牛冠状病毒重组多表位抗原及其应用

摘要

本发明公开了牛冠状病毒重组多表位抗原，还公开了该牛冠状病毒重组多表位抗原在预防和诊断牛冠状病毒中的应用，属于分子免疫学领域。本发明的牛冠状病毒重组多表位抗原的氨基酸序列是牛冠状病毒BCoV S蛋白抗原表位的串联体。本发明将能引起中和抗体的牛冠状病毒重组多表位抗原作为免疫原或疫苗，免疫动物机体后能够产生针对牛冠状病毒BCoV的中和抗体，并能够在体外中和BCoV，阻止病毒感染动物机体。而且，本发明的牛冠状病毒重组多表位抗原还能够作为检测牛冠状病毒BCoV抗体或者多肽抗体的试剂。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及免疫学领域技术领域，具体涉及一种牛冠状病毒重组多表位抗原及其应用。

背景技术

牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是20世纪70年代发现的牛腹泻病原，我国于1985 年首次分离到。临床上主要表现为新生犊牛腹泻、拉血样粪便、成年牛冬季严重水样腹泻(有时伴有血和黏液)等特征。该病主要通过消化道和呼吸道传播，发病率高。一旦发病极易引起群体感染，并且诱发继发感染，给以集约化饲养为特点的养牛业造成巨大的经济损失。目前临床上主要以灭活疫苗和减毒活疫苗的防控为主，但灭活疫苗和减毒活疫苗存在生物危害性和遗传变异致使原疫苗效力丧失等问题。

表位疫苗是近年发展起来的一种新型疫苗，它是利用基因工程的手段，体外表达或人工合成病原微生物的抗原表位，将其作为一种疫苗使用。表位又称抗原决定簇，是抗原分子中决定抗原特异性的化学基团，是能够与T细胞抗原受体或B细胞抗原受体特异性结合的基本单位，最终激起机体的免疫反应，形成对病原微生物的免疫能力，因此，表位疫苗符合未来疫苗的发展方向。

牛冠状病毒(BCoV)是单股正链不分段的RNA病毒，基因组大小约为32kb。基因组含有五种结构蛋白，分别为核衣壳蛋白(N,52kDa)，膜蛋白(M,25kDa)，纤突蛋白(S,180kDa)，小衣壳蛋白(E,8kDa)，血凝素酯酶蛋白(HE,65kDa)其中S蛋白主要负责病毒的吸附，介导病毒与宿主膜融合，诱导宿主免疫反应和病毒中和抗体。因此，可以选择S蛋白的抗原表位作为诊断抗原，用于BCoV抗体水平的检测和表位疫苗的研制。但目前尚未有关于牛冠状病毒表位疫苗的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种牛冠状病毒重组多表位抗原及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种牛冠状病毒重组多表位抗原，是具有如下氨基酸序列之一的多肽：

(a)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有抗原表位功能的蛋白衍生物。

所述一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入为不超过10个氨基酸残基的替换、缺失或插入。

本发明的第二方面，提供编码上述牛冠状病毒重组多表位抗原的基因，是具有如下核苷酸序列之一的多核苷酸：

(1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(2)在严格条件下与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列杂交且编码具有相同功能的多肽的核苷酸序列。

本发明的第三方面，提供一种重组载体，其含有上述编码牛冠状病毒重组多表位抗原的基因。

进一步的，本发明还提供一种重组菌，其被上述的重组载体转化。

经重组载体转化的重组菌选自重组大肠杆菌或重组酵母菌。

本发明的第四方面，提供上述的牛冠状病毒重组多表位抗原或编码所述重组多表位抗原的基因在制备表位疫苗中的应用。

本发明的第五方面，提供上述的牛冠状病毒重组多表位抗原在制备检测抗BCoV抗体或者抗BCoV多肽抗体的试剂盒中的应用。

本发明的第六方面，提供上述的牛冠状病毒重组多表位抗原、编码重组多表位抗原的基因、重组载体或重组菌在制备治疗牛冠状病毒药物中的应用。

本发明的第七方面，提供一种疫苗组合物，其包含上述的牛冠状病毒重组多表位抗原。

本发明的疫苗组合物还包含可药用佐剂，以促进体内注射后形成抗体。

上述技术方案具有如下有益效果：

本发明以牛冠状病毒S蛋白上保守性好的两个抗原表位S1和S2，将S1和S2串联组成，两个抗原表位之间由4GS-4GS柔性氨基酸连接。同时，参照大肠杆菌密码子偏嗜表，对重组抗原表位BCoV-double-S1-S2的氨基酸序列进行密码子优化，以提高其原核表达效率。另在重组多表位抗原N端和C端添加酶切位点和保护性碱基，制备得到牛冠状病毒重组多表位抗原BCoV-double-S1-S2。本发明的牛冠状病毒重组多表位抗原可以用于制备表位疫苗，免疫动物机体后能够产生针对牛冠状病毒BCoV的中和抗体，并能够在体外中和BCoV，阻止病毒感染动物机体。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1为编码BCoV S重组多表位抗原的核苷酸序列；为确保BCoV S蛋白抗原表位的抗原性不发生变化，空间结构保持线性，特用柔性氨基酸将其串联，并在两端添加NotI/EcoRI 限制性内切酶酶切位点。

图2为BCoV S蛋白抗原表位重组表达质粒构建成功的鉴定结果；M为分子大小为10000 bp的Marker，1为重组表达质粒酶切后的图谱，上面的条带为pET-28a(+)，大小为5369bp，下面的条带为抗原表位的串联体，大小为513bp。

图3为BCoV S蛋白抗原表位多肽融合蛋白与抗BCoV兔血清Western-blot鉴定结果；M 为100KD的蛋白Marker，1为抗BCoV兔血清与BCoV S蛋白抗原表位多肽融合蛋白发生反应的单一目的条带，大小为22KD。结果说明BCoV S蛋白抗原表位多肽融合蛋白免疫兔只能产生抗该抗原表位的抗体。

图4为BCoV S蛋白抗原表位多肽融合蛋白与BCoV阳性牛血清Western-blot鉴定结果； M为100KD的蛋白Marker，1为BCoV阳性牛血清与BCoV S蛋白抗原表位多肽融合蛋白发生反应的单一目的条带，大小为22KD。结果说明BCoV S蛋白抗原表位多肽能够中和BCoV 的阳性牛血清，BCoV S蛋白抗原表位多肽具有抗原性。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中尚未有关于牛冠状病毒表位疫苗的报道。基于此，本发明提出了一种牛冠状病毒重组多表位抗原及其应用。

在本申请的一种实施方案中，设计合成了BCoV重组抗原表位多肽串联体 BCoV-double-S1-S2，由BCoV S蛋白上两个抗原表位S1和S2串联组成，两个抗原表位之间由4GS-4GS柔性氨基酸连接。同时，参照大肠杆菌密码子偏嗜表，对重组抗原表位 BCoV-double-S1-S2的氨基酸序列进行密码子优化，以提高其原核表达效率。另在重组多表位抗原N端和C端添加酶切位点和保护性碱基。

本发明中所述的BCoV S蛋白抗原表位可以通过基因工程技术制备得到。

本发明BCoV S蛋白抗原表位可连接到原核表达载体，通过纯化获得目的蛋白。目的蛋白免疫动物可以产生中和抗体，感染细胞后也可抑制牛冠状病毒的增殖。也可将目的蛋白制备成检测抗BCoV抗体或者抗BCoV多肽抗体的试剂盒。

检测BCoV可以是针对S蛋白抗原表位的单克隆抗体或是针对重组抗原表位的多克隆抗体，检测方法可以包括间接ELISA、双抗体夹心ELISA、直接免疫荧光技术、间接免疫荧光技术，快速检测试纸条免疫膜层析技术等。

蛋白质抗原表位鉴定的方法有很多种，如基因工程定点突变表达抗原蛋白分析法、噬菌体随机肽库筛选技术、合成多肽检测技术等。本项发明采用的是基因工程技术合成多肽，多肽连接到原核表达载体获得免疫原性，纯化获得融合蛋白。融合蛋白能够阻断BCoV阳性血清与BCoV的反应；融合蛋白免疫兔只获得的多克隆抗体能够中和BCoV，阻断BCoV在细胞中增殖。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1：BCoV S蛋白抗原表位的筛选及多表位蛋白的设计与合成

根据NCBI上的文献报道和Genebank数据库中所公布的牛冠状病毒流行株S基因序列，设计重组抗原表位BCoV-double-S1-S2，在设计的同时选取了S蛋白上保守性好的两个抗原表位S1和S2，将S1和S2重复串联，每段抗原表位之间由4GS-4GS柔性氨基酸连接。同时，参照大肠杆菌密码子偏嗜表，对编码重组抗原表位BCoV-double-S1-S2的核苷酸序列进行优化，以提高其原核表达效率。最后，在重组抗原表位BCoV-double-S1-S2的序列两端添加EcoR I和Not I限制性内切酶酶切位点及保护性碱基，并利用基因工程的方法合成该重组抗原表位。

最终设计得到的牛冠状病毒重组多表位抗原的氨基酸序列如下：

PEFTTGYRFTNFEPFTVGGGGSGGGGSKTFSNCNFNMSSLMSFIQADSFTCNNIDAAKIYGMCFSSITIDKFAIPNGRKVGGGGSGGGGSTTGYRFTNFEPFTVGGGGSGGGGSKTFSNCNFNMSSLMSFIQADSFTCNNIDAAKIYGMCFSSITIDKFAIPNGRKVAAAL；(SEQ ID NO.1)。

编码上述牛冠状病毒重组多表位抗原的核苷酸序列如下：

CCGGAATTCACCACCGGUUAUCGUUUUACCAAUUUUGAACCGUUUACCGUUGGUGGUGGUGGUAGCGGUGGUGGUGGUAGCAAAACCUUUAGCAAUUGUAAUUUUAAUAUGAGCAGCCUGAUGAGCUUUAUUCAGGCAGAUAGCUUUACCUGUAAUAAUAUUGAUGCAGCAAAAAUUUAUGGUAUGUGUUUUAGCAGCAUUACCAUUGAUAAAUUUGCAAUUCCGAAUGGUCGUAAAGUUGGUGGUGGUGGUAGCGGUGGUGGUGGUAGCACCACCGGUUAUCGUUUUACCAAUUUUGAACCGUUUACCGUUGGUGGUGGUGGUAGCGGUGGUGGUGGUAGCAAAACCUUUAGCAAUUGUAAUUUUAAUAUGAGCAGCCUGAUGAGCUUUAUUCAGGCAGAUAGCUUUACCUGUAAUAAUAUUGAUGCAGCAAAAAUUUAUGGUAUGUGUUUUAGCAGCAUUACCAUUGAUAAAUUUGCAAUUCCGAAUGGUCGUAAAGUUGCG GCCGCTTTA；(SEQ IDNO.2)。

其中，编码抗原表位S1的核苷酸序列如下：

ACCACCGGUUAUCGUUUUACCAAUUUUGAACCGUUUACCGUU；(SEQ ID NO.3)。

编码抗原表位S2的核苷酸序列如下：

AAAACCUUUAGCAAUUGUAAUUUUAAUAUGAGCAGCCUGAUGAGCUUUAUUCAGGCAGAUAGCUUUACCUGUAAUAAUAUUGAUGCAGCAAAAAUUUAUGGUAUGUGUUUUAGCAGCAUUACCAUUGAUAAAUUUGCAAUUCCGAAUGGUCGUAAAGUU；(SEQ ID NO.4)。

连接抗原表位S1和S2的Linker序列为：

GGUGGUGGUGGUAGCGGUGGUGGUGGUAGC；(SEQ ID NO.5)。

实施例2：BCoV S蛋白抗原表位重组表达载体的构建与鉴定

用EcoR I和Not I限制性内切酶双酶切原核表达载体pET-28a(+)及BCoV S蛋白抗原表位串联体，分别回收载体片段和目的基因片段，用T4DNA连接酶将目的基因片段连接到pET-28a(+)载体上，转化至BL21(DE3)感受态细胞，挑取双酶切鉴定为阳性的单菌落，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

BCoV S蛋白抗原表位重组表达载体构建的鉴定结果如图2所示，由图2可以看出，M为分子大小为10000bp的Marker，1为重组表达质粒酶切后的图谱，上面的条带为pET-28a(+)，大小为5369bp，下面的条带为抗原表位的串联体，大小为513bp，说明本发明的BCoV S蛋白抗原表位重组表达载体构建成功。

实施例3：BCoV间接ELISA检测方法的建立

BCoV S蛋白重组抗原表位诱导表达纯化的蛋白作为抗原，按0.1-10μg/ml不同的蛋白浓度包被96孔板酶标板，用BCoV阳性牛血清做一抗，以犊牛阴性血清作为一抗的阴性对照，按照1:20、1:50、1:80、1:100、1:200、1:400的比例稀释，与蛋白稀释度形成矩阵，HRP-兔抗牛IgG 1:5000稀释作为二抗，摸索蛋白和一抗的最佳浓度。其中蛋白包被最佳浓度为0.30μg/ml，血清稀释浓度为1:100时，检测效果最佳。初步建立BCoV间接ELISA检测方法。

判定结果：空白对照及阴性血清孔吸光值小于0.2，阳性血清孔对照孔吸光值大于0.3时结果有效。

表1 BCoV间接ELISA检测

注：+表示阳性血清OD₄₅₀值，-表示阴性血清OD₄₅₀值。

在本ELISA方法建立中P/N值越高，证明阳性值和阴性值差异越明显，检测方法越灵敏，所以蛋白包被浓度为0.30μg/ml，血清稀释浓度为1:100时，检测效果最佳，成功建立了BCoV 间接ELISA检测方法。

实施例4：BCoV S蛋白抗原表位多肽融合蛋白与抗BCoV兔血清/BCoV阳性牛血清Western-blot鉴定

Western-blot具体试验过程如下:

(1)SDS-PAGE：将获得的BCoV S蛋白抗原表位多肽融合蛋白进行SDS-PAGE。

(2)膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，在转膜缓冲液中浸泡10min。

(3)转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、滤纸、NC膜(膜盖下后不可再移动)、凝胶、滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步都需去除气泡。接通电源，恒流200mA，转移2h。转移结束后，断开电源将NC膜取出。

(4)免疫反应：用TBST洗膜，5min×3次；用5％的脱脂奶粉包被，室温平稳摇动2h；弃包被液，用TBST洗膜，5min×3次；加入一抗BCoV兔血清/阳性牛血清(按1:1000比例用5％的脱脂奶粉稀释，液体必须覆盖膜的全部)，室温平稳摇动结合2h；加入山羊抗兔/兔抗牛的二抗(按1:3000稀释比例用5％的脱脂奶粉稀释)，平稳摇动结合2h；弃二抗，用TBST洗膜，5min×3次；

(5)化学发光，显影，定影：将A和B两种试剂等体积混合，1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触，放入仪器成像，观察结果。

BCoV S蛋白抗原表位多肽融合蛋白与抗BCoV兔血清Western-blot鉴定结果见图3，结果说明BCoV S蛋白抗原表位多肽融合蛋白免疫兔只能产生抗该抗原表位的抗体。

BCoV S蛋白抗原表位多肽融合蛋白与BCoV阳性牛血清Western-blot鉴定结果见图4，结果说明BCoV S蛋白抗原表位多肽能够中和BCoV的阳性牛血清，BCoV S蛋白抗原表位多肽具有抗原性。

实施例5：BCoV与抗原表位多克隆抗体的中和试验

选取3月龄雄性新西兰大白兔3只，其中1只免疫pET-28a(+)空载菌体蛋白，另外两只免疫融合蛋白。分别用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂与提纯的抗原蛋白充分混合成油乳状。每只新西兰大白兔免疫重组抗原200μg，免疫三次，间隔期为2周，均为背部皮下多点注射，首免用弗氏完全佐剂，二免、三免用弗氏不完全佐剂。每次免疫前采血留样，三免14d后耳静脉采血测定效价，效价达到要求后心脏采血分离血清，获得BCoV抗原表位的多克隆抗体。

BCoV抗原表位多克隆抗体56℃灭活30min，2000rpm离心5min，过滤，用不含有FBS的1640稀释血清，从1:2、1:4、1:8……..1:1024连续倍比稀释，将BCoV用不含有FBS的1640稀释至200TCID₅₀/100μL，然后将稀释的血清与等体积的病毒液混合，于37℃作用1h。接种已长成单层的HCT-8细胞，100μL/孔，每个血清稀释度作3个复孔，37℃培养2～3d。同时设置阴阳对照。结果判定，当阳性孔(未添加血清)出现CPE时，而阴性血清(未添加病毒)>

BCoV与抗原表位多克隆抗体的中和试验的结果如表2所示，BCoV抗原表位免疫兔只后产生的多克隆抗体能够在体外有效的中和BCoV。

表2 中和试验CPE孔数

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院奶牛研究中心；山东省农业科学院家禽研究所；山东师范大学

<120> 牛冠状病毒重组多表位抗原及其应用

<130> 2017

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 171

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Pro Glu Phe Thr Thr Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Phe Glu Pro Phe Thr

1 5 1015

Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Thr Phe Ser Asn

202530

Cys Asn Phe Asn Met Ser Ser Leu Met Ser Phe Ile Gln Ala Asp Ser

354045

Phe Thr Cys Asn Asn Ile Asp Ala Ala Lys Ile Tyr Gly Met Cys Phe

505560

Ser Ser Ile Thr Ile Asp Lys Phe Ala Ile Pro Asn Gly Arg Lys Val

65707580

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Gly Tyr Arg Phe

859095

Thr Asn Phe Glu Pro Phe Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Lys Thr Phe Ser Asn Cys Asn Phe Asn Met Ser Ser Leu Met

115 120 125

Ser Phe Ile Gln Ala Asp Ser Phe Thr Cys Asn Asn Ile Asp Ala Ala

130 135 140

Lys Ile Tyr Gly Met Cys Phe Ser Ser Ile Thr Ile Asp Lys Phe Ala

145 150 155 160

Ile Pro Asn Gly Arg Lys Val Ala Ala Ala Leu

165 170

<210> 2

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccggaattca ccaccgguua ucguuuuacc aauuuugaac cguuuaccgu uggugguggu 60

gguagcggug guggugguag caaaaccuuu agcaauugua auuuuaauau gagcagccug 120

augagcuuua uucaggcaga uagcuuuacc uguaauaaua uugaugcagc aaaaauuuau 180

gguauguguu uuagcagcau uaccauugau aaauuugcaa uuccgaaugg ucguaaaguu 240

ggugguggug guagcggugg uggugguagc accaccgguu aucguuuuac caauuuugaa 300

ccguuuaccg uugguggugg ugguagcggu ggugguggua gcaaaaccuu uagcaauugu 360

aauuuuaaua ugagcagccu gaugagcuuu auucaggcag auagcuuuac cuguaauaau 420

auugaugcag caaaaauuua ugguaugugu uuuagcagca uuaccauuga uaaauuugca 480

auuccgaaug gucguaaagu ugcggccgct tta513

<210> 3

<211> 42

<212> RNA

<213> S1

<400> 3

accaccgguu aucguuuuac caauuuugaa ccguuuaccg uu 42

<210> 4

<211> 159

<212> RNA

<213> S2

<400> 4

aaaaccuuua gcaauuguaa uuuuaauaug agcagccuga ugagcuuuau ucaggcagau 60

agcuuuaccu guaauaauau ugaugcagca aaaauuuaug guauguguuu uagcagcauu 120

accauugaua aauuugcaau uccgaauggu cguaaaguu159

<210> 5

<211> 30

<212> RNA

<213> Linker

<400> 5

ggugguggug guagcggugg uggugguagc 30