一种大豆耐盐基因GmMYB173及其表达载体和表达载体的应用

摘要

本发明涉及一种大豆耐盐基因GmMYB173及其表达载体和表达载体的应用，提供了一种大豆耐盐基因GmMYB173，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的大豆耐盐基因GmMYB173能够提高大豆的耐盐能力。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种大豆耐盐基因GmMYB173及其表达载体和表达载体的应用。

背景技术

土壤盐渍化是一个全球性的生态问题，全世界接近20％的灌溉土壤受到盐渍化的威胁，且耕地盐渍化状况日趋严峻。其中，我国约有3460万公顷的土地遭受盐渍化危害，约占全国可耕地面积的25％。土壤中高浓度的盐分导致植物生长减缓甚至死亡，是限制作物产量的主要非生物逆境因子之一。

研究表明，土壤中盐胁迫主要是通过Na⁺对植物造成损伤，Na⁺进入细胞后引起过氧化物的积累，过量的活性氧化物会损害蛋白质、核酸以及其它大分子的结构与功能，甚至导致细胞死亡。在正常代谢条件下，细胞内活性氧化物的产生与清除处于动态平衡中。一旦失去平衡，活性氧化物将攻击蛋白质的氨基酸残基。为抵御盐胁迫引起的活性氧化物危害，植物在进化过程中形成了一系列清除活性氧化物的机制，包含酶促和非酶促两个体系，酶促系统包括超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶等；非酶类抗氧化剂主要是一些小分子量的有机物，包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇以及类黄酮等。

类黄酮物质在植物抵御各种逆境胁迫的响应中扮演着非常重要的角色。Yan等(2014)研究表明，大豆类黄酮合成酶通过调控类黄酮物质的代谢，可以提高大豆对盐胁迫的耐受水平。另外在类黄酮生物合成过程中，MYB转录因子起关键调控作用，可以调控合成途径中关键酶基因(如GmF3H,GmCHS,GmCHI和GmFNSII)的表达，本发明发现一种MYB转录因子GmMYB173，对大豆对盐胁迫的耐受水平的提高是正相关的，发明内容如下。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的不足，而提供一种大豆耐盐基因GmMYB173，能够提高大豆的耐盐能力。

本发明提供了一种大豆耐盐基因GmMYB173，核苷酸序列如SEQID No.1所示。

本发明还提供了一种大豆耐盐基因GmMYB173的编码蛋白质，氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。

本发明还提供了上述技术方案提供的耐盐基因GmMYB173的表达载体，包括pDL28-HA-GmMYB173-RFP、pDL28-HA-GmMYB173-59A-RFP、pDL28-HA-GmMYB173-59D-RFP或pDL28-HA-RNAiMYB173-RFP。

本发明还提供了上述方案得到的表达载体在培育抗盐植物中的应用。

本发明提供了一种大豆耐盐基因GmMYB173，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。大豆耐盐基因GmMYB173可降低大豆根系中过氧化物含量，从而提升大豆对盐碱环境的适应能力。根据本发明实施例可知，本发明提供的大豆耐盐基因GmMYB173能够提高大豆的耐盐能力。

附图说明

图1为实验组盐胁迫表型结果，EV表示野生型，OE表示过量表达，59A表示GmMYB173蛋白第59位苏氨酸被突变成甘氨酸(中性类似未被磷酸化)，59D表示GmMYB173蛋白第59位苏氨酸被突变成天冬氨酸(负点类似被磷酸化)、点突变59D(加盐)、点突变59D(不加盐)、KD表示基因沉默，control表示对照组(不加盐处理)，NaCl(+)表示实验组(加盐处理)。

具体实施方式

本发明提供了一种大豆耐盐基因GmMYB173，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明对所述大豆耐盐基因GmMYB173的获取优选采用北京康为世纪生物科技有限公司生产的RNApure Plant Kit和HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis KitHiFiScript cDNA获取得到，所述获取的方法按照北京康为世纪生物科技有限公司销售的试剂盒的使用说明书进行。

本发明还提供了一种大豆耐盐基因GmMYB173的编码蛋白质，氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。

本发明还提供了上述技术方案提供的耐盐基因GmMYB173的表达载体，包括pDL28-HA-GmMYB173-RFP、pDL28-HA-GmMYB173-59A-RFP、pDL28-HA-GmMYB173-59D-RFP或pDL28-HA-RNAiMYB173-RFP。本发明对所述pDL28-HA-RFP的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售商品即可。

在本发明中，所述表达载体pDL28-HA-GmMYB173-59A-RFP中的59A为GmMYB173基因编码蛋白质的第59位的苏氨酸被突变为甘氨酸，此处的甘氨酸的密码子为GCC。所述表达载体pDL28-HA-GmMYB173-59D-RFP中的59D为GmMYB173基因编码蛋白质的第59位的苏氨酸被突变为天冬氨酸，此处的天冬氨酸的密码子为GAC。所述表达载体pDL28-HA-RNAiMYB173-RFP中的RNAiMYB173为GmMYB173的RNA干扰片段。

在本发明中，所述pDL28-HA-GmMYB173-RFP的构建方法包括以下步骤：

1)载体pDL28-HA-RFP经SacⅠ和KpnⅠ双酶切，得到载体酶切产物；

2)克隆载体GmMYB173Tvector经SacⅠ和KpnⅠ双酶切，得到克隆载体酶切产物；

3)将所述步骤1)得到的载体酶切产物和步骤2)得到的克隆载体酶切产物混合、连接，得到pDL28-HA-GmMYB173-RFP；

所述步骤1)和步骤2)没有时间顺序限定。

在本发明中，所述步骤1)中的酶切的体系优选包括：pDL28-HA-RFP 1ug，SacⅠ2ul，KpnⅠ2ul，2ul 10×Kbuffer，2ul 0.1％BSA，双蒸水补足至20ul。所述酶切的条件优选为25～42℃反应1～3h，更优选为30～40℃反应1.5～2.5h，最优选为37℃反应2h。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

在本发明中，采用北京康为世纪生物科技有限公司生产的RNApure Plant Kit和HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit HiFiScript cDNA获取得到GmMYB173基因片段，将GmMYB173基因片段与T载体进行连接，得到克隆载体GmMYB173T vector。在本发明中，所述连接用的体系为：PCR产物GmMYB173基因片段50ng，T载体1ul，双蒸水补足至5ul。所述连接的条件优选包括20～30℃反应20～40min，更优选为22～28℃反应25～30min，最优选为25℃反应30min。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

在本发明中，所述步骤2)中的酶切的体系优选包括：克隆载体1ug，SacI2ul，KpnI2ul，2ul 10×Kbuffer，2ul 0.1％BSA，双蒸水补足至20ul。所述酶切的条件优选为25～42℃反应1～3h，更优选为30～40℃反应1.5～2.5h，最优选为37℃反应2h。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

将所述步骤1)得到的载体酶切产物与步骤2)得到的克隆载体酶切产物混合、连接，得到pDL28-HA-GmMYB173-RFP。在本发明中，所述连接的体系优选包括：GmMYB173Tvector片段200ng，pDL28-HA-RFP片段1ul，T4DNA连接酶1ul，T4DNA缓冲液1ul，用双蒸水补足至10ul。在本发明中，所述连接的条件优选为：10～25℃连接过夜，更优选为14～20℃连接过夜，最优选为16℃连接过夜。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

本发明得到表达载体pDL28-HA-GmMYB173-RFP后，对表达载体pDL28-HA-GmMYB173-RFP进行验证，所述验证的步骤优选包括：以OEMYB173-F和OEMYB173-R为引物进行PCR验证表达载体pDL28-HA-GmMYB173-RFP，电泳如果得到0.9k左右的单一亮带，表明得到表达载体pDL28-HA-GmMYB173-RFP。

在本发明中，所述扩增体系优选为：pDL28-HA-GmMYB173-RFP 0.5ul，OEMYB173-F(10pmol/μL)1ul，OEMYB173-R(10pmol/μL)1ul，Primer STAR Mix 10ul，ddH₂O>

在本发明中，所述OEMYB173-F(SEQ ID No.9)和OEMYB173-R(SEQ ID No.10)的序列如下所示：

OEMYB173-F:CGAGCTCATGTCTCGCGCCTCCTCCOEMYB173-R:GGGGTACCAGCAACACTAATGATGCTTTCTCC。

在本发明中，对所述表达载体pDL28-HA-GmMYB173-RFP的验证还可优选为：采用限制性内切酶SacⅠ和KpnⅠ对表达载体pDL28-HA-GmMYB173-RFP进行双酶切，所述酶切后对得到的酶切产物进行电泳，如果电泳得到0.8k和10k左右两条亮带，表明得到表达载体pDL28-HA-GmMYB173-RFP。

在本发明中，所述双酶切的体系优选为：包括pDL28-HA-GmMYB173-RFP1ug，SacⅠ2ul，KpnⅠ2ul，2ul 10×Kbuffer，2ul 0.1％BSA，双蒸水补足至20ul。所述双酶切的条件优选为25～42℃反应1～3h，更优选为30～40℃反应1.5～2.5h，最优选为37℃反应2h。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

在本发明中，所述表达载体pDL28-HA-GmMYB173-59A-RFP和表达载体pDL28-HA-GmMYB173-59D-RFP的构建方法优选包括以下步骤：

1)以克隆载体GmMYB173T vector为模板，分别以MYB173S59A-F和MYB173S59A-R引物对、MYB173S59D-F和MYB173S59D-R引物对进行循环扩增，分别得到MYB173S59A扩增产物和MYB173S59D扩增产物；

2)将所述步骤1)得到的MYB173S59A扩增产物和MYB173S59D扩增产物分别与T载体进行连接，得到MYB173S59A连接产物和MYB173S59D连接产物；

3)将所述步骤2)得到的MYB173S59A连接产物和MYB173S59D连接产物分别经SacⅠ和KpnⅠ双酶切，得到MYB173S59A片段和MYB173S59D片段；

4)将载体pDL28-HA-RFP经SacⅠ和KpnⅠ双酶切，得到pDL28-HA-RFP片段；

5)将所述步骤3)得到的MYB173S59A片段和MYB173S59D片段分别与步骤4)得到的pDL28-HA-RFP片段进行连接，分别得到表达载体pDL28-HA-GmMYB173-59A-RFP和表达载体pDL28-HA-GmMYB173-59D-RFP；

所述步骤3)和步骤4)没有时间顺序限定。

在本发明中，所述步骤1)中扩增用的体系优选包括模板GmMYB173T vector克隆载体80ng，引物各1ul，高保真酶2ul，用双蒸水补足至20ul。所述循环扩增的程序优选为：94℃5min，94℃30sec，53℃30sec，30个循环，72℃1min，72℃10min，4℃保存。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

在本发明中，所述MYB173S59A-F(SEQ ID No.5)和MYB173S59A-R(SEQ ID No.6)、MYB173S59D-F(SEQ ID No.7)和MYB173S59D-R(SEQ ID No.8)的序列优选如下所示：

MYB173S59A-F:GTCGTCGGCGGCGGCGTAACCGG

MYB173S59A-R:CCGGTTACGCCGCCGCCGACGAC

MYB173S59D-F:GGCGTCGTCGGCGTCGGCGTAACCGGCG

MYB173S59D-R:CGCCGGTTACGCCGACGCCGACGACGCC。

在本发明中，采用北京康为世纪生物科技有限公司生产的RNApure Plant Kit和HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit HiFiScript cDNA获取得到GmMYB173基因片段，将GmMYB173基因片段与T载体进行连接，得到克隆载体GmMYB173T vector。在本发明中，所述连接用的体系为：PCR产物GmMYB173基因片段50ng，T载体1ul，双蒸水补足至5ul。所述连接的条件优选包括20～30℃反应20～40min，更优选为22～28℃反应25～30min，最优选为25℃反应30min。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

得到扩增产物后，将MYB173S59A扩增产物和MYB173S59D扩增产物分别与T载体进行连接，得到MYB173S59A连接产物和MYB173S59D连接产物。所述连接用的体系优选为PCR产物GmMYB173基因片段45ng，T载体1ul，双蒸水补足至5ul。连接的条件优选为25℃反应30min。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

得到MYB173S59A连接产物和MYB173S59D连接产物后，将所述MYB173S59A连接产物和MYB173S59D连接产物分别经SacⅠ和KpnⅠ双酶切，得到MYB173S59A片段和MYB173S59D片段。在本发明中，所述酶切的体系优选为克隆载体1ug，SacⅠ2ul，KpnⅠ2ul，2ul 10×Kbuffer，2ul 0.1％BSA，双蒸水补足至20ul。所述酶双切的条件优选为37℃反应2h。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

在本发明中，所述载体pDL28-HA-RFP经SacⅠ和KpnⅠ双酶切，得到pDL28-HA-RFP片段。在本发明中，所述双酶切用的体系优选为：载体pDL28-HA-RFP 1ug，SacⅠ2ul，KpnⅠ2ul，2ul 10×Kbuffer，2ul 0.1％BSA，双蒸水补足至20ul。在本发明中，所述双酶切的条件优选为25～42℃反应1～3h，更优选为30～40℃反应1.5～2.5h，最优选为37℃反应2h。本发明对上述试剂的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

在本发明中，将得到的MYB173S59A片段和MYB173S59D片段分别与pDL28-HA-RFP片段混合、连接，得到表达载体pDL28-HA-GmMYB173-59A-RFP和表达载体pDL28-HA-GmMYB173-59D-RFP。

在本发明中，所述MYB173S59A片段和MYB173S59D片段分别与pDL28-HA-RFP片段连接用的体系优选包括：MYB173S59A片段或MYB173S59D片段200ng，pDL28-HA-RFP片段1ul，T4DNA连接酶1ul，T4DNA缓冲液1ul，双蒸水补足至10ul。所述连接的条件优选为16℃连接过夜。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的试剂即可。

在本发明中，所述表达载体pDL28-HA-RNAiMYB173-RFP的构建方法优选包括以下步骤：

1)采用软件(Oligoengine Workstation 2)找出GmMYB173完整序列中的沉默片段，所述沉默片段如SEQ ID No.3所示，以所述沉默片段(即为GmMYB173-1正向链序列)为模版设计得到RNAiMYB173引物，再以SEQ ID No.3序列为模版进行循环扩增，得到RNAiMYB173序列；

2)将所述步骤1)得到的RNAiMYB173序列与T载体连接，得到RNAiMYB173-T载体；

3)采用XbaⅠ和HindⅢ酶切步骤2)得到的RNAiMYB173-T载体，得到RNAiMYB173-T酶切产物，采用XbaⅠ和HindⅢ酶切PKANNBAL载体，得到PKANNBAL酶切产物，将RNAiMYB173-T酶切产物、PKANNBAL酶切产物与GmMYB1731号正向链用T4载体连接，得到pKANNIBAL-MYB173-1；

4)采用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切所述步骤3)得到的pKANNIBAL-MYB173-1，得到pKANNIBAL-MYB173-1酶切产物，采用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切步骤2得到的RNAiMYB173-T载体，得到RNAiMYB173-T载体酶切产物(即为GmMYB1732号反向链)，，将pKANNIBAL-MYB173-1酶切产物和RNAiMYB173-T载体酶切产物与用T4载体连接，得到PKANNIBAL-RNAi-MYB173(此时，GmMYB1731号正向链和GmMYB1732号反向链因为酶切所用的限制酶不同，已经形成反向互补)；

5)采用SalⅠ和SpeⅠ酶切所述步骤4)得到的PKANNIBAL-RNAi-MYB173，得到PKANNIBAL-RNAi-MYB173酶切产物，采用SalⅠ和SpeⅠ酶切pDL28-HA-RFP，得到pDL28-HA-RFP酶切产物，将PKANNIBAL-RNAi-MYB173酶切产物、pDL28-HA-RFP酶切产物与T4载体连接，得到表达载体pDL28-HA-RNAiMYB173-RFP；

所述MYB1731号正向链的序列如SEQ ID No.3所示；

所述MYB1732号反向链的序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明中，所述步骤1)中的RNAiMYB173引物的序列如下：

RNAiMYB173-F(SEQ ID No.11):

CGGGGTACCAAGCTTAACCTCTCACAGTACGAGCATCC

RNAiMYB173-R(SEQ ID No.12):

CCGGAATTCTCTAGAGGCACATTATGTTTTTCCACG。

在本发明中，所述步骤1)中循环扩增用的体系优选为pDL28-HA-GmMYB173-RFP50ng，RNAiMYB173-F(10pmol/μL)1ul，RNAiMYB173-R(10pmol/μL)1ul，PrimerSTARMix10ul，ddH₂O>

在本发明中，所述RNAiMYB173序列与T载体连接用的体系优选为PCR产物GmMYB173基因片段50ng，T载体1ul，双蒸水补足至5ul。所述连接的条件优选为25℃30min。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

在本发明中，所述步骤3)中的酶切用的体系优选为克隆载体1号正向链1ug或pKANNIBAL载体1ugKpnⅠ2ul和EcoRⅠ2ul，2ul 10×Kbuffer，2ul 0.1％BSA，双蒸水补足至20ul。最优选为37℃反应2h。所述酶切产物，MYB1731号正向链与pKANNIBAL片段连接用的体系优选为MYB1731号正向链片段100ng，pKANNIBAL片段100ng，T4DNA连接酶1ul，T4DNA缓冲液1ul，双蒸水补足至10ul。。所述连接的条件优选为16℃连接过夜，得到pKANNIBAL-MYB173-1载体。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

在本发明中，所述MYB1731号正向链的序列如SEQ ID No.3所示。

在本发明中，所述步骤4)中的酶切用的体系优选为载体各1ug，XbaI、HindⅢ酶各2ul，2ul 10×M buffer，双蒸水补足至20ul。所述酶切的条件优选为37℃酶切2h。所述酶切产物，MYB1732号反向链与pKANNIBAL-MYB173-1载体，T4连接用的体系优选为MYB1732号反向链片段和pKANNIBAL-MYB173-1载体各100ng，T4DNA连接酶1ul，T4DNA缓冲液1ul，双蒸水补足至10ul。所述连接的条件优选为16℃连接过夜。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

在本发明中，所述MYB1732号反向链的序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了上述方案得到的表达载体在培育抗盐植物中的应用。在本发明中，所述植物优选为豆类植物。

下面结合实施例对本发明提供的种大豆耐盐基因GmMYB173及其表达载体进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

GmMYB173基因的克隆：

1.1大豆总RNA的提取：

1.1.1提前在研钵中倒入液氮，从大豆中剪取新鲜根样100mg直接放在研磨中研磨，得到粉末，将粉末移至事先准备好的1.5ml Ep管中，Ep管中加入β-巯基乙醇，β-巯基乙醇的体积是粉末体积的1％，再加入600ul的康为世纪公司RLC或者RL。

1.1.2涡旋1min，再冰上静置5min，使样品充分裂解。

1.1.3将上述得到的裂解液缓慢转移至2mL离心管，在4℃、12000rpm的条件下离心2min；

1.1.4准备新的1.5ml RNase-Free离心管，将步骤3)中的滤液转入离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，迅速振荡混匀。

1.1.5)将1.1.4中的混合液装入2mL Spin Column管，12000rpm离心5min后弃滤液，并将吸附柱重新放回离心管中。

1.1.6向吸附柱加入350ul BufferRW1，在4℃、12000rpm的条件下离心1min，弃滤液，并将吸附柱重新放回离心管中。

1.1.7加入80μl DNase I混合液，DNase I混合液的组分为52ul RNase-FreeWater、8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNaseI，5000rpm离心5min混匀，20～30℃孵育15min。

1.1.8向吸附柱加入350ul BufferRW1，在4℃、12000rpm的条件下离心1min，弃滤液，并将吸附柱重新放回离心管中。

1.1.9向吸附柱加入500ul BufferRW2，在4℃、12000rpm的条件下离心1min，弃滤液，并将吸附柱重新放回离心管中。

1.1.10向吸附柱加入500ul Buffer RW2，在4℃、12000rpm的条件下离心1min，弃滤液，并将吸附柱重新放回离心管中。

1.1.11在4℃、12000rpm的条件下空转离心1min，将吸附柱置于一个新的1.5mlRNase-Free离心管中，室温吹干10min。

1.1.12向吸附柱加入30RNase-FreeWater，室温放置1分钟，在4℃、12000rpm的条件下离心1分钟，得到RNA模版，保存于-80℃备用。

1.2 cDNA反转录

1.2.1将PrimerMix、dNTPMix、DTT、5×RTBuffer和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用，待其溶解后，将RNA模板和反转录酶取出放置于冰上。

1.2.2反应体系为dNTPMix4ul，PrimerMix2ul，RNA模版5ug，5XRTBuffer4ul，DTT2ul，反转录酶1ul，RNAse-Free Water补足20ul。

1.2.3将1.1.2中的试剂加入到Ep管后，将Ep管放在掌上离心机上25℃下离心10秒左右。

1.2.4在PCR仪上42℃孵育2h，85℃孵育5min。反应结束后，将Ep管放在掌上离心机上离心10秒左右。置于冰上冷却，得到cDNA模版，-20℃保存备用。

1.3目的基因的克隆

1.3.1以1.2.2中反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增体系为：cDNA模版0.5ul，OEMYB173-F(10pmol/μL)1ul，OEMYB173-R(10pmol/μL)1ul，Primer STARMix10ul，ddH₂O>

OEMYB173-F:CGAGCTCATGTCTCGCGCCTCCTCCOEMYB173-R:GGGGTACCAGCAACACTAATGATGCTTTCTCC。

1.3.2扩增的程序为：94℃5min，94℃30sec，53℃30sec，38个循环，72℃1min，72℃10min，4℃保存。

1.3.3对PCR产物进行电泳，回收琼脂糖凝胶。

1.4GmMYB173Tvector克隆载体的构建

1.4.1回收目的基因DNA片段

1.4.1.1在紫外灯下将目的片段从琼脂糖凝胶中切下，放入离心管中，在天平上称重并记录。

1.4.1.2用无菌枪头将切下的凝胶块捣碎，加入3倍体积的DE-A溶液，75℃水浴6～8min，间隔两分钟轻轻地上下颠倒几下，直至胶块完全溶解。

1.4.1.3凝胶溶解后，将离心管从水浴锅中取出，冷却至室温，加入1.5倍体积DE-B溶液，上下颠倒混匀。

1.4.1.4吸取混合液，转入含有吸附柱的2ml收集管中，在25℃、12000rpm的条件下离心2min，弃滤液，将吸附柱放回收集管中。

1.4.1.5向吸附管中加入500μl BufferW1，在25℃、12000rpm的条件下离心1min，弃滤液，并将吸附柱重新放回离心管中。

1.4.1.6再向吸附管中加入700μl BufferW2，在25℃、12000rpm的条件下离心1min，弃滤液，并将吸附柱重新放回离心管中。

1.4.1.7再向吸附管中加入700μl BufferW2，在25℃、12000rpm的条件下离心1min，弃滤液，并将吸附柱重新放回离心管中。

1.4.1.8在25℃12000rpm的条件下空转离心1min，将1.4.1.7中的吸附柱置于一个新的1.5ml RNase-Free离心管中，室温吹干10min。

1.4.1.9向离心管中加入10μl洗脱液，室温放置1min，在25℃、12000rpm的条件下离心1min，得到GmMYB173PCR片段保存于-20℃。

1.4.2 GmMYB173-Tvector载体连接和转化

采用-BluntZero Cloning Kit试剂盒将回收纯化的1.4.1.9中得到的PCR产物与-BluntZero Cloning载体进行连接，连接体系为：PCR产物1μl，-BluntZero CloningVector 1μl，ddH₂O>

上述反应在200μL的PCR管中进行，用手指轻轻拨动，将EP管放在掌上离心机上离心25℃下10秒左右，在PCR仪上25℃孵育30min，反应结束后置于冰上，然后准备转化DH5α感受态细胞，转化DH5α感受态细胞的步骤如下：

1.4.2.1将DH5α感受态细胞从-80℃冰箱取出置于冰上融化5min，作好标记。将上述连接体系5μl全部加入到感受态细胞，得到混合液，将混合液冰置30min；

1.4.2.2将冰置后的混合液置于42℃水浴锅中孵育90s，然后置于冰上10min；

1.4.2.3加入37℃的400μLLB液体培养液(不含卡那霉素)，37℃、200rpm复苏培养60min；

1.4.2.4准备LB+Kan(终浓度50ug/L)固体培养基平皿，将菌液在25℃下、4000rpm的条件下离心1min，去掉400μL上清液，其余上清用来悬浮菌体，涂布，将培养皿倒置于37℃培养箱12～14h。待第二天克隆菌落长出后，挑取3个克隆菌落，用引物M13-F/R(序列M13R：CAG GAAACAGCTATG ACC；M13F：TGTAAAACGACG GCCAGT)做PCR循环扩增，扩增程序与1.3.2相同。电泳得到0.8k左右的片段，回收片段后送去上海生工测序，将测序正确的阳性克隆的单菌落用3～5ml LB液体培养基扩大培养，第二天提取质粒。

1.4.3质粒DNA的提取

1.4.3.1挑取测序正确的阳性克隆DMI3-T vector，在3～5ml LB+Kan 50mg/LLB液体培养基中过夜培养；

1.4.3.2在25℃、6200rpm的条件下离心3min，来收集菌体，向留有菌体的离心管中加入250μl Buffer S1(在步骤1.4.3.2前加入1％RNaseA)，用移液枪反复吹打，充分悬浮菌体，转至另一1.5ml EP离心管中。

1.4.3.3再向1.5ml EP离心管中加入250μl Buffer S2，轻轻地上下颠倒混匀4～6次，使菌体裂解。

1.4.3.4在5min内再向离心管中加入350μl Buffer S3，迅速上下颠倒6～10次，使菌液充分混匀，有白色絮状沉淀出现，在25℃、12000rpm的条件下离心10min。

1.4.3.5吸取上清液，转入含有吸附柱的2ml收集管中，在25℃、12000rpm的条件下离心1min，弃滤液，将吸附柱放回收集管中。

1.4.3.6再向吸附管中加入500μl BufferW1，在25℃、12000rpm的条件下离心1min，弃滤液，并将吸附柱重新放回离心管中。

1.4.3.7再次向吸附管中加入700μl BufferW2，在25℃、12000rpm的条件下离心1min，弃滤液，并将吸附柱重新放回离心管中。

1.4.3.8向吸附管中加入700μl BufferW2，在25℃、12000rpm的条件下离心1min，弃滤液，并将吸附柱重新放回离心管中。

1.4.3.9在25℃、12000rpm的条件下空转离心1min，将吸附柱置于另一1.5mlRNase-Free离心管中，室温吹干10min。

1.4.3.10向离心管中加入50μl洗脱液，放置1min，在25℃、12000rpm的条件下离心1min，得到GmMYB173基因，将GmMYB173基因保存于-20℃。

实施例2

含GmMYB173基因的真核表达载体构建

2.1.1过表达载体构建

2.1.1.1载体pDL28-HA-RFP(内含CAM35S启动子)经SacⅠ和KpnⅠ双酶切，电泳，回收10k片段，得到酶切产物；酶切体系为载体1ug，SacⅠ2ul，KpnⅠ2ul，2ul 10×Kbuffer，2ul0.1％BSA，双蒸水补足至20ul；酶切条件为37℃反应2h。

2.1.1.2克隆载体GmMYB173Tvector经SacⅠ和KpnⅠ双酶切，电泳，回收0.8k左右片段，得到酶切产物；酶切体系为克隆载体1ug，SacⅠ2ul，KpnⅠ2ul，2ul10×Kbuffer，2ul0.1％BSA，双蒸水补足至20ul；酶切条件为37℃反应2h。

2.1.1.3将2.1.1.1中的酶切产物和2.1.1.2中的酶切产物混合后，16℃连接过夜，得到质粒pDL28-HA-GmMYB173-RFP，转再化至大肠杆菌，挑选阳性克隆；连接体系为：GmMYB173Tvector片段7ul，pDL28-HA-RFP片段1ul，T4DNA连接酶1ul，T4DNA缓冲液1ul。

2.1.1.4以OEMYB173-F和OEMYB173-R为引物进行PCR验证质粒pDL28-HA-GmMYB173-RFP，电泳得到0.9k左右的单一亮带。限制性内切酶SacⅠ和KpnⅠ进行双酶切验证质粒pDL28-HA-GmMYB173-RFP，电泳得到0.8k和10k左右两条亮带。

2.2.1点突变载体构建

2.2.1.1以克隆载体GmMYB173Tvector为模板，分别以MYB173S59A-F和MYB173S59A-R、MYB173S59D-F和MYB173S59D-R为引物进行循环扩增，扩增体系为：GmMYB173T vector模板0.5ul，分别以MYB173S59A-F和MYB173S59A-R、MYB173S59D-F和MYB173S59D-R(10pmol/μL)1ul，OEMYB173-R(10pmol/μL)1ul，高保真酶10ul，补足ddH₂O至20ul。

。扩增的程序为：94℃5min，94℃30sec，53℃30sec，30个循环，72℃1min，72℃10min，4℃保存。上述引物的序列如下：

MYB173S59A-F:GTCGTCGGCGGCGGCGTAACCGG

MYB173S59A-R:CCGGTTACGCCGCCGCCGACGAC

MYB173S59D-F:GGCGTCGTCGGCGTCGGCGTAACCGGCG

MYB173S59D-R:CGCCGGTTACGCCGACGCCGACGACGCC

PCR结束后进行电泳，回收0.8k左右片段；体系PCR产物1μl，-BluntZeroCloningVector 1μl，ddH₂O>

2.2.1.2测序结果反馈后，软件DNAMAN比对序列，测序正确的点如1.2.4摇菌培养，如1.3提取质粒，再双酶切，酶切的体系优选包括载体1ug，SacI 2ul，KpnI 2ul，2ul10ⅹKbuffer，2ul 0.1％BSA，双蒸水补足至20ul；酶切的条件优选wield37℃酶切2h。得到点突变片段，电泳，回收0.8k片段。

2.2.1.3载体pDL28-HA-RFP经SacI和KpnI双酶切，得到pDL28-HA-RFP片段，酶切体系：载体1ug，SacI2ul，KpnI2ul，缓冲液2ul，双蒸水补足至20ul，酶切条件为：37℃反应2h。酶切后进行电泳，回收10k片段。

2.2.1.4将2.2.1.2中的点突变片段和2.2.1.3中的酶切产物轻轻混合后16℃连接过夜，连接体系为：点突变片段7ul，pDL28-HA-RFP片段1ul，T4DNA连接酶1ul，T4DNA缓冲液1ul。连接后转化至大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆。

构成质粒命名：pDL28-HA-GmMYB173-59A-RFP，pDL28-HA-GmMYB173-59D-RFP。

2.1.2农杆菌k599转化

2.1.2.1将k599感受态细胞从-80℃冰箱取出置于冰上融化5min，作好标记。将质粒pDL28-HA-GmMYB173-RFP、pDL28-HA-GmMYB173-59A-RFP，pDL28-HA-GmMYB173-59D-RFP分别取1ug加入到100ul感受态细胞，冰置30min。

2.1.2.2将感受态细胞置于液氮中孵育1min，37℃水浴锅中孵育2min，重复此操作一次，然后置于冰上10min。

2.1.2.3再加入37℃的400μLLB液体培养液(不含kan抗生素)，在37℃、200rpm的条件下复苏培养60min，得菌液。

2.1.2.4准备LB+Kan 50mg/L固体培养基平皿，将菌液在室温、4000rpm离心1min，去掉400μL上清液，其余约100ul上清用来悬浮菌体，然后全部涂布在固体培养基平皿上，将培养皿倒置于37℃培养箱12～14h，挑点，用M13F/R引物PCR循环扩增进行验证，电泳得到0.9k左右单一条带即验证正确，命名为k599-pDL28-HA-GmMYB173-RFP，用4ml LB(含50mg/LKan)液体培养基摇菌，在37℃、220rpm的条件下培养16h。培养后加入1ml二甲亚砜，分装，-80℃保存。

2.3.1基因沉默载体构建

2.3.1.1用软件(Oligoengine Workstation2)找出GmMYB173完整序列中的沉默片段，序列如GmMYB173-1正向链序列所示；

2.3.1.2设计RNAi引物，PDK intron是形成发夹结构的重要片段，故从PDK两段选取合适的酶切位置，将两段沉默片段连入，分别以HindⅢ/Xba I(这两个酶切位点在PDKintron右边，顺序是HindⅢ到Xba I，设计1号正向链)和Kpn I/EcoR(这两个酶切位点在PDKintron左边，顺序是EcoR I到Kpn I，设计2号反向链)构入pKANNIBAL载体中，两个方向相反的片段被PDKintron隔开，转录后形成发卡结构。

设计引物：

RNAiMYB173-F:CGGGGTACCAAGCTTAACCTCTCACAGTACGAGCA TCC KpnI HindⅢ

RNAiMYB173-R:CCGGAATTCTCTAGAGGCACATTATGTTTTTCCACG EcoRI XbaⅠ

2.3.1.3以RNAiMYB173-F和RNAiMYB173-RPCR循环扩增获取RNAi序列，方法见1.3.2

2.3.1.4构建RNAiMYB173-T载体，转化，测序，提质粒，方法见1.4；

2.3.1.5先插入1号正向链，用XbaI、HindⅢ酶切RNAiMYB173-T载和PKANNBAL载体，载体各1ug，XbaI、HindⅢ酶各2ul，2ul 10×Mbuffer，双蒸水补足至20ul，37℃酶切2h。胶回收，再进行T4连接，验证成功后，将连接后的载体命名为pKANNIBAL-MYB173-1；

2.3.1.6再插入2号反向链，以正确的pKANNIBAL-MYB173-1为模板，用KpnI和EcoRI酶切RNAiMYB173-T载和pKANNIBAL-MYB173-1载体，载体各1ug，KpnI和EcoRI酶各2ul，2ul10×Mbuffer，双蒸水补足至20ul,37℃酶切2h。胶回收，再T4连接，验证成功后，将连接后的载体命名为PKANNIBAL-RNAi-MYB173；

2.3.1.7用限制酶SalI、SpeI将pKANNIBAL-RNAi-MYB173和表达载体pDL28-HA-RFP酶切，所述酶切的体系优选包括载体1ug，SalI 2ul，SpeI 2ul，2ul Mbuffer，双蒸水补足至20ul；所述酶切的条件优选为37℃酶切2h。胶回收，再T4连接，验证成功后，将连接后的载体命名pDL28-HA-RNAiMYB173-RFP；

2.3.1.8按照2.1.2转化质粒pDL28-HA-RNAiMYB173-RFP，涂板，挑点，验证正确，如2.1.1.3。命名k599-pDL28-HA-RNAiMYB173-RFP，用LB+Kan(终浓度50ug/ml)液体培养基摇菌，-80℃保存。

实施例3

大豆毛状根转化：

1)在含kan的LB板上划线活化农杆菌k599，活化条件为30℃培养48h左右；按立白漂白水与无菌水的体积比为1:2配置混合液，加入到含有50颗完整饱满的大豆的50ml离心管中，使大豆完全浸没于混合液中，水平放置于超净工作台中处理5min，用无菌水清洗大豆5次，其中第4次清洗时，侧放5min。清洗结束后，将大豆平铺在加入滤纸与无菌水的方皿中，无菌水的加入量能够使滤纸湿润无液体流动，铺完一层后，在大豆上方再放置滤纸，滤纸的处理同上，上下两层滤纸每层各放置15～20颗大豆，在恒温培养箱中25～28℃暗培养48h；

2)大豆侵染：

配制FM固体培养基：配置FM固体培养基，高温高压灭菌，冷却后倒板，备用，平皿的直径为10cm。

切根：切去新生的大豆根，去除种皮，再沿子叶方向将子叶节对半切，将子叶节部分划伤，共划伤5～7处；

侵染：将农杆菌涂抹到子叶节伤口部分，将已经侵染的大豆置于FM培养基上，每板10～12颗，在25℃、50lux光照的条件下培养8d后，将大豆转移到生根培养基上，生根培养基为：FM固体培养基+1.5％蔗糖+头孢霉素(终浓度为50ug/ml)；

3)阳性根筛选：体式荧光显微镜观察阳性根，保留带红色荧光的阳性根，切除不带荧光的非阳性根，阳性苗加水保湿过夜；

4)大豆种植：采用10*10的塑料方形花盆，加入满盆的体积比为1:1的蛭石和珍珠盐的混合土，每盆种1棵阳性苗，再加入200ml FM液体培养基。每种转基因苗都需要2种处理样(加盐、不加盐)，每种处理样5个重复；

5)盐胁迫处理：花盆中土壤变干后，大豆加盐组每组浇100ml(200mM)的氯化钠溶液，不加氯化钠溶液组加入等量的单蒸水，一共浇两次，每次间隔3～5d；

6)收样：盐处理结束后，收集各实验组大豆根，共有野生型EV(加盐)、野生型EV(不加盐)、过表达OE(加盐)、过表达OE(不加盐)、过表达点突变59A(加盐)、过表达点突变59A(不加盐)、过表达点突变59D(加盐)、过表达点突变59D(不加盐)、基因敲低KD(加盐)、基因敲低KD(不加盐)10组，结果见图1。

对各实验组根样称重，各实验组单株根样平均鲜重见表1：

表1单株根样平均鲜重

从表1的结果中可以得出，经过盐处理的大豆各实验组均受到不同程度的盐胁迫，生物量不同程度降低；基因GmMYB173的过量表达，实验组的根样鲜重是野生型加盐组的1.26倍，是基因敲低组的2.30倍；其中模拟磷酸化的实验组(59D)的生物量比其他实验组要高，是野生型加盐组的1.77倍，基因敲低加盐组的3.23倍，其耐盐胁迫能力要明显高于其他组。

由以上实施例可知，本发明提供的大豆耐盐基因GmMYB173能够提高大豆的耐盐能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州师范大学

<120> 一种大豆耐盐基因GmMYB173及其表达载体和表达载体的应用

<130> 2017年04月05日

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtctcgcg cctcctccgc cgcagattcc gccgcctccg gtgagatcat actgttcgga 60

gtcagagtcg tcgtcgattc catgaggaag agcgtcagca tgagcaacct ctcacagtac 120

gagcatcctc aagacggcag caacaacaaa gacgctctcg ccgccggtta cgcctccgcc 180

gacgacgccg ctcctcagaa ctccggccgc ctccgggagc gcgagcgaaa gcgaggagtt 240

ccgtggacgg aggaagagca caagctgttt ttggttggat tgcagaaggt agggaaaggt 300

gattggagag gaatctccaa aaactacgtc aaaacgcgaa cgccaacgca ggttgcgagc 360

catgctcaga agtactttct ccgacgaagc aacctcaatc gccgtcgccg tagatccagc 420

ctctttgaca tcaccaccga cacggtctct gcaattccaa tggagggaga acaggtccag 480

aatcaagaca cgctgtctca ttcacaacaa caatcaccct tgtttcctgc tgaaactagc 540

aaaatcaatg ggtttccaat gatgccagtg tatcagtttg ggtttggttc ttctggagtg 600

atttcagtcc aaggtggcaa tggaaaccca atggaagaac tcactctggg acaaggaaac 660

gtggaaaaac ataatgtgcc aaacaaggtc tctacagtgt ctgatatcat caccccgagt 720

tcttctagtt ctgccgttga cccaccgaca ctgtccctgg ggctatcctt ttcatctgac 780

caaagacaga catcatcaag acattcagct ttacatgcca tacaatgttt cagcaatgga 840

gaaagcatca ttagtgttgc ttga 864

<210> 2

<211> 287

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Arg Ala Ser Ser Ala Ala Asp Ser Ala Ala Ser Gly Glu Ile

1 5 1015

Ile Leu Phe Gly Val Arg Val Val Val Asp Ser Met Arg Lys Ser Val

202530

Ser Met Ser Asn Leu Ser Gln Tyr Glu His Pro Gln Asp Gly Ser Asn

354045

Asn Lys Asp Ala Leu Ala Ala Gly Tyr Ala Ser Ala Asp Asp Ala Ala

505560

Pro Gln Asn Ser Gly Arg Leu Arg Glu Arg Glu Arg Lys Arg Gly Val

65707580

Pro Trp Thr Glu Glu Glu His Lys Leu Phe Leu Val Gly Leu Gln Lys

859095

Val Gly Lys Gly Asp Trp Arg Gly Ile Ser Lys Asn Tyr Val Lys Thr

100 105 110

Arg Thr Pro Thr Gln Val Ala Ser His Ala Gln Lys Tyr Phe Leu Arg

115 120 125

Arg Ser Asn Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ser Leu Phe Asp Ile

130 135 140

Thr Thr Asp Thr Val Ser Ala Ile Pro Met Glu Gly Glu Gln Val Gln

145 150 155 160

Asn Gln Asp Thr Leu Ser His Ser Gln Gln Gln Ser Pro Leu Phe Pro

165 170 175

Ala Glu Thr Ser Lys Ile Asn Gly Phe Pro Met Met Pro Val Tyr Gln

180 185 190

Phe Gly Phe Gly Ser Ser Gly Val Ile Ser Val Gln Gly Gly Asn Gly

195 200 205

Asn Pro Met Glu Glu Leu Thr Leu Gly Gln Gly Asn Val Glu Lys His

210 215 220

Asn Val Pro Asn Lys Val Ser Thr Val Ser Asp Ile Ile Thr Pro Ser

225 230 235 240

Ser Ser Ser Ser Ala Val Asp Pro Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Ser

245 250 255

Phe Ser Ser Asp Gln Arg Gln Thr Ser Ser Arg His Ser Ala Leu His

260 265 270

Ala Ile Gln Cys Phe Ser Asn Gly Glu Ser Ile Ile Ser Val Ala

275 280 285

<210> 3

<211> 575

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aacctctcac agtacgagca tcctcaagac ggcagcaaca acaaagacgc tctcgccgcc 60

ggttacgcct ccgccgacga cgccgctcct cagaactccg gccgcctccg ggagcgcgag 120

cgaaagcgag gagttccgtg gacggaggaa gagcacaagc tgtttttggt tggattgcag 180

aaggtaggga aaggtgattg gagaggaatc tccaaaaact acgtcaaaac gcgaacgcca 240

acgcaggttg cgagccatgc tcagaagtac tttctccgac gaagcaacct caatcgccgt 300

cgccgtagat ccagcctctt tgacatcacc accgacacgg tctctgcaat tccaatggag 360

ggagaacagg tccagaatca agacacgctg tctcattcac aacaacaatc acccttgttt 420

cctgctgaaa ctagcaaaat caatgggttt ccaatgatgc cagtgtatca gtttgggttt 480

ggttcttctg gagtgatttc agtccaaggt ggcaatggaa acccaatgga agaactcact 540

ctgggacaag gaaacgtgga aaaacataat gtgcc 575

<210> 4

<211> 575

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggcacattat gtttttccac gtttccttgt cccagagtga gttcttccat tgggtttcca 60

ttgccacctt ggactgaaat cactccagaa gaaccaaacc caaactgata cactggcatc 120

attggaaacc cattgatttt gctagtttca gcaggaaaca agggtgattg ttgttgtgaa 180

tgagacagcg tgtcttgatt ctggacctgt tctccctcca ttggaattgc agagaccgtg 240

tcggtggtga tgtcaaagag gctggatcta cggcgacggc gattgaggtt gcttcgtcgg 300

agaaagtact tctgagcatg gctcgcaacc tgcgttggcg ttcgcgtttt gacgtagttt 360

ttggagattc ctctccaatc acctttccct accttctgca atccaaccaa aaacagcttg 420

tgctcttcct ccgtccacgg aactcctcgc tttcgctcgc gctcccggag gcggccggag 480

ttctgaggag cggcgtcgtc ggcggaggcg taaccggcgg cgagagcgtc tttgttgttg 540

ctgccgtctt gaggatgctc gtactgtgag aggtt 575

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtcgtcggcg gcggcgtaac cgg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccggttacgc cgccgccgac gac 23

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcgtcgtcg gcgtcggcgt aaccggcg 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgccggttac gccgacgccg acgacgcc 28

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgagctcatg tctcgcgcct cctcc 25

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggggtaccag caacactaat gatgctttct cc 32

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cggggtacca agcttaacct ctcacagtac gagcatcc 38

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccggaattct ctagaggcac attatgtttt tccacg 36