月季不定芽真空渗透转基因方法

摘要

本发明公开了一种月季不定芽真空渗透转基因方法，包括以下步骤：切取月季无菌苗的幼嫩茎尖，在增殖培养基上诱导产生大量不定芽；切取不定芽在增殖培养基上预培养3天，然后转移到携带目的基因的农杆菌转化液中真空渗透5～10 min，充分浸湿；去除菌液后的不定芽转移到增殖培养基上在黑暗条件下共培养3天，然后把经无菌水彻底清洗后的不定芽转入抑菌培养基培养5天，再根据携带目的基因表达载体的选择标记转入到选择培养基上按由低到高梯度筛选，获得的抗性不定芽转移到生根培养基上诱导生根；采集阳性植株的叶片进行PCR鉴定和报告基因检测，都为阳性的植株为转基因植株。本发明增值系数高、繁殖周期短、基因转化率高、假阳性率低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种月季不定芽真空渗透转基因方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

月季是世界“四大切花”之首，但目前转基因体系还不成熟，严重阻碍了其分子育种的发展。目前，申请公开和授权的相关专利主要有利用芽点(公开号CN103146748A)和体细胞胚(公开号CN102220372B)两种基因转化方法。利用茎段产生的芽点进行基因转化的缺点是增殖系数低，每个芽点需要刻伤，工序繁琐；利用体细胞胚进行转基因操作最大的不足是体细胞胚诱导困难、周期长，转化效率低。可见，以上两种转基因方法都不能满足大规模转基因操作的需求。申请人在反复试验的基础上，创建了以月季不定芽为材料的基因转化方法，转化效率大大提高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种月季不定芽真空渗透转基因方法，该种方法简便易行、增殖系数高、生长周期短、转化效率高，便于大规模操作及工厂化生产。

为解决上述技术问题，本发明提供一种月季不定芽真空渗透转基因方法，其特征是，包括以下步骤：

切取月季无菌苗的幼嫩茎尖，在增殖培养基上诱导产生大量不定芽；切取长度0.5～1.0cm、带2～4片小叶的不定芽在增殖培养基上预培养3天，然后转移到携带目的基因的农杆菌转化液中真空渗透5～10min，充分浸湿；去除菌液后的不定芽转移到增殖培养基上在黑暗条件下共培养3天，然后把经无菌水彻底清洗后的不定芽转入抑菌培养基培养5天，再根据携带目的基因表达载体的选择标记转入到选择培养基上按由低到高梯度筛选，获得的抗性不定芽转移到生根培养基上诱导生根；采集阳性植株的叶片进行PCR鉴定和报告基因检测，PCR鉴定和报告基因检测都为阳性的植株为转基因植株。

进一步地，所述增殖培养基的成分为MS+6-BA 1.0～2.0mg/L+NAA 0.01～0.1mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L，pH为5.8～6.0。

进一步地，所述农杆菌转化液为含有3％蔗糖的MS营养液，调整OD₆₀₀＝0.5。

进一步地，所述农杆菌转化液为GV3101或者EHA105转化液。

进一步地，所述抑菌培养基的成分为MS+Timentin 500mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L，pH为5.8～6.0。

进一步地，所述选择培养基为含有潮霉素或卡那霉素或草丁膦的选择培养基，pH为5.8～6.0。

进一步地，所述生根培养基的成分为1/2MS+NAA 0.1mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L，pH为5.8～6.0。

进一步地，所述真空渗透的具体方法为：选取灭菌后的50ml医用注射器，加入不超过15ml的含有不定芽的转化液，赶出空气后密封，反复拉动推柄，直到不定芽叶片变为深绿、充分浸湿为止。

进一步地，所述的报告基因检测为LUC检测，具体方法为：选取转基因待测不定芽，均匀喷洒1mM的荧光素底物后，放置到CCD荧光照相系统的暗室中拍照，曝光时间为10min，选取第三张照片观测荧光信号。

进一步地，所述的报告基因检测为GFP检测，具体方法为：选取生根后转基因不定芽，用刀片切取5cm作用的初生根，放置到培养皿内的1％的琼脂上，用体式荧光显微镜在eGFP信号通道下观测荧光。

本发明所达到的有益效果：本发明增殖系数高、繁殖周期短、基因转化率高、假阳性率低。本发明采用的不定芽具有完整、旺盛的分生组织，保证较高的增殖系数；带有2～4片小叶对分生组织起到保护作用，而且光合作用可以为分生组织提供能量；真空渗透保证了菌液能够均匀的进入分生组织细胞，提高了转化效率。

附图说明

图1为实施例1在卡那霉素(Kan)选择培养基上的转基因不定芽(圆圈内为疑似阳性不定芽)；

图2为实施例1转基因植株的PCR鉴定结果，M为Maker，CK为对照，FT为基因FT和质粒pFAST-R05交叉引物的扩增产物；

图3为实施例1转基因植株的GFP报告基因的检测结果，CK为对照，FT-R05为转基因植株的初生根；

图4为实施例2在草丁膦(Bar)选择培养基上的转基因不定芽(圆圈内为疑似阳性不定芽)；

图5为实施例2转基因植株的PCR鉴定结果，M为Maker，CK为对照，KSN为基因KSN启动子和质粒pBGWL7交叉引物的扩增产物；

图6为实施例2转基因植株的LUC报告基因的检测结果，CK为对照，pKSN-LUC为转基因植株。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

I切取月季‘月月粉’无菌苗的茎尖，在MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L基本增殖培养基上培养4周诱导茎尖产生不定芽，准备100个左右。

II切取0.5cm左右带2～4片小叶的不定芽继续在增殖培养基上预培养3天，然后转移到携带FT基因的pFAST-R05质粒(比利时，根特大学提供)的农杆菌GV3101转化液(MS+蔗糖30g/L，OD₆₀₀＝0.5))中，转移到无菌注射器中反复抽提渗透5min，并轻轻摇晃，观察到叶片变为深绿、充分浸湿为止。

III去菌液后的不定芽转移到增殖培养基上在黑暗条件下共培养3天，然后把经无菌水彻底清洗后的不定芽转入抑菌培养基培养5天，再根据pFAST-R05质粒的抗性转入到含有卡那霉素的选择培养基上筛选，先在卡那霉素浓度为10mg/L的培养基上筛选3周，然后在30mg/L的培养基上筛选3周(如图1所示)，获得的新再生的抗性不定芽或者茎尖转移到1/2MS+NAA0.1mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L的生根培养基诱导生根。

IV采集阳性植株的叶片进行PCR鉴定和报告基因GFP检测。

PCR鉴定用基因FT和质粒pFAST-R05特异性交叉引物进行常规PCR扩增。引物序列：F-ATGCTTAAAACTATGCCTAGGGCT，R-GGCCATGATATAGACGTTGTGG。PCR扩增条件：94℃2min，94℃30s，58℃30s，72℃1.5min，38个循环，72℃，5min，鉴定结果如图2所示。

报告基因GFP检测：选取生根后转基因不定芽，用刀片切取5cm作用的初生根，放置到培养皿内的1％的琼脂上，用体式荧光显微镜在eGFP信号通道下观测荧光。检测结果如图3所示。

PCR鉴定和报告基因检测都为阳性的植株为转基因植株。

实施例2

I切取月季‘月月粉’无菌苗的幼嫩茎尖，在MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.05mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L基本增殖培养基上培养3周诱导茎尖产生不定芽，准备100个左右。

II切取0.5cm左右带2～4片小叶的不定芽继续在增殖培养基上预培养3天，然后转移到携带KSN基因启动子的pBGWL7质粒(比利时，根特大学提供)的农杆菌EHA105转化液(MS+蔗糖30g/L，OD₆₀₀＝0.5)，转移到无菌注射器中反复抽提渗透7分钟，并轻轻摇晃，观察到叶片变为深绿、充分浸湿为止。

III去菌液后的不定芽转移到增殖培养基上在黑暗条件下共培养3天，然后把经无菌水彻底清洗后的不定芽转入抑菌培养基培养5天，再根据pBGWL7质粒的抗性转入到含有草丁膦的选择培养基上筛选，先在草丁膦浓度为0.5mg/L的培养基上筛选3周，然后在1mg/L的培养基上筛选3周(如图4所示)，获得的新生抗性不定芽或者茎尖转移到1/2MS+NAA0.1mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L的生根培养基诱导生根。

IV采集阳性植株的叶片进行PCR鉴定和报告基因LUC检测。

PCR鉴定用基因KSN启动子和质粒pBGWL7特异性交叉引物进行常规PCR扩增。引物序列：F-GTGAGATTTGAACCCGTAACTTC，R-TAAAAGCAATTGTTCCAGGAACCAG。PCR扩增条件：94℃2min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，38个循环，72℃，5min，鉴定结果如图5所示。

LUC报告基因检测：选取转基因植株，均匀喷洒1mM的荧光素底物后，放置到CCD荧光照相系统的暗室中拍照，曝光时间为10min，选取第三张照片观测荧光信号。检测结果如图6所示。

PCR鉴定和报告基因检测都为阳性的植株为转基因植株。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。