅱ型、β酪蛋白2、少毛症、尿苷磷酸合酶缺乏症、F11因子缺乏、β酪蛋白5、皮肤脆裂症遗传缺陷基因引物组合。其序列及相关信息如下表4所示：

表4

本发明的设计思路为：在尽可能全面覆盖牛遗传缺陷基因和致死单倍型基因已知因果突变的前提下，设计一种高效、可应用且成本尽可能低的牛遗传缺陷基因因果突变的高通量检测方法。本发明基于牛不同遗传缺陷病对应的因果突变位点序列信息，经过独特设计和组合优化，获得PCR扩增反应引物和单碱基扩展引物，然后在384孔板上进行PCR反应扩增出待检样本突变位点的目的片段，再用虾碱性磷酸酶对PCR产物进行纯化反应，最后用单碱基扩展引物对PCR纯化的产物在384孔板上进行单碱基延伸反应并进行质谱检测，从而获得突变位点的基因型。

本发明高通量检测引物和分组的设计主要包括三个方面的控制点。

(1)针对牛遗传缺陷基因和致死单倍型的选择，发明人前期对已知因果突变的牛遗传缺陷基因和致死单倍型进行分析，发现针对骨硬化病、短脊椎综合症(HH0)、性腺发育不良、肾发育不良、流产、罗马诺拉肉牛白内障等牛的遗传缺陷病的因果突变位点信息，在评估设计引物设计过程中发现这几种牛遗传缺陷病的因果突变的插入或缺失，导致无法设计引物进行分型鉴定，预实验该6种遗传缺陷的检测引物设计与本发明93种牛遗传缺陷病引物设计整合性极差，经分析该6种遗传缺陷或为大片段的插入或缺失，或检测引物设计兼容性太差(正义链和反义链碱基设计无法满足要求)，相较而言，肌肉肥大(双肌)、心肌病及绵状长毛病、无汗性外胚层发育不良、毛少色浅、蜘蛛腿综合征、先天性肌无力、隐性红毛373、二类黄嘌呤尿、二型肝醣储积症、庞贝氏症、F11因子缺乏、皮肤脆裂症等几种片段的插入或缺失遗传缺陷基因的引物设计可以有效的与本发明多SNP位点多重引物设计整合和兼容。本发明实现了多插入或缺失突变检测结合多SNP检测的引物设计。

(2)对于本发明93种牛遗传缺陷病，总共涉及到101个因果突变位点，主要面临的是极限的整合难度。通常多重PCR结合多重单碱基扩增组合中位点数目越少其相互感染的可能性越低，本发明位点数量较多，因此从101个位点中筛选组合和优化，经初步筛选，每组约25重上下较优，进一步结合多重单碱基扩展引物的考察，初步确定了4孔检测引物的设计目标，并针对缺陷基因进行分组和试错分析；因整合难度大，发明人前期整理其相关位点信息后，发给北京某生物公司利用软件进行引物评估和设计，反馈分析发现，该生物公司能设计出检测87个突变位点的引物组合(另14个位点无法进行整合，包括并趾、三甲基胺尿症、隐性红毛373、粘多糖贮积症ⅢB型、先天性鱼鳞病、锌缺乏样综合征、营养不良型大疱性表皮松解症、牙龈错构瘤型骨硬化病、β酪蛋白3、β酪蛋白11、β酪蛋白12、β型甘露糖苷贮积症、无汗性外胚层发育不良、A型血友病)，而且需要分成5个孔进行检测；在此基础上，发明人进行独特的策略进行的分组和整合(具体分组情况见表1-4)，重新设计出本发明所述覆盖101个因果突变位点的4孔检测引物。

(3)因为涵盖位点多、检测难度大，本发明着重对引物的特异性和检测准确性进行了考察，本发明对多重PCR引物采用AssayDesigner3.1软件设计，通过对合成的引物使用质谱检测分子量以保证扩增准确且无杂质(由于位点太多，本发明对有杂质的引物对进行了剔除)，本发明对软件设计的引物进行检测后，其中试错分析，大部分引物对复合理论分子量，12对存在杂质，2对分子量错误，发明人对其进行再设计和检测，获得多重PCR引物。在此基础上，发明人进一步对单碱基延伸引物进行设计和优化，并反馈调整多重PCR引物对，最终形成了本发明所述引物组(表1-表4)。

其次，本发明公开了包含上述引物组的检测试剂盒。

优选的实施方案中，所述试剂盒还包括PCR扩增反应试剂、碱性磷酸酶处理试剂、单碱基延伸反应。

具体的，PCR扩增反应试剂包括dNTP(25mM each)、MgCl₂(25mM)、HotStar>2O等；

碱性磷酸酶处理试剂包括ddH₂O、虾碱性磷酸酶Buffer、虾碱性磷酸酶(1U/μl)；

单碱基延伸反应包括：iPLEX Bμffer Plus、iPLEX Termination mix、iPLEXEnzyme、ddH₂O。

此外，本发明公开了一种同时检测93种牛遗传缺陷基因的方法，包括如下步骤：

(1)提取牛DNA；优选的实施方式中从牛血液、精液或毛囊中提取DNA；

(2)多重PCR反应：利用利用上述引物和步骤(1)所述DNA进行PCR扩增反应；具体的，利用稀释好的引物和DNA在384孔中进行PCR扩增反应，PCR扩增反应采用5.000μl体系，组成为：1μl DNA(20ng/μl)、1.000μl扩增引物混合物(500nM each)、0.100μl dNTP(25mMeach)、0.325μl MgCl2(25mM)、0.100μl HotStar Taq(5U/μl)、0.625μl PCR Bμffer with15mM MgCl2、1.850μl ddH2O；

优选的实施方案中，PCR扩增反应程序为：先94℃5min；接着94℃20sec，56℃30sec，72℃1min，此步45个循环；最后72℃3min；

(3)产物碱性磷酸酶处理，去除剩余的dNTPs，具体的，上步中每个孔的5.000μlPCR产物各加2.00μl虾碱性磷酸酶处理，去除剩余的dNTPs，

优选的，其中，2.00μl虾碱性磷酸酶处理反应液组成为：1.53μl>2O、0.17μl虾碱性磷酸酶Buffer、0.30μl虾碱性磷酸酶(1U/μl)；

其中，7μl产物碱性磷酸酶处理液反应程序为：37℃20min；85℃5min；4℃∞；

(4)单碱基延伸反应，利用上述引物进行单碱基延伸反应，具体如下：虾碱性磷酸酶处理后的产物，进行单碱基延伸反应，优化的反应体系和程序，如下：

其中，单碱基延伸反应采用9μl反应体系，组成为：7μl产物碱性磷酸酶处理产物、0.200μl iPLEX Bμffer Plus、0.200μl iPLEX Termination mix、0.940μl延伸引物混合物(7μM：14μM)、0.041μl iPLEX Enzyme、0.619μl ddH2O；

其中，单碱基延伸反应的程序为：先94℃30sec；接着94℃5sec，(52℃5sec，80℃5sec，5个循环)，此步40个循环；72℃3min；

(5)单碱基延伸反应后进行树脂纯化反应，具体如下：在384Dimple板中均匀填充树脂并放置10min，在384样本板的每个孔中加16μl水，轻敲Dimple使树脂落入样本板的每个孔中，然后将样本版室温旋转30min。

(6)利用质谱检测及数据输出，具体操作如下：用点样仪将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP芯片上，然后使用MALDI-TOF质谱仪对其分析，结果利用TYPER4.0软件进行数据处理，根据野生和突变位点对应的不同延伸产物分子量的大小，获得突变位点分型信息。

本发明还公共开了一种牛遗传育种的方法，利用上述方法筛选去除遗传缺陷基因纯合和/携带者，配套选种选配技术，优化牛育种。

本发明取得了以下有益效果：

(1)本发明首次针对牛多种遗传缺陷基因及致死单倍型方法研究，首次提出了一种同时检测近百种已知牛遗传缺陷基因因果突变的高通量检测方法。

(2)本发明的检测方法可同时检测93种牛遗传缺陷病101个因果突变位点，且4孔检测即可覆盖101个因果突变位点，本发明一次性检测样品通量高、费用低，而且开发出检测试剂盒，使操作更加简便、快捷。

(3)本发明以经过直接测序鉴定的遗传缺陷病携带者的牛为检测对象，都能够准确地检出牛遗传缺陷病基因型(图1-图2)，表明本发明的引物、反应体系、条件及检测步骤等准确、有效、重复性高、稳定性强，这一发明可以对牛遗传缺陷病进行早期(出生)检测，或者对双亲后代的遗传缺陷情况进行预测，消除有害基因型给养牛业带来的经济损失，能够产生显著的经济和社会效益。

附图说明

图1：脊柱畸形综合征(HHC)直接测序的遗传缺陷携带者的牛和本发明方法的鉴定结果，左图为测序结果，右图为本发明分析结果；

图2：β酪蛋白A1/A2杂合型直接测序的遗传缺陷携带者的牛和本发明方法的鉴定结果，左图为测序结果，右图为本发明分析结果；

图3：牛致死单倍型(HH1)携带者的检测结果

图4：牛隐性红毛373携带者的检测结果

图5：牛致死单倍型(HH5)携带者的检测结果

图6：牛黄脂病携带者的检测结果

图7：牛隐性红毛EBR携带者的检测结果

图8：牛隐性红毛358携带者和纯合突变的检测结果，上图为携带者，下图为纯合突变

图9：牛槭糖尿病纯合突变的检测结果

图10：牛乳球蛋白不同型的检测结果，上图为AA型，中图为AB型，下图为BB型

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：同时检测93种牛遗传缺陷基因的方法构建

1.PCR扩增反应引物设计与条件优化

整理SNP序列信息成标准格式，进行93个因果突变位点(SNP、短片段的插入或缺失)PCR扩增反应引物和单碱基延伸引物的设计，对影响检测反应体系条件和PCR程序条件进行优化，包括试剂浓度、温度、时间、反应循环数等，再进行384孔的PCR反应(93个因果突变位点分成4个PCR孔中同时检测)。PCR扩增反应具体如下：

(1)采用AssayDesigner3.1软件进行每个突变位点序列的引物设计，分析优化试验后的引物，分别用去离子水混合每个孔中检测突变位点所需的PCR引物，使得最终每个孔中的引物混合物浓度为0.5μM。

(2)从牛血液、精液或毛囊中提取DNA，用仪器测定其OD值和1.25％琼脂糖凝胶电泳检测合格后，转移至96孔板，-20℃储存备用。

(3)利用稀释好的引物和样品DNA在384孔中进行PCR扩增反应，如下：

PCR扩增反应采用5.000μl体系，组成为：1μl DNA(20ng/μl)、1.000μl扩增引物混合物(500nM each)、0.100μl dNTP(25mM each)、0.325μl MgCl₂(25mM)、0.100μl>2、1.850μl>2O。

PCR扩增反应程序为：先94℃5min；接着94℃20sec，56℃30sec，72℃1min，此步45个循环；最后72℃3min。

2.产物碱性磷酸酶处理，如下：

上步中每个孔的5.000μl PCR产物各加2.00μl虾碱性磷酸酶处理，去除剩余的dNTPs，具体如下：

其中，2.00μl虾碱性磷酸酶处理反应液组成为：1.53μl>2O、0.17μl虾碱性磷酸酶Buffer、0.30μl虾碱性磷酸酶(1U/μl)。

其中，7μl产物碱性磷酸酶处理液反应程序为：37℃20min；85℃5min；4℃∞。

3.单碱基延伸反应，如下：

虾碱性磷酸酶处理后的产物，进行单碱基延伸反应，优化的反应体系和程序，如下：

其中，单碱基延伸反应采用9μl反应体系，组成为：7μl产物碱性磷酸酶处理产物、0.200μl iPLEX Bμffer Plus、0.200μl iPLEX Termination mix、0.940μl延伸引物混合物(7μM：14μM)、0.041μl iPLEX Enzyme、0.619μl>2O。

其中，单碱基延伸反应的程序为：先94℃30sec；接着94℃5sec，(52℃5sec，80℃5sec，5个循环)，此步40个循环；72℃3min。

4.树脂纯化反应，如下：

(1)在384Dimple板中均匀填充树脂并放置10min。

(2)在384样本板的每个孔中加16μl水。

(3)轻敲Dimple使树脂落入样本板的每个孔中，然后将样本版室温旋转30min。

5.质谱检测及数据输出，如下：

用点样仪将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP芯片上，然后使用MALDI-TOF质谱仪对其分析，结果利用TYPER4.0软件进行数据处理，根据野生和突变位点对应的不同延伸产物分子量的大小，获得突变位点分型信息。

实施例2：用于检测93种牛遗传缺陷基因的试剂盒

试剂盒的组成包括：1-4孔扩增引物混合物(500nM each)、1-4孔延伸引物混合物(7μM：14μM)、dNTP(25mM each)、MgCl₂(25mM)、0.100μl>2、虾碱性磷酸酶Buffer、虾碱性磷酸酶(1U/μl)、iPLEX>2O、384Dimple板、384样本板、树脂。

其中，试剂盒所述的扩增引物混合物和延伸引物混合物，其序列如上述发明内容部分所述。采用该试剂盒进行牛的组织样本的检测步骤为：

(1)利用试剂盒中的试剂对质控合格的牛血液、精液或毛囊中的DNA进行PCR扩增反应，每个样本的93种牛遗传缺陷因果突变位点分成4个孔，在384孔中进行检测，反应孔的条件具体如下：

PCR扩增反应采用5.000μl体系，组成为：1μl DNA(20ng/μl)、1.000μl扩增引物混合物(500nM each)、0.100μl dNTP(25mM each)、0.325μl MgCl₂(25mM)、0.100μl>2、1.850μl>2O。

PCR扩增反应程序为：先94℃5min；接着94℃20sec，56℃30sec，72℃1min，此步45个循环；最后72℃3min。

(2)每个孔的5.000μl PCR产物各加2.00μl虾碱性磷酸酶反应液处理(组成为：1.53μl>2O、0.17μl虾碱性磷酸酶Buffer、0.30μl虾碱性磷酸酶(1U/μl))，去除剩余的dNTPs，7μl产物碱性磷酸酶处理液反应程序为：37℃20min；85℃5min；4℃∞。

(3)虾碱性磷酸酶处理后，进行单碱基延伸反应，如下：

单碱基延伸反应9μl反应体系，组成为：7μl产物碱性磷酸酶处理液、0.200μliPLEX Bμffer Plus、0.200μl iPLEX Termination mix、0.940μl延伸引物混合物(7μM：14μM)、0.041μl iPLEX Enzyme、0.619μl>2O。

单碱基延伸反应的程序为：先94℃30sec；接着94℃5sec，(52℃5sec，80℃5sec，5个循环)，此步40个循环；72℃3min。

(4)在384 Dimple板中均匀填充树脂并放置10min；在384样本板的每个孔中加16μl水；轻敲Dimple使树脂落入样本板的每个孔中，然后将样本版室温旋转30min。

(5)用点样仪将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP芯片上，然后使用MALDI-TOF质谱仪对其分析，结果利用TYPER4.0软件进行数据处理，根据野生和突变位点对应的不同延伸产物分子量的大小，获得位点分型信息。

实施例3：牛不同遗传缺陷基因和特色奶基因的样本检测

采集96头荷斯坦奶牛的血液样本，利用本发明实施例2的试剂盒中的试剂及其相关步骤，检测奶牛样本的遗传缺陷病的因果突变位点(SNP、短片段的插入或缺失)。

结果发现部分牛携带(杂合)遗传缺陷基因和致死单倍型(图3-图10)，并经测序验证。具体样本的基因型检测结果如下表5所示：

表5.牛遗传缺陷基因和致死单倍型(表型性状)检测结果

遗传缺陷(表型性状)样本数(基因型)致死单倍型(HH1)3头携带致死单倍型(HH3)7头携带脊柱畸形综合征(HHC)4头携带隐性红毛3732头携带致死单倍型(HH5)4头携带黄脂病3头携带隐性红毛EBR4头携带隐性红毛35812头携带、1头纯合突变槭糖尿病1头纯合突变浅色少毛症8头携带、1头纯合突变乳球蛋白23头AA、25头BB、48头携带β酪蛋白35头A2、11头A1、49头携带

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院奶牛研究中心

<120> 一套同时检测93种牛遗传缺陷基因和致死单倍型的引物组合及试剂盒

<130>

<160> 303

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgttggatg actggaaata gaaaccccgc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acgttggatg acgtcaccca catcaccatc 30

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgacaagctc ctcac 15

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgttggatg aggcctctct gtatctaacc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgttggatg gcaaacatca tccagatggg 30

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tctaacccca cggag 15

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acgttggatg aaaatctgca ccttcctctg 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acgttggatg gactgaggag gaaacatgac 30

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cactcaccag cctcttc 17

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acgttggatg tccctcctct tactcaaacc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acgttggatg ccatagcctc cttcactttg 30

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttgtggtgcc gcctttc 17

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

acgttggatg ttgacgttga cgaggtcatc 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acgttggatg ttcaatgtga ccttccggag 30

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccatcaggta gtacagg 17

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

acgttggatg gctgctgtgt acagagtatg 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

acgttggatg ctcaagggta atctgcactg 30

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gagtatgtgt gtgtggc 17

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

acgttggatg atgtcatcga cgtgctcatc 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

acgttggatg agaagatgga gatgtagcgg 30

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gcttcctggg tgccattg 18

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

acgttggatg agaggaggga tgttttgtgg 30

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

acgttggatg taaaatccac ccctttgccc 30

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ttggtgggag gctgttag 18

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

acgttggatg agttagaggg taacgacagc 30

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

acgttggatg agtcaaggta acagacacac 30

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cacgacagca tcgagattc 19

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

acgttggatg caaattacct ctgtttgctg 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

acgttggatg ataaacagca tttctttatg 30

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ttcggtttgc tgctgttcct 20

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

acgttggatg acatgttaac tcgcaggagg 30

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

acgttggatg acaggtatgg tatgatccag 30

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tgatgtaagc tggaagggag 20

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

acgttggatg tgaaggtgtc ctctatgctg 30

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

acgttggatg ttactcactt ggcactctgg 30

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gacccaaagt tctggaattt a 21

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

acgttggatg atattgtgca actgggcctc 30

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

acgttggatg attccgttat cgacctcctg 30

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gaaacttcag aggtttatcg g 21

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

acgttggatg tctgaggctc tttttggttc 30

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

acgttggatg gccctggatc tttctcatac 30

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ggtcttacct gagaatgtgt g 21

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

acgttggatg tacagggtca caaaggtgtc 30

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

acgttggatg accctagttt gagagaggag 30

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

ttgactcttc tagcacgaca ct 22

<210> 46

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

acgttggatg aagtaaaccc cagcaaagcc 30

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

acgttggatg aaggaacttt cagctggctc 30

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

gggtaaaaac atgctgtgag aa 22

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

acgttggatg cctttgtacc ccttcctcag 30

<210> 50

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

acgttggatg tggaccccct ggcgagaag 29

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

ctttacagaa ggaccatcat ctc 23

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

acgttggatg ttgcttggtg cacaagatgg 30

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

acgttggatg taaggccaat tactgctctg 30

<210> 54

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

acttttgcaa aaatacaaat tca 23

<210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

acgttggatg tgggcgatct ccacctgctt 30

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

acgttggatg atccagtcca gcgcactgta 30

<210> 57

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

gcgcgagagg tgcccaggag gta 23

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

acgttggatg acaatctgat tctcaaaggc 30

<210> 59

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

acgttggatg attctcacct gcaaagcctc 30

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

tgcccagaaa gataacaaga cgac 24

<210> 61

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

acgttggatg agccacaccc agaccccag 29

<210> 62

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

acgttggatg gtgttctgcc acgaggtgc 29

<210> 63

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

ggggatggaa ccccgcaagg ctca 24

<210> 64

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

acgttggatg actctctgct aacccagatg 30

<210> 65

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

acgttggatg acatgtgata gcaggtgtag 30

<210> 66

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

gatgaccacc ttcccctgca ggtac 25

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

acgttggatg tccggaagga cctgcataag 30

<210> 68

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

acgttggatg agatggctgg caactagaag 30

<210> 69

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

aggacggacc tgcataagac ggaga 25

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

acgttggatg taatgattcc cgcctcacag 30

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

acgttggatg tgctctctct ccagggtaac 30

<210> 72

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

ccgtatggat gtcttcccgc ggcctg 26

<210> 73

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

acgttggatg gaacaaaaac ttaagcaag 29

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

acgttggatg agccccatga tgagtttgag 30

<210> 75

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

taacaaaaac ttaagcaaga tacatg 26

<210> 76

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

acgttggatg cgtcgatgac attgtccagc 30

<210> 77

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

acgttggatg gtcagcaacg tgctggaga 29

<210> 78

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

acgtagatga cattgtccag ctgctgc 27

<210> 79

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

acgttggatg aggtaggcgg ctcccggca 29

<210> 80

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

acgttggatg ctggcagcgt gcagcctgg 29

<210> 81

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

cgctcgctgc ccccc 15

<210> 82

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

acgttggatg aacagcacca gagagcagca 30

<210> 83

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

acgttggatg ctactcccta ccttgttcag 30

<210> 84

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

agacctgccg cccac 15

<210> 85

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

acgttggatg ccaaacacac tgtgatgacc 30

<210> 86

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

acgttggatg ccaaacacac tgtgatgacc 30

<210> 87

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

accatgggct cagac 15

<210> 88

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

acgttggatg agtgactttg ccttgtcttg 30

<210> 89

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

acgttggatg caactctctc ctgaagtcac 30

<210> 90

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

gcccctgaag aggtt 15

<210> 91

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

acgttggatg tattttccct gctaggagtc 30

<210> 92

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

acgttggatg aggtgtgttt ggatcccaag 30

<210> 93

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

gctaggagtc gctgtg 16

<210> 94

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 94

acgttggatg ttcccctcat ccgtaccttc 30

<210> 95

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 95

acgttggatg aagggtctct ctactcactc 30

<210> 96

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 96

tccgtacctt ctctgtt 17

<210> 97

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

acgttggatg ccatctcctc caaaccatgt 30

<210> 98

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 98

acgttggatg tgaaccccat gtcaccctc 29

<210> 99

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 99

ccaaaccatg tgactgt 17

<210> 100

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 100

ccaaaccatg tgactgt 17

<210> 101

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 101

acgttggatg aagtaaaccc cagcaaagcc 30

<210> 102

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 102

gtgtaggtct catggca 17

<210> 103

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 103

acgttggatg taaaatccac ccctttgccc 30

<210> 104

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 104

acgttggatg agaggaggga tgttttgtgg 30

<210> 105

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 105

cccgtccctg gacccatcc 19

<210> 106

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 106

acgttggatg ggagctgagt cccgcttca 29

<210> 107

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 107

acgttggatg tgatgggacc gttggggtcg 30

<210> 108

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 108

cttaaccctg agcagcccc 19

<210> 109

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 109

acgttggatg tggtgaagta aagccattcc 30

<210> 110

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 110

acgttggatg tgaccccatg ttttccttcc 30

<210> 111

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 111

gtaaagccat tccatcaaa 19

<210> 112

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 112

acgttggatg atggagaaca gtgctgagcc 30

<210> 113

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 113

acgttggatg aggaccacac agctggtctc 30

<210> 114

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 114

cagcccgagc aaagcctgg 19

<210> 115

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 115

acgttggatg cagacaactg aagactctcc 30

<210> 116

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 116

acgttggatg gatcttggtg aggttaaagg 30

<210> 117

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 117

gacgcagcag tggtcctgga 20

<210> 118

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 118

acgttggatg acaatcccag ccaaatcttc 30

<210> 119

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 119

acgttggatg ggacatatac ttgcagggac 30

<210> 120

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 120

acgttggatg ggacatatac ttgcagggac 30

<210> 121

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 121

acgttggatg gtcggtgatc aaagagtggg 30

<210> 122

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 122

acgttggatg gtcggtgatc aaagagtggg 30

<210> 123

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 123

cgtcctggcc gggacaccct g 21

<210> 124

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 124

acgttggatg gcgttttgca ctccaagttc 30

<210> 125

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 125

acgttggatg tcggggactc acctgtgtca 30

<210> 126

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 126

ccgccgtgcc aacatggact g 21

<210> 127

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 127

acgttggatg acacacaaag tccgaggttc 30

<210> 128

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 128

acgttggatg ctttgctcat agggaccaac 30

<210> 129

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 129

gggccggtga gtgcatccgc c 21

<210> 130

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 130

acgttggatg tgacgatggg gtagcggag 29

<210> 131

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 131

acgttggatg accacaggcc agctctatg 29

<210> 132

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 132

gggaggaggc tgccgtcagc ca 22

<210> 133

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 133

acgttggatg aagagaggtt ctgggacagg 30

<210> 134

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 134

acgttggatg catgacagct aaaacctggc 30

<210> 135

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 135

tacctttttc ctgaaaagct tat 23

<210> 136

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 136

acgttggatg cctagttcct taatgcggtc 30

<210> 137

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 137

acgttggatg ggcaccatta ctaatagccc 30

<210> 138

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 138

atgcggtcat ttatgttaaa tctt 24

<210> 139

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 139

acgttggatg atgaaggcta tccatgggac 30

<210> 140

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 140

acgttggatg ccagttagaa atgactgtcg 30

<210> 141

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 141

ggagaggaca tgctgtttat cact 24

<210> 142

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 142

acgttggatg gagtctttgg ttgctggaag 30

<210> 143

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 143

acgttggatg cagaagaaca cccatcagag 30

<210> 144

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 144

ggatatggtg ctgagaaaat acct 24

<210> 145

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 145

acgttggatg ggagaaactc actctgtgtc 30

<210> 146

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 146

acgttggatg tttgatgcgc caagattccc 30

<210> 147

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 147

gcacctcact ctgtgtctca gaacc 25

<210> 148

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 148

acgttggatg ccatctaccg cagtacctg 29

<210> 149

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 149

acgttggatg acaagtaagt cttcccaccg 30

<210> 150

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 150

ggcggggagg tcacctactt cccttt 26

<210> 151

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 151

acgttggatg tcagcaacgt gctggagac 29

<210> 152

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 152

acgttggatg acgtcgatga cattgtccag 30

<210> 153

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 153

aggccgtcat gcgctgctgg aggccg 26

<210> 154

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 154

acgttggatg ctctggcttt cagtaaaggg 30

<210> 155

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 155

acgttggatg agtctccaaa gtgaaggagg 30

<210> 156

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 156

gggtgtttag ggaagggcat ttcttt 26

<210> 157

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 157

acgttggatg tatcaaacgt gaggccactg 30

<210> 158

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 158

acgttggatg agatcgccac ctacaggaag 30

<210> 159

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 159

cccacctgca ctcct 15

<210> 160

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 160

acgttggatg gctccaattc actcttgctg 30

<210> 161

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 161

acgttggatg gggagattca gtgacaatgg 30

<210> 162

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 162

cttgctggtg ggttt 15

<210> 163

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 163

acgttggatg tgtttcaagc tctggaactc 30

<210> 164

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 164

acgttggatg atgaccaacg gatactcagg 30

<210> 165

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 165

tctggaactc ctacct 16

<210> 166

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 166

acgttggatg aagctgggcc aaattctggg 30

<210> 167

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 167

acgttggatg gcgtgttgaa attctgcagg 30

<210> 168

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 168

attgtccccc aggaac 16

<210> 169

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 169

acgttggatg aactccacca tggtaggcac 30

<210> 170

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 170

acgttggatg tccttctgcc agcccagctc 30

<210> 171

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 171

gggcatcggc cagaac 16

<210> 172

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 172

acgttggatg ttgaccatca cacccatctg 30

<210> 173

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 173

acgttggatg ctttgctctt tgctaagcgg 30

<210> 174

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 174

gggcaggact taggcg 16

<210> 175

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 175

acgttggatg ttggcaatgg cagccactac 30

<210> 176

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 176

acgttggatg agtgcctgga ggtgtccat 29

<210> 177

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 177

gggctgagaa agagccc 17

<210> 178

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 178

acgttggatg tcatctcctt tagctccacc 30

<210> 179

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 179

acgttggatg atagattgac ctagaagctg 30

<210> 180

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 180

cctccagcca cagtgctc 18

<210> 181

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 181

cctccagcca cagtgctc 18

<210> 182

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 182

acgttggatg caaacatggg ccatcatcac 30

<210> 183

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 183

cgttcattat gctgcatt 18

<210> 184

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 184

acgttggatg tcagcaacgt gctggagac 29

<210> 185

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 185

acgttggatg tcagcaacgt gctggagac 29

<210> 186

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 186

gggagacggc agtcatgc 18

<210> 187

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 187

acgttggatg ccaaatcctt cttcaccagc 30

<210> 188

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 188

acgttggatg tcctcggagg tgtcgggag 29

<210> 189

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 189

atccccagcc agcagctgt 19

<210> 190

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 190

acgttggatg ggaaggtgca gattttcaac 30

<210> 191

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 191

acgttggatg cacaaagaaa tgcccttccc 30

<210> 192

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 192

tagtgagagt caggctctg 19

<210> 193

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 193

acgttggatg agcctgtttg tccctgcttg 30

<210> 194

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 194

acgttggatg gtgtccacac agtagcactc 30

<210> 195

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 195

ccctttctcc ctgtccagtg 20

<210> 196

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 196

acgttggatg ccatctgcag cgtctttttc 30

<210> 197

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 197

acgttggatg ccatctccag atgggttttg 30

<210> 198

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 198

tcttgtcttg ataatccagg 20

<210> 199

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 199

acgttggatg ggagttcata gacaagctcg 30

<210> 200

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 200

acgttggatg gttgatgatc tggccctgc 29

<210> 201

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 201

cctcctccag cccaatgtca t 21

<210> 202

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 202

acgttggatg acggctgtct tctcaacatc 30

<210> 203

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 203

acgttggatg ttcacacgtt gccatatgtc 30

<210> 204

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 204

ttgcttctat ctcaggttga t 21

<210> 205

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 205

acgttggatg tgcttccaag cccatgtcac 30

<210> 206

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 206

acgttggatg tttgaaattg ggcctgatcc 30

<210> 207

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 207

aatggggagg acttctggat a 21

<210> 208

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 208

acgttggatg tgcctcttgg ggtagttgag 30

<210> 209

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 209

acgttggatg acctatggtg aacactaccc 30

<210> 210

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 210

cgtcgttgag gcactacccc aa 22

<210> 211

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 211

acgttggatg tcccctgcta cttcatcgac 30

<210> 212

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 212

acgttggatg aatgcggctc cacttgattc 30

<210> 213

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 213

accgggacca ccgccccctc cac 23

<210> 214

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 214

acgttggatg gggtggtaga cttgatggtg 30

<210> 215

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 215

acgttggatg ttctctgctg acttcatgcc 30

<210> 216

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 216

aggcgacttg atggtgagga tg 22

<210> 217

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 217

acgttggatg actctctcgg gacgtagaag 30

<210> 218

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 218

acgttggatg ataaccgttt ggctgctctg 30

<210> 219

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 219

cagaggccgt gcctcctccg aag 23

<210> 220

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 220

acgttggatg cagctcacca gaaatatccc 30

<210> 221

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 221

acgttggatg attacgtcat gtgcgctcag 30

<210> 222

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 222

tctaaccaga aatatcccaa acgc 24

<210> 223

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 223

acgttggatg aaagcagaga ggaggcaatg 30

<210> 224

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 224

acgttggatg tctctctgcc tttttcctcc 30

<210> 225

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 225

gagcggaggc aatgagctta cctt 24

<210> 226

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 226

acgttggatg tatgatgtcc tgctggttcc 30

<210> 227

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 227

acgttggatg aaaaggcacc cagtctgtag 30

<210> 228

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 228

ctggtatatt agagagttag ggtt 24

<210> 229

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 229

acgttggatg tcaaggactt ctacgagctg 30

<210> 230

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 230

acgttggatg cagggttaca catcaccaac 30

<210> 231

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 231

caatcagacc aatgggatca cccct 25

<210> 232

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 232

acgttggatg gatcgccacc atgaaggaac 30

<210> 233

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 233

acgttggatg atgctgtgta accaaacagg 30

<210> 234

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 234

gaagtgtcgt cttcgtgtct tcccag 26

<210> 235

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 235

acgttggatg taaaatccac ccctttgccc 30

<210> 236

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 236

acgttggatg agaggaggga tgttttgtgg 30

<210> 237

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 237

tccctggacc catcc 15

<210> 238

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 238

acgttggatg accgctacat ctccatcttc 30

<210> 239

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 239

acgttggatg agatggccgc aatgatcctc 30

<210> 240

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 240

gccctgcggt accac 15

<210> 241

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 241

acgttggatg ccacggcgat cttaaagtag 30

<210> 242

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 242

acgttggatg tctggctcat caacattggc 30

<210> 243

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 243

ccacggatcc aggag 15

<210> 244

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 244

acgttggatg gggaagaacc atcgatcagc 30

<210> 245

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 245

acgttggatg aaacagagag ctcctcaccc 30

<210> 246

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 246

gcctgggggt agact 15

<210> 247

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 247

gcctgggggt agact 15

<210> 248

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 248

acgttggatg agacgtagcc actgggttct 30

<210> 249

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 249

atgaagcaag gctcag 16

<210> 250

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 250

acgttggatg tggcttggga cagtgatgtg 30

<210> 251

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 251

acgttggatg cagggccatg tgctgcttg 29

<210> 252

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 252

tcctgccctc acgacca 17

<210> 253

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 253

acgttggatg tgggagaagg aagtacatgg 30

<210> 254

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 254

acgttggatg caactcatta cagcatccgc 30

<210> 255

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 255

ccatcaactc catgcga 17

<210> 256

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 256

acgttggatg agaggaaggt gcagattttc 30

<210> 257

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 257

acgttggatg gcccttccct aaatatccag 30

<210> 258

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 258

gtgagagtca ggctctg 17

<210> 259

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 259

acgttggatg atacccccca gcagtacct 29

<210> 260

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 260

acgttggatg tccacgtgtc acaggatgag 30

<210> 261

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 261

ccgtacctgg ggcaccgt 18

<210> 262

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 262

acgttggatg tgatcttctg ctccaagtcg 30

<210> 263

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 263

acgttggatg gagaaggtga ccatgcagaa 30

<210> 264

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 264

ggaggaggcc aggcggtc 18

<210> 265

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 265

acgttggatg tccacgtgtc acaggatgag 30

<210> 266

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 266

acgttggatg atacccccca gcagtacct 29

<210> 267

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 267

agtaatgaac ccctcgccc 19

<210> 268

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 268

acgttggatg aatactgtgc ctgccaagtc 30

<210> 269

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 269

acgttggatg tggtggaatg gccataaatg 30

<210> 270

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 270

cagccaacta ccatggcac 19

<210> 271

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 271

acgttggatg gtgagcgtca gcaacgtgc 29

<210> 272

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 272

acgttggatg tgacattgtc cagctgctgc 30

<210> 273

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 273

atccgcaacg tgctggaga 19

<210> 274

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 274

acgttggatg tcatcttctc acagtagccc 30

<210> 275

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 275

acgttggatg gaaagctgtc tagactctgg 30

<210> 276

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 276

ggggtgccct tcggatctca 20

<210> 277

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 277

acgttggatg gatcttccca atctcggtgc 30

<210> 278

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 278

acgttggatg cctgcctctt cttcccctt 29

<210> 279

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 279

cgcaggctgc gatgttggtg 20

<210> 280

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 280

acgttggatg cactcacggt caccttggc 29

<210> 281

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 281

acgttggatg tgatggcaga ggtggagtag 30

<210> 282

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 282

gctccccgtt catgccgccg t 21

<210> 283

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 283

acgttggatg gtatatggct attaggacgg 30

<210> 284

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 284

acgttggatg gtgtctgtgt ggaaggccat 30

<210> 285

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 285

gctattagga cggagatgat c 21

<210> 286

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 286

acgttggatg gaacaaatta cctctgtttg c 31

<210> 287

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 287

acgttggatg ataaacagca tttctttatg 30

<210> 288

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 288

actaactctg tttgctgctg tt 22

<210> 289

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 289

acgttggatg actcctggag tcaagtgaag 30

<210> 290

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 290

acgttggatg ggtgcaaatg gctgaagaac 30

<210> 291

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 291

aatgctggtt tcatgcttac tc 22

<210> 292

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 292

acgttggatg caatatgtgc ttctgctgtg 30

<210> 293

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 293

acgttggatg tgtccagttc ttctcccaag 30

<210> 294

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 294

ggggattctg ctgtgcagtg tt 22

<210> 295

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 295

acgttggatg tttgcttagg agccatagcc 30

<210> 296

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 296

acgttggatg ttactcaaac ccctgtggtg 30

<210> 297

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 297

gggcgtcact ttggagactc cca 23

<210> 298

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 298

acgttggatg tcgcatcagc attgagaacg 30

<210> 299

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 299

acgttggatg tctcagccgt tgaaccaatc 30

<210> 300

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 300

acgttggatg tctcagccgt tgaaccaatc 30

<210> 301

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 301

acgttggatg tctcagccgt tgaaccaatc 30

<210> 302

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 302

acgttggatg tctcagccgt tgaaccaatc 30

<210> 303

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 303

ggtgactcta cgtcggagac gtcg 24