一种酵母氧化应激代谢物的抗炎作用及其应用

摘要

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及酵母氧化应激代谢物的抗炎作用以及在制备抗炎产品中的应用。本发明提供了酵母氧化应激代谢物的制备方法，并通过实验表明，酵母代谢物能够抑制COX‑2的表达和NF‑кB信号通路的活化，并能够起到抑制炎性细胞浸润、抑制细胞核质比的增加、抑制表皮角质化和/或降低肿胀程度的作用，从而证明酵母代谢物能具有抗炎的作用，能够应用于药品、化妆品、保健品、食品等相关领域，可制作片剂、胶囊、乳膏、液体等剂型形式。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及酵母代谢物在制备抗炎产品中的应用。

背景技术

炎症作为一种重要的病理过程在人体中十分常见，是机体血管系统的活体组织对损伤因子的防御反应，是由损伤因子引起的组织损伤。所以大多数的疾病都伴随着炎症的介导和发生。

酵母细胞在受到应激胁迫，比如紫外照射、高低温、氧化压力等刺激时，会启动多种应激机制产生多种活性物质以抵御不良环境的刺激，这些活性物质为酵母氧化应激代谢物，也有人称为活性酵母衍生物(Live Yeast Cell Derivative，简称LYCD)。最初的LYCD是从紫外光照处理过的酵母细胞中提取出来的。将酿酒酵母置于286nm的紫外辐射之下，细胞可以产生一些能够增加细胞呼吸且促进修复的未知因子，即为LYCD。后来有人把亚致死剂量的H₂O₂加入到酵母细胞中，处理后的酵母经提取同样获得了LYCD。

LYCD的应用研究表明：其具备促进细胞呼吸和能量利用过程、促进胶原和弹性蛋白的产生；加速伤口愈合的功能；且能够增加皮肤细胞中的新生蛋白质对水分吸收和促进细胞线粒体对氧的利用，从而滋润并更新皮肤细胞；使细胞的呼吸和能量代谢过程更为有效。是一种特别有效、安全的活性成分。而LYCD的抗炎活性，目前还未报道。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供酵母代谢物在制备抗炎产品中的应用，本发明实验表明，LYCD具有抗炎的作用，能够有效缓解小鼠耳膜炎症。

本发明中，酵母氧化应激代谢物的制备方法为：

以0.02～0.4mM H₂O₂诱导对数期啤酒酵母，10～60min后收集酵母细胞，以PBS清洗后，以培养基重悬、培养1～6h；

收集酵母细胞，以生理盐水重悬，反复冻融4～7次后，10000r/min离心2～4次，5min/次，取上清为酵母氧化应激代谢物。

所述酵母为啤酒酵母、产阮酵母或毕赤酵母。

所述培养基为YEPD。所述培养的温度为28℃～30℃，转速为120～200r/min。

所述LYCD的制得后，于-20℃保藏或用喷雾干燥机或冷冻干燥机制成固体。

本发明提供方法制得的酵母氧化应激代谢物。

本发明提供了酵母氧化应激代谢物在制备COX-2抑制剂中的应用。

本发明提供了非特异炎症条件下，酵母氧化应激代谢物在制备COX-2抑制剂中的应用。

本发明所述非特异性炎症为TPA诱导的非特异性炎症。

TPA(二甲苯)是一种致炎剂，用于诱导动物非特异性炎症模型。COX-2在炎症反应的病理中有着重要的作用。本发明实验表明，经TPA诱导后，COX-2的表达显著提高。而涂抹酵母氧化应激代谢物则能够有效抑制COX-2的表达。

本发明中，抑制COX-2表达的酵母氧化应激代谢物的浓度为1～16mg/mL。即酵母氧化应激代谢物在1～16mg/mL浓度范围内，对COX-2的表达均有一定程度的抑制。酵母氧化应激代谢物在浓度为4～8mg/mL范围内，对COX-2的表达的抑制程度更佳。有更为明显和最大程度的抑制作用的酵母氧化应激代谢物为8mg/mL。

本发明还提供了酵母氧化应激代谢物在制备NF-кB信号通路抑制剂中的应用。

本发明提供了非特异炎症条件下，酵母氧化应激代谢物在制备NF-кB信号通路抑制剂中的应用。

本发明所述非特异性炎症为TPA诱导的非特异性炎症。

在本发明实施例中，所述酵母氧化应激代谢物抑制NF-кB信号通路中的P65。

NF-кB在TPA诱导的炎症模型中可调节基因和蛋白的表达。在NF-кB活化的过程中，TPA能够激活NF-кB信号通路，导致NF-кB信号通路中各类炎症因子的含量都会明显地增多，然后通过一系列相关因子的转移和表达，最终导致炎症的产生。单独TPA作用时，小鼠耳廓中NF-кB的阳性表达明显增多，而涂抹酵母氧化应激代谢物则能够有效抑制NF-кB通路的活化。具体表现为抑制P65的表达。

本发明中，抑制NF-кB信号通路(p65)表达的酵母氧化应激代谢物的浓度为1～16mg/mL。即酵母氧化应激代谢物在1～16mg/mL浓度范围内，对NF-кB信号通路(p65)的表达均有一定程度的抑制。酵母氧化应激代谢物在浓度为4～8mg/mL范围内，对NF-кB信号通路(p65)的表达的抑制程度更佳。有更为明显和最大程度的抑制作用的酵母氧化应激代谢物为8mg/mL。

本发明提供了酵母氧化应激代谢物在制备抗炎产品中的应用。

本发明提供的抗炎产品用于预防或改善非特异性炎症。

所述非特异性炎症为TPA诱导的非特异性炎症。

本发明实施例中，所述抗炎包括：抑制炎性细胞浸润、抑制细胞核质比的增加、抑制表皮角质化和/或降低肿胀程度。

在TPA诱导的非特异性炎症(小鼠耳肿胀模型)模型中，耳廓明显肿胀，表皮角化过度，角质层明显增厚和炎性细胞浸润増多(细胞固缩)，细胞核与细胞质的比例明显变小。而涂抹酵母氧化应激代谢物则能够有效抑制这些炎症反应。

本发明中，酵母氧化应激代谢物抗炎的的浓度为1～16mg/mL。即酵母氧化应激代谢物在1～16mg/mL浓度范围内，对炎症反应存在一定程度的抑制。酵母氧化应激代谢物在浓度为4～8mg/mL范围内，对炎症反应的抑制程度更佳。有更为明显和最大程度的抑制作用的酵母氧化应激代谢物为8mg/mL。

本发明还提供了一种抗炎产品，包括酵母氧化应激代谢物和辅料。

所述抗炎产品为化妆品、药品、卫生用品或宠物用品。

本发明提供的抗炎产品的剂型为片剂、胶囊、乳膏、溶液剂、粉剂、洗剂、酊剂、乳剂、软膏剂、糊剂或硬膏剂。

本发明提供的抗炎产品中，酵母氧化应激代谢物的浓度为1～16mg/mL。

优选浓度为4～8mg/mL。更优选的，浓度为8mg/mL。

本发明通过实验表明，酵母代谢物能够抑制COX-2的表达和NF-кB信号通路的活化，并能够起到抑制炎性细胞浸润、抑制细胞核质比的增加、抑制表皮角质化和/或降低肿胀程度的作用，从而证明酵母代谢物能够具有抗炎的作用。

附图说明

图1示LYCD对小鼠耳肿胀的抑制率；

图2示各组物质抑制TPA诱导的小鼠耳廓肿胀HE染色图；

图3～4示各组小鼠耳廓组织中COX-2的表达情况；

图5～6示各组小鼠耳廓组织中NF-kB的激活情况。

具体实施方式

本发明提供了酵母氧化应激代谢物在制备抗炎产品中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

本发明提供的酵母氧化应激代谢物是在啤酒酵母、产阮酵母、毕赤酵母等培养到对数期时，加入0.02～0.4mM H₂O₂，处理10～60min后，10000r/min离心5min，取沉淀，PBS洗一次，10000r/min离心5min，取沉淀，换新的YEPD培养基,继续培养1～6h(条件温度为28℃～30℃，转速为120～200r/min，离心(10000r/min，5min)，PBS洗两遍，取沉淀部分，加入生理盐水(按1g(湿重)/1mL)，反复冻融5次(液氮法)，离心3次(10000r/min，10min)，取上清，保存-20℃。

取制得的酵母氧化应激代谢物样品检测其抗氧化能力，结果表明，其中GSH含量为0.3881μg/mL；SOD活力为12.6020U/mgprot；CAT活力为2.7371U/mgprot。说明制得的活性酵母细胞衍生物品质良好，具有良好的抗氧化能力。

实施例2

采用二甲苯所致的小鼠耳肿胀模型评价LYCD的抗炎活性；

(1)将若干昆明小鼠随机分为空白组、丙酮组、生理盐水组、TPA组、实验组组(LYCD浓度依次为1.0mg/mL、2.0mg/mL、4mg/mL、8mg/mL、16mg/mL)、NAC(N-乙酰半胱氨酸,10mg/mL)组每组3只小鼠，称重，重复3次；

(2)除空白组和TPA组，其他各组涂抹10μL的LYCD，每隔一小时涂抹一次，涂2次；

(3)2h后，除空白组不做处理，丙酮组小鼠耳朵两侧各均匀涂抹8ul丙酮，生理盐水组小鼠耳朵两侧各均匀涂抹10μL生理盐水外，其它各实验组小鼠均按照相同方式涂抹8μL浓度为0.015mM的TPA；

(4)间隔2h后，重复步骤2中的操作，再间隔2h，再次重复步骤2中的操作，共再涂抹3次；

(5)自涂抹TPA后6h，将小鼠脱臼法处死，及时剪下小鼠双耳，并用6mm打孔器分别在同一部位打孔；

(6)称重，以空白组为阴性，将实验组耳片重量与空白组耳片重量的差异作为肿胀度；

肿胀度(w)＝空白耳片重量-实验组耳片重量

(7)抑制率＝(1－给药组肿胀度/对照组的肿胀度)×100％。

结果如图1～2，LYCD对TPA引起的小鼠耳肿胀有显著的抑制作用，其中浓度为8.0mg/mL的LYCD的抑制率最佳，与其他浓度的效果相比存在显著性差异(p<0.0001)。

实施例3

1、取材

取小鼠新鲜组织固定于4％多聚甲酵24h以上。取出组织并整理目的部位，完成后，将组织和对应标签放入脱水盒内。将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。

2、脱水

将上述脱水盒放进吊篮里置于脱水机内依次梯度酒精脱水。75％酒精4h-85％酒精酒精2h-95％酒精2h-90％酒精1h-无水乙醇I30min－无水乙醇II 30min－醇苯5-10min－二甲苯I5～10min－二甲苯II 5～10min－蜡I1h－蜡II 1h－蜡III 1h。

3、包埋

将上述浸好蜡的组织样品置于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，在蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出根据包埋要求放入包埋框并贴上对应的标签。将包埋框于-20℃冻台冷却，待蜡块凝固后从包埋框中取出并修整蜡块。

4、切片

将上述蜡块置于切片机上切片，设置片厚4um进行均匀切片。取组织切片于摊片机40℃温水上展平，用干净载玻片将组织捞起，放入60℃烘箱内烤片。待水烤干、蜡烤化后取出玻片常湿保存备用。

5、脱蜡

将切片依次经过二甲苯I 20min－二甲苯II 20min－无水己醇I10min-无水己醇II 10min 95％酒精5min-90％酒精5min－80％酒精5min－70％酒精5min－蒸馏水洗脱。

6、苏木素－伊红染色

脱蜡后的切片放入Harris苏木素染液中染色3-8min，用自来水冲洗，1％的盐酸和酒精分化数秒，再用自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗干净。切片放入伊红染液中染色1-3min。

7、封片

将切片依次放入95％酒精I5min-95％酒精II 5min-无水乙醇I 5min-无水己醇II5min-二甲苯I 5min－二甲苯II 5min中脱水至透明，将切片从二甲苯拿出来稍瞭干，最后用中性树胶封片。

8、显微镜镜检(图1)，图像采集分析。

结果显示，小鼠耳廓组织切片如图3所示，从图中可看出，空白组的组织并没有明显的变化，其显示的是正常组织的外观，耳廓厚度和角质层没有改变，细胞核与细胞质的比例较小。单独使用致炎剂TPA诱导小鼠耳廓肿胀时，小鼠耳廓的炎症反应非常明显，主要表现在表皮角化过度，角质层明显增厚和炎性细胞浸润增多(细胞固缩)。

如图4，涂抹低剂量和高剂量LYCD对炎症的抑制作用无明显的效果。而4mg/mLLYCD组、4mg/mL LYCD组、8mg/mL LYCD组和10mg/mL NAC组小鼠的耳朵较TPA组有很明显的抑制效果。通过对比发现，8mg/mL LYCD组和10mg/mL NAC组小鼠的耳廓切片表现为更为明显的变化，包括耳廓肿胀程度明显降低(趋于正常组)及细胞核与细胞质的比例明显变小等。

实施例4

免疫组化检测小鼠耳廓组织COX-2和P65表达情况。步骤包括：

1、按照实施例3中步骤1-5制备组织切片。

2、抗原修复

将组织切片放入盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH＝8.0)的修复盒中，置于微波炉内进行抗原修复。此过程中应注意防止缓冲液过度蒸发，造成干片。取出修复盒，待切片自然冷却后置于PBS溶液(pH＝7.4)中在脱色摇床上晃动洗涂，共3次，每次5min。

3、阻断内源性过氧化物酶

将切片置于3％过氧化氨溶液中，室温避光鮮育25min后置于PBS溶液(pH＝7.4)中并在脱色摇床上充分洗洛3次，每次5min。

4、一抗孵育

取出切片，稍甩干，滴加3％BSA溶液室温封闭解育30min，甩掉BSA，加一抗覆盖组织，4℃孵育过夜。

5、二抗孵育

将玻片置于PBS溶液(pH＝7.4)中并在脱色摇床上充分晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后滴加二抗(HRP标记)覆盖组织，室温脾育50min.

6、DAB显色

玻片放入PBS溶液(pH＝7.4)中在脱色摇床上充分摇荡洗洛3次，每次5min。切片稍甩干后滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察控制虽色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

7、细胞核复染

将切片放入Harria苏木素复染3min左右，自来水冲洗，再用1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。

8、脱水封片

将切片依次放入95％酒精I5min-95％酒精II 5min-无水乙醇I 5min-无水己醇II5min-二甲苯I 5min-二甲苯II 5min中脱水至透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，最后用中性树胶封片。

9、最微镜观察，图像采集分析。

利用Image-Pro-plus6.0软件分析免疫组化图片方法：每组内每张切片随机挑选3个100倍视野进行拍照。选取相同的棕黄色作为阳性标准，对每张照片进行统计分析得出每张照片的阳性表达的累积光密度值(IOD)，读取并保存图片中组织的面积(AREA)及IOD/AREA(Mean Density)。

小鼠耳廓组织中COX-2被激活情况如图2。COX-2在炎症反应的病理中有着重要的作用。因此，为了评价LYCD抑制活性，我们取小鼠的耳朵组织，进行IHC所示。从图2中可观察到运用上LYCD进行炎症治疗时，对COX-2的表达均有一定程度的抑制。对比而言，8mg/mL的LYCD有更为明显和最大程度的抑制作用。

小鼠耳廓组织中NF-кB被激活情况如图5～6。据悉，NF-кB在TPA诱导的炎症模型中可调节基因和蛋白的表达。在NF-кB活化的过程中，TPA能够激活NF-кB信号通路，导致NF-кB信号通路中各类炎症因子的含量都会明显地增多，然后通过一系列相关因子的转移和表达，最终导致炎症的产生。单独TPA作用时，小鼠耳廓中NF-кB的阳性表达明显增多，各药物组均对TPA诱导的炎症有一定的抑制作用。通过比较发现，8mg/mL的LYCD组小鼠耳廓中的平均光密度最小，其阳性表达降低最多，可见其明显的抑制作用。

因此，抗氧化物质LYCD和NAC通过阻断氧化应激反应，阻断炎症介质cox-2和p65的表达，发挥抗炎作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。