贯叶连翘次生代谢产物中具有乙酰胆碱酯酶抑制作用化合物及分离制备和用途

摘要

本发明属于医药技术领域，提供了从贯叶连翘次生代谢产物中分离制备的具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的化合物，同时提供了这些化合物的分离制备方法和用途，公开了贯叶连翘次生代谢产物间苯三酚类新化合物1–15的结构、分离纯化、制备方法和结构鉴定，以及对化合物1–15乙酰胆碱酯酶抑制活性的评价。本发明为开发新的乙酰胆碱酯酶抑制剂以及抗阿尔兹海默症药物提供了备选化合物。对于藤黄科植物的综合开发利用具有非常重要的意义。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及化合物1–15的分离制备方法及用途。具体涉及分离纯化过程，结构确证，乙酰胆碱酯酶抑制作用等。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)即老年性痴呆症，是以痴呆为特征的大脑退行性变性疾病，严重影响患者的认知功能、记忆功能、社会生活能力、个人生活能力和情感人格等。随着世界老年人口的急速增长，AD发病人数也逐年增多，现已成为现代社会严重威胁老年人生命的疾病之一。目前虽然针对AD的发病机理和症状开发出各种各样的药物，但是临床上用于治疗AD最成功的药物还是乙酰胆碱酯酶抑制剂(Acetylcholinesterase inhibitors，AChEIs)。

贯叶连翘(Hypericum perforatum)：又名贯叶金丝桃，欧洲名为“St.John’swort”,俗称圣约翰草，系藤黄科金丝桃属多年生草本植物。贯叶连翘在民间已有二千四百余年的药用历史。传统中医药学认为，其性平，味辛苦涩，具有清心明目、舒经活血、止血生肌、解毒消炎、利湿之功效。目前，用贯叶连翘提取物制成的制剂已在欧美大量上市，主要用于治疗抑郁症、甲型和乙型肝炎及艾滋病等。近年来，随着阿尔兹海默病的患者不断的增加，AD已经成为继心脏病和癌症之后危害人类健康的主要疾病之一。但该疾病治疗药物少、疗效不佳，当前研发单一靶点抗AD新药屡屡受挫，亟待新的防治策略。天然产物、特别是特殊三维结构的天然产物是药物开发的重要源泉。近年来，越来越多的药物研发人员开始致力于从药用植物中寻找结构新颖且对乙酰胆碱酯酶有良好抑制活性的化合物。因此，从贯叶连翘中筛选具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的新的天然产物具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的化合物及其分离纯化方法和应用。

本发明的间苯三酚类化合物，其结构式如式(1)；其中英文命名如表(1)。

表(1).对式(1)中化合物1–15的中英文命名：

中文名英文名化合物1圣约翰草素AHyperforatin A化合物232-差向异构圣约翰草素A32-epi-hyperforatin A化合物3圣约翰草素BHyperforatin B化合物4圣约翰草素CHyperforatin C化合物5圣约翰草素DHyperforatin D化合物615-差向异构圣约翰草素D15-epi-hyperforatin D化合物7圣约翰草素EHyperforatin E化合物832-差向异构圣约翰草素E32-epi-hyperforatin E化合物9圣约翰草素FHyperforatin F化合物10圣约翰草素GHyperforatin G化合物11圣约翰草素HHyperforatin H化合物12圣约翰草素IHyperforatin I化合物1315-差向异构圣约翰草素I15-epi-hyperforatin I化合物14圣约翰草素JHyperforatin J化合物15圣约翰草素KHyperforatin K

本发明人通过对药用植物贯叶连翘(Hypericum perforatum)的乙醇提取物进行分离纯化，得到15个新化合物。综合运用多种波谱分析方法和其他手段，确定其为间苯三酚类化合物，具体结构如式(1)所示。通过对化合物1–15的乙酰胆碱酯酶抑制活性评价，发现化合物1–15对乙酰胆碱酯酶均有抑制作用，其中化合物3，5，6，8和9对乙酰胆碱酯酶有良好的抑制作用。

本发明的又一个目的是提供式(1)中所示化合物在制备乙酰胆碱酯酶抑制药物中的应用。

附图说明

图1：化合物2晶体结构；

图2：化合物6晶体结构；

图3：化合物7晶体结构。

具体实施方式

实施例1：化合物1–15的制备和结构鉴定。

(一)如式(1)所示化合物1–15的制备

1.植物信息

本植物的茎叶于2014年8月采摘自中华人民共和国湖北省神农架地区，由华中科技大学张长弓教授鉴定为贯叶连翘(Hypericum perforatum)。植物标本存放于华中科技大学同济医学院药学院天然药物化学与资源评价重点实验室标本室，标本号为HP20140826。

2.提取分离

贯叶连翘的干燥茎叶(105kg)粉碎后用95％乙醇提取3次，每次室温下浸泡4–5天，减压浓缩后得到总浸膏8.3kg。将总浸膏悬浮于水中，用二氯甲烷萃取，最终得到二氯甲烷部位3.8kg。二氯甲烷部位进行硅胶柱层析(100–200目)，石油醚：丙酮梯度洗脱(100:0–0:100)，用TLC检测合并相似的部分，得到7个组分(Ⅰ–Ⅶ)。组分Ⅲ经过MCI柱脱色后，除去色素，再经过反相C₁₈柱层析(甲醇–水，50％–100％)得到8个组分：组分Ⅲ1–Ⅲ8。

其中的组分Ⅲ5再次进行硅胶柱层析，石油醚：丙酮梯度洗脱(30:0–0:1)，最终得到11个组分：Ⅲ5a–Ⅲ5k。其中的Ⅲ5d经过凝胶柱层析以及反相高效液相色谱(HPLC)纯化得到了化合物10，以及通过手性HPLC方法得到了化合物5和6。同时，我们应用与上述相同的方法从另外一个组分Ⅲ5f中分离得到了化合物7和8。之后，我们对组分Ⅲ5g进行了进一步的反相柱层析(甲醇–水，50％–85％)并得到5个组分：Ⅲ5g1–Ⅲ5g5。随后，我们通过半制备HPLC方法从Ⅲ5g3中分离得到化合物1和2，从Ⅲ5g4中分离得到化合物12和13。

而组分Ⅲ6则通过硅胶柱层析，石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱(30:0–0:1)，得到8个组分：Ⅲ6a–Ⅲ6h。其中的组分Ⅲ6d应用和上述Ⅲ5g相同柱层析分离方法得到了化合物3，4，14，和15。而化合物9和11则是通过另一个组分Ⅲ6c经过反相柱层析(甲醇–水，60％–90％)以及半制备HPLC分离得到的。

(二)如式(1)所示化合物1–15的结构鉴定

对化合物1–15的高分辨质谱，紫外光谱，红外光谱，旋光，核磁共振，圆二色谱和X射线单晶衍射等数据进行综合分析，从而确定化合物1–15的结构。

化合物1：Colorless oil；[α]²⁶_D+80(c>3OH)；UV(CH₃OH)λ_max(logε)＝203(4.10)and>3OH)λ_max(Δε)205(-7.45),276(+30.04),305(-13.11)nm；IR(KBr)v_max3440,2973,2929,1722,1643,1616,1446,1383,1236cm^–1；HRESIMS:m/z569.3860[M+H]⁺(calcd>35H₅₃O₆,569.3842).化合物1的核磁共振(NMR)数据如表(2)和表(4)所示。

化合物2：Colorless crystals；mp 163–165℃；[α]¹⁹_D+81(c>3OH)；UV(CH₃OH)λ_max(logε)＝202(4.20)and>3OH)λ_max(Δε)203(-7.31),277(+28.95),305(-12.23)nm；IR(KBr)v_max>–1；HRESIMS:m/z>+(calcd>35H₅₃O₆,569.3842).化合物2的核磁共振(NMR)数据如表(2)和表(4)所示，晶体结构如图(1)所示。

化合物3：Colorless oil；[α]²⁹_D+85(c>3OH)；UV(CH₃OH)λ_max(logε)＝202(4.23)and>3OH)λ_max(Δε)207(-8.84),269(+29.05),299(-7.95)nm；IR(KBr)v_max>–1；HRESIMS:m/z569.3846[M+H]⁺(calcd>35H₅₃O₆,569.3842).化合物3的核磁共振(NMR)数据如表(2)和表(4)所示。

化合物4：Colorless oil；[α]³⁰_D+16(c>3OH)；UV(CH₃OH)λ_max(logε)＝203(4.54)and>3OH)λ_max(Δε)205(-9.69),269(+24.88),299(-11.44)nm；IR(KBr)v_max3434,2974,2929,1725,1648,1616,1445,1384,1234cm^–1；HRESIMS:m/z569.3838[M+H]⁺(calcd>35H₅₃O₆,569.3842).化合物4的核磁共振(NMR)数据如表(2)和表(4)所示。

化合物5：Colorless oil；[α]²⁶_D+12(c>3OH)；UV(CH₃OH)λ_max(logε)＝202(4.41)and>3OH)λ_max(Δε)207(-6.24),275(+17.08),304(-10.51)nm；IR(KBr)v_max3437,2975,2930,1722,1656,1621,1445,1383,1243cm^–1；HRESIMS:m/z605.3828[M+Na]⁺(calcd>36H₅₄O₆Na,605.3818).化合物5的核磁共振(NMR)数据如表(2)和表(4)所示。

化合物6：Colorless crystals；mp 108–110℃；[α]²⁶_D+54(c>3OH)；UV(CH₃OH)λ_max(logε)＝202(4.31)and>3OH)λ_max(Δε)205(-11.40),276(+34.12),305(-14.21)nm；IR(KBr)v_max>–1；HRESIMS:m/z>+(calcd>36H₅₅O₆,583.3999).化合物6的核磁共振(NMR)数据如表(2)和表(5)所示，晶体结构如图(2)所示。

化合物7：Colorless crystals；mp 108–109℃；[α]²⁶_D+66(c>3OH)；UV(CH₃OH)λ_max(logε)＝203(4.42)and>3OH)λ_max(Δε)227(+12.73),248(-4.16),273(+13.80),302(-4.92)nm；IR(KBr)v_max>–1；HRESIMS:m/z>+(calcd>35H₅₃O₆,569.3842)。化合物7的核磁共振(NMR)数据如表(2)和表(5)所示，晶体结构如图(3)所示。

化合物8：Colorless oil；[α]²⁶_D+71(c>3OH)；UV(CH₃OH)λ_max(logε)＝202(4.27)and>3OH)λ_max(Δε)227(+13.92),248(-4.30),273(+14.36),302(-4.76)nm；IR(KBr)v_max>–1；HRESIMS:m/z>+(calcd>35H₅₃O₆,569.3842).化合物8的核磁共振(NMR)数据如表(2)和表(5)所示

化合物9：Colorless oil；[α]²²_D+52(c>3OH)；UV(CH₃OH)λ_max(logε)＝202(4.20)and>3OH)λ_max(Δε)225(+7.40),247(-1.90),271(+9.70),301(-2.86)nm；IR(KBr)v_max>–1；HRESIMS:m/z>+(calcd>33H₄₉O₅,525.3580).化合物9的核磁共振(NMR)数据如表(3)和表(5)所示

化合物10：Colorless oil；[α]²⁹_D+48(c>3OH)；UV(CH₃OH)λ_max(logε)＝202(4.05)and273(3.93)nm；ECD(CH₃OH)λ_max(Δε)227(+6.47),248(-2.63),273(+7.23),302(-2.60)nm；IR(KBr)v_max>–1；HRESIMS:m/z>+(calcd>35H₅₃O₆,569.3842)。

化合物10的核磁共振(NMR)数据如表(3)和表(5)所示。

化合物11：Colorless oil；[α]²⁸_D+34(c>3OH)；UV(CH₃OH)λ_max(logε)＝202(4.10)and>3OH)λ_max(Δε)242(-5.64),276(+15.73),302(-12.03)nm；IR(KBr)v_max>–1；HRESIMS:m/z569.3851[M+H]⁺(calcd>35H₅₃O₆,569.3842).化合物11的核磁共振(NMR)数据如表(3)和表(6)所示

化合物12：Colorless oil；[α]²¹_D+23(c>3OH)；UV(CH₃OH)λ_max(logε)＝202(4.12)and>3OH)λ_max(Δε)243(-4.16),277(+13.37),302(-9.97)nm；IR(KBr)v_max>–1；HRESIMS:m/z591.3660[M+Na]⁺(calcd>35H₅₂O₆Na,591.3662).化合物12的核磁共振(NMR)数据如表(3)和表(6)所示

化合物13：Colorless oil；[α]²¹_D-28(c>3OH)；UV(CH₃OH)λ_max(logε)＝202(4.20)and>3OH)λ_max(Δε)244(-4.79),276(+10.41),301(-10.55)nm；IR(KBr)v_max>–1；HRESIMS:m/z591.3657[M+Na]⁺(calcd>35H₅₂O₆Na,591.3662).化合物13的核磁共振(NMR)数据如表(3)和表(6)所示

化合物14：Colorless oil；[α]²⁸_D+42(c>3OH)；UV(CH₃OH)λ_max(logε)＝202(4.49)and>3OH)λ_max(Δε)242(-4.07),269(+12.90),294(-6.81)nm；IR(KBr)v_max>–1；HRESIMS:m/z569.3860[M+H]⁺(calcd>35H₅₃O₆,569.3842).化合物14的核磁共振(NMR)数据如表(3)和表(6)所示

化合物15：Colorless oil；[α]²⁸_D-10(c>3OH)；UV(CH₃OH)λ_max(logε)＝202(4.35)and>3OH)λ_max(Δε)243(-3.74),270(+8.89),296(-5.05)nm；IR(KBr)v_max>–1；HRESIMS:m/z>+(calcd>35H₅₃O₆,569.3842).化合物15的核磁共振(NMR)数据如表(3)和表(6)所示

表(2).化合物1–8的¹³C>3OD).

表(3).化合物9–15的¹³C>3OD).

表(4).化合物1–5的¹H>3OD；J>

表(5).化合物6–10的¹H>3OD；J>

表(6).化合物11–15的¹H>3OD；J>

实施例2：化合物1–15对乙酰胆碱酯酶的抑制作用。

化合物1–15对乙酰胆碱酯酶的抑制作用是通过Ellman方法确定的，结果如表(7)所示。

表(7).化合物1–15对乙酰胆碱酯酶的抑制作用

实验结论：化合物1–15对乙酰胆碱酯酶均有抑制作用。其中，化合物3，5，6，8，9对乙酰胆碱酯酶有明显的抑制作用，化合物1，4，11，15有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性。