固定化酶应用于澄清型南瓜‑山楂复合汁的加工法

摘要

本发明公开了一种固定化果胶酶‑糖化酶的制备方法，将用凝胶法制备得到的海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球，用N,N’‑二环已基碳二亚胺(DCC)/N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化，得到羧基活化的活性小球，然后果胶酶和糖化酶混合酶通过酰胺键偶联于小球上，得到高活力的固定化果胶酶‑糖化酶。本发明还同时公开了利用上述方法制备而得的固定化果胶酶‑糖化酶进行的澄清型南瓜‑山楂复合汁的加工方法：经过原料(南瓜、山楂)的挑选、清洗、热烫、打浆、固定化果胶酶‑糖化酶酶解处理、过滤、离心、杀菌、无菌包装工序；制得澄清型南瓜‑山楂复合汁。

说明书

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，公开了一种海藻酸钠/氧化石墨烯小球为载体的固定化果胶酶-糖化酶的制备法及应用于澄清型南瓜-山楂复合汁的加工方法。

背景技术

南瓜和山楂的营养比较丰富，其中所含的营养物质对人体益处多多。利用南瓜和山楂制作成的复合果蔬汁饮料是一款很好的保健产品。南瓜和山楂中富含丰富的果胶和淀粉物质，制作南瓜-山楂复合果蔬汁过程中带入的果肉碎块以及溶入的果胶、淀粉物质等常常引起果蔬汁贮藏期间的混浊、沉淀，导致果蔬汁品质的恶化，明显地缩短了产品的贮存期。

果胶酶是水果加工中最重要的酶，应用果胶酶处理破碎果实，可加速果汁过滤，促进澄清。糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase,(EC.3.2.1.3.)]它能把淀粉从非还原性未端水解a-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。

所以将南瓜-山楂复合果蔬汁用果胶酶和糖化酶进行处理，不仅可以提高果蔬汁的澄清度，还可以促使果蔬汁中的多糖类物质转变为寡糖，便于人体消化吸收。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种固定化果胶酶-糖化酶及用于澄清型南瓜-山楂复合汁的加工方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种固定化果胶酶-糖化酶的制备方法，以海藻酸钠/氧化石墨烯为载体，包括如下步骤：

A)、海藻酸钠/氧化石墨烯小球的活化：

将海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球加入到容器中，然后加入N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及加入N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、三乙胺，混合均匀后，室温下磁力搅拌(搅拌时间为8～12小时，即，过夜)，过滤，洗涤产物(即，滤饼，目的是除去未反应试剂)，得到活化后的海藻酸钠/氧化石墨烯复合凝胶小球；

N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)：海藻酸钠＝1:1.12～1.21的摩尔比，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)：海藻酸钠＝1:1.12～1.21的摩尔比；

B)、果胶酶和糖化酶混合酶液(酶活力比较佳为6:5)配制：

将果胶酶用缓冲液配制成酶活为250～350U/ml(较佳300U/ml)的果胶酶液，用缓冲液稀释糖化酶，得酶活为900～1100U/ml(较佳为1000U/ml)的糖化酶液；

按照果胶酶：糖化酶＝5.8～6.2:5(较佳为6:5)的酶活力，将果胶酶液和糖化酶液混合，得混合酶液；

C)、果胶酶-糖化酶的固定化：

取1g步骤A)所得的活化后的海藻酸钠/氧化石墨烯小球加入13～17mL(较佳为15mL)步骤B)所得的混合酶液，25～55℃水浴震荡反应15～50min，用去离子水冲洗(反复冲洗3遍)，过滤，得固定化果胶酶-糖化酶。

该固定化果胶酶-糖化酶也可真空冷冻干燥后进行保藏。

作为本发明的固定化果胶酶-糖化酶的制备方法的改进：

海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球的制备方法为：

将2g海藻酸钠(粉末状)加入到超声分散均匀的氧化石墨烯水溶液室温下磁力搅拌(3h)，然后超声(100w超声0.5h)从而使海藻酸钠和氧化石墨烯充分混合，接着静置过夜(即，静置时间为8～12小时)，除去气泡；氧化石墨烯与海藻酸钠的质量分数为0～8％(一般为大于0～8％，如为2％～8％，最佳为4％)；

将上述配置好的海藻酸钠/氧化石墨烯混合溶液滴加到40～50mL(较佳为45mL)的质量浓度10％的氯化钙溶液中，从而凝胶，再于4±1℃静置过夜，接着用去离子水洗涤(例如洗涤6次)，真空干燥(50±5℃真空干燥箱中干燥)，得到海藻酸钠/氧化石墨烯复合凝胶小球。

作为本发明的固定化果胶酶-糖化酶的制备方法的进一步改进：

所述海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球的制备方法中，氧化石墨烯水溶液的体积量为100ml；

将上述配置好的海藻酸钠/氧化石墨烯混合溶液滴加到氯化钙溶液中的时间为50～70分钟(例如可通过1mL注射器逐滴滴入)。

作为本发明的固定化果胶酶-糖化酶的制备方法的进一步改进：

所述步骤A)中，采用乙醇：环己烷＝1:1的混合液进行洗涤。

作为本发明的固定化果胶酶-糖化酶的制备方法的进一步改进：

所述步骤A)中，每1g海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球(含4.28～4.63mmol海藻酸钠单元)配用10±2mL的N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)，0.3±0.1ml的三乙胺。

作为本发明的固定化果胶酶-糖化酶的制备方法的进一步改进：

所述步骤B)中的缓冲液为乙酸–乙酸钠缓冲液(0.25mol/L,pH 3.0～5.0)。

在本发明中，室温一般是指15～30℃。

本发明还同时提供了利用上述方法制备而得的固定化果胶酶-糖化酶进行的澄清型南瓜-山楂复合汁的加工方法，包括如下步骤：

1)、将南瓜制备所得的南瓜汁以及山楂制备所得的山楂汁进行混合，得pH为4.5±0.2的复合果蔬汁；

2)、在100mL复合果蔬汁加入0.1g～0.5g的固定化果胶酶-糖化酶，于30～70℃水浴振荡20～120min；

3)、将步骤2)所得的酶解后复合果蔬汁进行过滤(过滤的目的是为了除去固定化果胶酶-糖化酶)；

4)、将步骤3)所得的滤液进行离心(2000r/min～3000r/min)、高温瞬时杀菌(105℃下杀菌15s左右)、无菌包装，得澄清型南瓜-山楂复合汁(作为成品)。

作为本发明的澄清型南瓜-山楂复合汁的加工方法的改进：所述步骤1)为：

将南瓜条热烫20±5分钟，以料水比l：2(重量比)打浆，然后过滤，得南瓜汁；

将山楂(新鲜山楂)去核切片，然后置于-14～-18℃冷冻9～11小时(例如，-16℃冷冻10小时)，在25～30℃下，料水比l：2(重量比)浸提2±0.5小时，过滤，得山楂汁；

在南瓜汁中加入山楂汁，直至所得的复合果蔬汁(复合南瓜-山楂复合汁)的pH为4.5。

由于固定化酶与游离酶相比具有多种优势，如：酶可多次重复利用、仅需过滤即可把固定化酶分离、无需高温灭酶程序，从而最大限度的保持果汁中的营养成分等。因此本发明提供了一种将果胶酶和糖化酶混合起来通过共价结合制备成固定化双酶的一种方法，并将其应用于南瓜-山楂复合汁的加工。

在本发明中，以海藻酸钠/氧化石墨烯为载体制备高活力固定化果胶酶-糖化酶，用DCC/NHS活化海藻酸钠/氧化石墨烯上的羧基形成活性酯，DCC/NHS与海藻酸钠的摩尔比约为1:1.12～1.21，载体上的活性酯基团与酶上的氨基偶联，通过共价键(酰胺键)将酶固定于载体上。

本发明运用固定化果胶酶-糖化酶酶解处理南瓜-山楂复合汁，仅需过滤等简单的方法，即可把颗粒状的固定化果胶酶-糖化酶和液体原料发生固液分离。无需高温加热灭酶程序，即可终止酶解反应工序，能最大限度的保持果汁中的营养成分。从而使酶解后南瓜-山楂复合汁中的透光率、可溶性固形物、还原糖含量大大增加。酶解后复合果汁中果胶含量降低、可溶性蛋白含量降低，透光率增加，从而使果汁澄清度提高，且避免了果汁的二次浑浊现象。此外，酶解后果汁中的还原糖含量增加，更易于人体吸收。

因此，本发明的方案包括：1、将用凝胶法制备得到的海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球，用N,N’-二环已基碳二亚胺(DCC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化，得到羧基活化的活性小球，然后果胶酶和糖化酶混合酶通过酰胺键偶联于小球上，得到高活力的固定化果胶酶-糖化酶。2、经过原料(南瓜、山楂)的挑选、清洗、热烫、打浆、固定化果胶酶-糖化酶酶解处理、过滤、离心、杀菌、无菌包装工序；制得澄清型南瓜-山楂复合汁。

本发明具备如下技术优势：

1、本发明以海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球作为固定化载体，海藻酸钠无毒，亲水性强，生物相容性好，成本低。氧化石墨烯表面积大，机械强度高，成本低。海藻酸钠和氧化石墨烯都是好的固定化酶载体，两者复合提高了固定化的效果，并且加入氧化石墨烯后载体材料的机械强度增大，提高了载体的稳定性。海藻酸钠和氧化石墨烯载体上均含有羧基，本发明采用DCC/NHS活化载体的羧基后通过共价键(酰胺键)固定化果胶酶，酶不易从载体上脱落，该法制备的固定化酶稳定性较好。

2、本发明制备的固定化果胶酶-糖化酶的酶活高(其中果胶酶活力为1227.48±36.47U/g，糖化酶活力为1027.18±29.17U/g)，酶回收率高，共固定化双酶中果胶酶的酶活回收率为73.8±2.65％，糖化酶的酶活回收率为85.2±2.28％。固定化果胶酶-糖化酶的最适pH范围为3.5～5.5，略微大于游离酶的4～5。固化果胶酶-糖化酶的最适温度为60℃，比游离酶的最适温度增高10℃；热稳定性好。本发明所用的固定化果胶酶-糖化酶重复利用6次以后能保持初始酶活的62.6％。

3、用在优化后的固定化条件下制得的固定化果胶酶-糖化酶(其中果胶酶活力为1227.48±36.47U/g，糖化酶活力为1027.18±29.17U/g)酶解处理南瓜-山楂复合汁，能同时分解果汁中影响果汁澄清度的果胶和淀粉类物质。

4、酶解后南瓜-山楂复合汁中的透光率、可溶性固形物、还原糖含量分别增加了15.84％、5.8％、49.27％。酶解后复合果汁中果胶含量降低、可溶性蛋白含量降低，透光率增加，从而使果汁澄清度提高，且避免了果汁的二次浑浊现象。此外，酶解后果汁中的还原糖含量增加，更易于人体吸收。

5、仅需过滤等简单的方法，即可把颗粒状的固定化果胶酶-糖化酶和液体原料发生固液分离；无需高温加热灭酶程序，即可终止酶解反应工序。

综上所述，本发明提供了一种将果胶酶和糖化酶混合起来通过共价结合制备成固定化双酶的一种方法。固定化果胶酶-糖化酶的热稳定性比游离酶提高，重复使用六次以后酶活能保持初始酶活的62.6％。相比于运用游离的果胶酶和糖化酶，固定化果胶酶-糖化酶在果汁生产中更具优势：(1)固定化果胶酶-糖化酶能同时分解果汁中影响果汁澄清度的果胶和淀粉类物质；(2)仅需过滤等简单的方法，即可把颗粒状的固定化果胶酶-糖化酶和液体原料发生固液分离；(3)无需高温加热灭酶程序，即可终止酶解反应工序，能最大限度的保持果汁中的营养成分；(4)固定化果胶酶-糖化酶环保，可再生。目前国内外还没有把固定化果胶酶-糖化酶应用于南瓜-山楂复合汁的研究报道和实施案例。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是实施例1制备所得的固定化酶的重复利用实验结果图；

图2是实施例2制备所得的固定化酶的重复利用实验结果图；

图3实施例3制备所得的固定化酶的重复利用实验结果图；

图1～3中，

均代表共固定化酶中果胶酶的相对酶活；

均代表共固定化酶中糖化酶的相对酶活；

图4是澄清型南瓜-山楂复合汁的加工方法的工艺流程图；

图5是海藻酸钠/氧化石墨烯小球经三种不同方法活化制备固定化果胶酶的酶活回收率对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1、一种固定化果胶酶-糖化酶的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球的制备方法：

将2g的海藻酸钠粉末加入到100ml超声分散均匀的氧化石墨烯水溶液(氧化石墨烯水溶液中，氧化石墨烯的浓度分别为0、0.04g/100ml、0.08g/100ml、0.12g/100ml、0.16g/100ml，室温下磁力搅拌3h，然后100w超声0.5h使海藻酸钠和氧化石墨烯充分混合，然后静置过夜，除去气泡。配置好的海藻酸钠/氧化石墨烯混合溶液通过1mL注射器逐滴滴入到45mL 10％的氯化钙溶液中(即，控制滴加时间为100滴/分钟，约1小时滴完)，形成海藻酸钠/氧化石墨烯的凝胶后小球，放入4℃冰箱静置过夜，再用去离子水反复洗涤6次，50℃真空干燥箱中干燥至恒重，分别得到5种海藻酸钠/氧化石墨烯复合凝胶小球；上述5种小球中，氧化石墨烯质量分数分别为海藻酸钠的0、2％、4％、6％、8％。

注1：当氧化石墨烯质量分数为海藻酸钠的4％时，固定化果胶酶的酶活回收率最高。

注2：通过傅里叶-红外变换光谱和扫描电镜观察得知海藻酸钠和氧化石墨烯相容性比较好。

选用上述氧化石墨烯质量分数为海藻酸钠4％小球，进行下述步骤。

2)、DCC/NHS活化海藻酸钠/氧化石墨烯小球

将步骤1)制备所得的1g海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球(含4.45mmol海藻酸钠单元)加入到50mL锥形瓶中，然后加入0.79g DCC(3.83mmol)，0.44g NHS(3.83mmol)，10mLDMF(溶剂)，0.3ml三乙胺，混合均匀后，室温下磁力搅拌过夜，过滤，用100ml的乙醇/环己烷(1:1)洗涤除去未反应试剂，即得到DCC/NHS活化后的海藻酸钠/氧化石墨烯复合凝胶小球，通过傅里叶-红外变换光谱和扫描电镜观察得知DCC/NHS成功活化了海藻酸钠/氧化石墨烯。

[注]：由于NHS酯不稳定，易发生水解，N-琥珀酰海藻酸钠/氧化石墨烯小球活化后应立即使用。

3)、果胶酶和糖化酶的固定化

混合酶液的配制：果胶酶(3万U/g)用乙酸–乙酸钠缓冲液(0.25mol/L，pH 4.0)配制成10mg/ml的果胶酶溶液(300U/ml)；再用相同缓冲液把糖化酶(10万U/ml)稀释100倍配成糖化酶溶液(1000U/ml)；取20ml上述配制好的果胶酶，再取5ml上述配制好的糖化酶混合均匀，得到果胶酶和糖化酶的活力比为6:5的混合酶液。

取1g活化后的海藻酸钠/氧化石墨烯小球于50ml锥形瓶中，加入15mL上述混合酶液。40℃水浴震荡反应35min，用去离子水反复冲洗3遍，过滤，得到共固定化果胶酶-糖化酶。

以果胶为底物，用DNS法在540nm下测定反应物的吸光度，从而计算出共固定化酶中果胶酶活力为1227.48±36.47U/g。以可溶性淀粉作为底物，用DNS法在540nm下测定反应物的吸光度，从而计算出共固定化酶中糖化酶的活力为1027.18±29.17U/g，共固定化双酶的最适pH为4.5，最适温度为60℃，共固定化双酶中果胶酶的酶活回收率为73.8±2.65％，糖化酶的酶活回收率为85.2±2.28％。在重复使用6次(使用条件：pH 4.5，25℃，分别酶解果胶和可溶性淀粉30min)后，共固定化双酶中果胶酶和糖化酶的相对酶活均在60％以上。

实施例2、一种固定化果胶酶-糖化酶的制备方法，依次进行以下步骤：依次进行以下步骤：

步骤1)和步骤2)的海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球的制备和活化过程同实施例1。

3)、果胶酶和糖化酶的固定化：

混合酶液的配制同实施例1。

取1g活化后的海藻酸钠/氧化石墨烯小球于50ml锥形瓶中，加入15mL混合酶液，40℃水浴震荡反应40min，用去离子水反复冲洗3遍，过滤，得到共固定化果胶酶-糖化酶。

以果胶为底物，用DNS法在540nm下测定反应物的吸光度，从而计算出共固定化酶中果胶酶活力为1215.08±30.26U/g。以可溶性淀粉作为底物，用DNS法在540nm下测定反应物的吸光度，从而计算出共固定化酶中糖化酶的活力为1013.25±25.36U/g，共固定化双酶的最适pH为4.5，最适温度为60℃，共固定化双酶中果胶酶的酶活回收率为71.9±2.58％，糖化酶的酶活回收率为87.4±2.31％。在重复使用6次(使用条件：pH 4.5，25℃，分别酶解果胶和可溶性淀粉30min)后，共固定化双酶中果胶酶和糖化酶的相对酶活均在60％以上。

实施例3、一种固定化果胶酶-糖化酶的制备方法，依次进行以下步骤：

步骤1)和步骤2)的海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球的制备和活化过程同实施例1。

3)、果胶酶和糖化酶的固定化：

混合酶液的配制同实施例1。

取1g活化后的海藻酸钠/氧化石墨烯小球于50ml锥形瓶中,加入15mL混合酶液，45℃水浴震荡反应30min，用去离子水反复冲洗3遍，过滤，得到共固定化果胶酶-糖化酶。以果胶为底物，用DNS法在540nm下测定反应物的吸光度，从而计算出共固定化酶中果胶酶活力为1207.20±31.13U/g。以可溶性淀粉作为底物，用DNS法在540nm下测定反应物的吸光度，从而计算出共固定化酶中糖化酶的活力为1005.78±21.37U/g，共固定化双酶的最适pH为4.5，最适温度为60℃，共固定化双酶中果胶酶的酶活回收率为76.8±2.35％，糖化酶的酶活回收率为81.2±2.28％。在重复使用6次(使用条件：pH 4.5，25℃，分别酶解果胶和可溶性淀粉30min)后，共固定化双酶中果胶酶和糖化酶的相对酶活均在60％以上。

实施例4、一种固定化果胶酶-糖化酶的制备方法，依次进行以下步骤：

步骤1)和步骤2)的海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球的制备和活化过程同实施例1。

3)、果胶酶和糖化酶的固定化：

混合酶液的配制：果胶酶(3万U/g)用乙酸–乙酸钠缓冲液(0.25mol/L，pH 3.5)配制成10mg/ml的果胶酶溶液(300U/ml)；再用相同缓冲液把糖化酶(10万U/ml)稀释100倍配成糖化酶溶液(1000U/ml)；取20ml上述配制好的果胶酶，再取5ml上述配制好的糖化酶混合均匀，得到果胶酶和糖化酶的活力比为6:5的混合酶液。

取1g活化后的海藻酸钠/氧化石墨烯小球于50ml锥形瓶中，加入15mL混合酶液，35℃水浴震荡反应30min，用去离子水反复冲洗3遍，过滤，得到共固定化果胶酶-糖化酶。以果胶为底物，用DNS法在540nm下测定反应物的吸光度，从而计算出共固定化酶中果胶酶活力为1283.20±29.13U/g。以可溶性淀粉作为底物，用DNS法在540nm下测定反应物的吸光度，从而计算出共固定化酶中糖化酶的活力为989.7±19.57U/g，共固定化双酶的最适pH为4.5，最适温度为60℃，共固定化双酶中果胶酶的酶活回收率为85.8±1.95％，糖化酶的酶活回收率为65.3±2.08％。在重复使用6次(使用条件：pH 4.5，25℃，分别酶解果胶和可溶性淀粉30min)后，共固定化双酶中果胶酶和糖化酶的相对酶活均在60％以上。

以下实施例5～实施例8所用的固定化果胶酶-糖化酶均为实施例1制备所得。

实施例5、一种利用固定化果胶酶-糖化酶进行的澄清型南瓜-山楂复合汁的加工方法，依次进行如下步骤：

步骤a:

挑选新鲜成熟的南瓜，去皮，去籽去瓤，然后切成小长条。将切分后的南瓜条热烫(100℃的水温)20min，以料水比l：2在打浆中打浆，然后将打浆后的浆汁通过0.8mm的筛网过滤得南瓜汁。

挑选新鲜山楂，去核切片，然后置于-16℃冷冻10h后，在26℃下，料水比l：2浸提2h，通过0.8mm的筛网过滤得山楂汁。

将山楂汁加入南瓜汁中，得作为复合果蔬汁的南瓜-山楂复合汁；用山楂汁调配南瓜-山楂复合汁的pH为4.5。

注：山楂中含有柠檬酸、苹果酸和山楂酸等有机酸，山楂的含酸量为3％左右，所以可运用山楂汁调节南瓜-山楂复合汁的酸度。

步骤b：取100mL调配好的复合果蔬汁，加入固定化果胶酶-糖化酶(实施例1所得)的量为0.5g，60℃水浴振荡100min，测定酶解后南瓜-山楂复合汁中主要成分的变化。

注：酶解前后南瓜-山楂复合汁的主要变化见表1。

步骤c：将酶解后的南瓜-山楂复合汁通过100μm孔径水系滤膜过滤，除去固定化果胶酶-糖化酶。

步骤d：将经过步骤C处理的酶解后的南瓜-山楂复合汁进行离心(2000r/min～3000r/min)除去杂质、高温瞬时杀菌(105℃下杀菌15s左右)。

步骤e：灌装将杀菌后的南瓜-山楂复合汁采用80℃～90℃热灌装或者冷却以后分装，得到产品。

表1、酶解前后南瓜-山楂主要成分的变化

酶解前酶解后可溶性固形物(％)5.1±0.15.4±0.1透光率(％)81.37±0.41194.26±0.361还原糖(mg/mL)10.425±0.29815.561±0.312可溶性糖(mg/mL)21.125±0.34120.625±0.256总酸(mg/mL)2.08±0.021.92±0.05可溶性蛋白质(μg/mL)173.3±0.33395.3±0.256果胶(mg/mL)12.188±0.2767.5±0.327

实施例6、一种利用固定化果胶酶-糖化酶进行的澄清型南瓜-山楂复合汁的加工方法：

挑选新鲜成熟的南瓜，去皮，去籽去瓤，然后切成小长条。将切分后的南瓜条热烫20min，以料水比l：2打浆，然后过滤得南瓜汁。挑选新鲜山楂，去核切片，然后置于-16℃冷冻10h后，在26℃下，料水比l：2浸提2h，过滤得山楂汁。将山楂汁加入南瓜汁中用山楂汁调配复合南瓜-山楂复合汁的pH为4.5。取100mL调配好的复合果蔬汁，加入固定化果胶酶-糖化酶的量为0.5g，55℃水浴振荡100min。将酶解后的南瓜-山楂复合汁过滤，除去固定化果胶酶-糖化酶。把得到的酶解后的南瓜-山楂复合汁进行离心(2000r/min～3000r/min)、高温瞬时杀菌、无菌包装即为成品。

该实施例6中南瓜-山楂复合汁酶解前透光率81.37±0.411％，还原糖含量10.425±0.298mg/mL；酶解后南瓜-山楂复合汁的透光率为91.89±0.35％，还原糖含量为15.48±0.30mg/mL。

实施例7、一种利用固定化果胶酶-糖化酶进行的澄清型南瓜-山楂复合汁的加工方法：

挑选新鲜成熟的南瓜，去皮，去籽去瓤，然后切成小长条。将切分后的南瓜条热烫20min，以料水比l：2打浆，然后过滤得南瓜汁。挑选新鲜山楂，去核切片，然后置于-16℃冷冻10h后，在26℃下，料水比l：2浸提2h，过滤得山楂汁。将山楂汁加入南瓜汁中用山楂汁调配复合南瓜-山楂复合汁的pH为4.5。取100mL调配好的复合果蔬汁，加入固定化果胶酶-糖化酶的量为0.4g，55℃水浴振荡110min。将酶解后的南瓜-山楂复合汁过滤，除去固定化果胶酶-糖化酶。把得到的酶解后的南瓜-山楂复合汁进行离心(2000r/min～3000r/min)、高温瞬时杀菌、无菌包装即为成品。

该实施例7中南瓜-山楂复合汁酶解前透光率81.37±0.411％，还原糖含量10.425±0.298mg/mL；酶解后南瓜-山楂复合汁的透光率为94.056±0.361％，还原糖含量为15.325±0.318mg/mL。

实施例8、一种利用固定化果胶酶-糖化酶进行的澄清型南瓜-山楂复合汁的加工方法：

挑选新鲜成熟的南瓜，去皮，去籽去瓤，然后切成小长条。将切分后的南瓜条热烫20min，以料水比l：2打浆，然后过滤得南瓜汁。挑选新鲜山楂，去核切片，然后置于-16℃冷冻10h后，在26℃下，料水比l：2浸提2h，过滤得山楂汁。将山楂汁加入南瓜汁中用山楂汁调配复合南瓜-山楂复合汁的pH为4.5。取100mL调配好的复合果蔬汁，加入固定化果胶酶-糖化酶的量为0.4g，60℃水浴振荡90min。将酶解后的南瓜-山楂复合汁过滤，除去固定化果胶酶-糖化酶。把得到的酶解后的南瓜-山楂复合汁进行离心(2000r/min～3000r/min)、高温瞬时杀菌、无菌包装即为成品。

该实施例8中南瓜-山楂复合汁酶解前透光率81.37±0.411％，还原糖含量10.425±0.298mg/mL；酶解后南瓜-山楂复合汁的透光率为90.694±0.389％，还原糖含量为15.161±0.278mg/mL。

对比实验1、海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球活化方法的筛选：

为了选择有效的海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球活化方法，发明人考察了用戊二醛、环氧氯丙烷和DCC/NHS三种活化剂对固定化果胶酶活力的影响。对这三种方法中所用的活化剂的浓度或用量经过优化，结果表明戊二醛浓度为8％，环氧氯丙烷浓度为10％，DCC/NHS与SA/GO(海藻酸钠/氧化石墨烯)复合载体材料中海藻酸钠的摩尔比为1:1.12～1.21活化SA/GO凝胶小球，是各种活化剂的最佳浓度。

分别为如下3种活化方式：

A、戊二醛活化：

将实施例1步骤1)制备所得的1g海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球(氧化石墨烯质量分数分别为海藻酸钠的0,、2％、4％、6％、8％)加入含有10mL戊二醛(8％)的锥形瓶中，将锥形瓶置于转速为130r/min的摇床内，25℃下反应4h，蒸馏水洗涤6次除去戊二醛残留，产物于50℃真空干燥12h，即得到戊二醛活化的海藻酸钠/氧化石墨烯复合凝胶小球；

B、环氧氯丙烷活化：

在50mL锥形瓶中将1ml环氧氯丙烷和10mL二甲基亚砜混合均匀后(环氧氯丙烷浓度约为10％，w/w)，向混合液中加入1g实施例1步骤1)制备所得的海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球(氧化石墨烯质量分数分别为海藻酸钠的0,、2％、4％、6％、8％)，再滴入10mL氢氧化钠溶液(3mol/L)，将反应瓶置于转速为130r/min的摇床内，40℃下反应3h，然后用蒸馏水和乙醇交替抽滤洗涤至滤液为中性，将产物在50℃真空干燥12h，即得到环氧氯丙烷活化的海藻酸钠/氧化石墨烯复合凝胶小球；

C、DCC活化：

在50mL锥形瓶中加入1g实施例1步骤1)制备所得的海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶小球(氧化石墨烯质量分数分别为海藻酸钠的0、2％、4％、6％、8％)、0.79g DCC、0.44g NHS，然后加入10mL DMF作溶剂，加入3滴(1ml)三乙胺，室温下磁力搅拌过夜，过滤，用100ml乙醇/环己烷(1:1)洗涤6次除去未反应试剂，将反应后的海藻酸钠/氧化石墨烯复合凝胶小球，在50℃下真空干燥12h，即得到DCC/NHS活化的海藻酸钠/氧化石墨烯复合凝胶小球。

将上述各自最佳活化剂用量下得到的活化小球，在相同的固定化条件下进行果胶酶的固定化：取1g活化后的海藻酸钠/氧化石墨烯小球于50ml锥形瓶中，加入10mL浓度为10mg/mL的果胶酶液(用乙酸–乙酸钠缓冲液(0.25mol/L，pH＝3.0)配制)，30℃水浴震荡反应30min，用去离子水反复冲洗3遍，过滤，得到固定化果胶酶。

得到的固定化果胶酶的酶活回收率如图5所示，由图5可知：DCC/NHS活化的SA/GO复合材料固定化果胶酶的酶活回收率最高，此外从图5中还可以看出：随着复合载体中GO的增加，固定化果胶酶活力也在增加，当GO大于4％时，随着GO含量的增加，固定化酶活力变化不大。故本发明选取4％GO去制备复合载体材料，选取用DCC/NHS活化的复合载体材料进行果胶酶-糖化酶的共固定化。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。