一种多重荧光PCR法检测高血压用药基因多态性的试剂盒

摘要

本发明提供一种多重荧光PCR法检测高血压用药基因多态性的试剂盒，包含高血压药物敏感性相关的7种基因多态性检测（CYP2C9*1及*3、CYP2D6*1及*10、CYP3A5*1及*3、ADRB1 (1165G>C)、AGTR1 (1166A>C)、ACE (I/D)和NPPA（2238 T>C）），通过4个反应缓冲液进行扩增，每个反应缓冲液包含四个荧光通道，通过扩增结果判断7个位点等位基因类型，从而指导临床用药。

说明书

技术领域

本发明属于荧光定量PCR领域，具体涉及一种多重荧光PCR法检测高血压用药基因多态性的试剂盒。

背景技术

保守估计，我国高血压患者人数超过了1.6亿。高血压的发病率呈上升趋势，高血压并发症---脑卒中是我国的第二大死因。高血压与其并发症已成为了全球第三大疾病经济负担。通过药物治疗控制血压是目前和今后相当长时间内减少高血压并发症发生的主要手段。

在2000年全球畅销的前200种药品中，治疗高血压的药物占17种。然而，治疗高血压病的药物在临床上出现的个体反应差异十分普遍，接受药物治疗的患者约有20%-50%血压未得到良好控制，其主要原因也是由于与药物相关的药物代谢酶和受体发生了遗传变异。药物疗效和不良反应的个体差异是目前药物治疗过程中的普遍现象。遗传药理学和药物基因组学的研究进展表明药物代谢酶、转运体和受体(药物作用靶点)的遗传变异是造成个体药物反应差异的主要原因。如细胞色素氧化酶CYP2D6发生基因突变，在相同剂量条件下，其所介导代谢的β受体阻滞剂在突变型纯合子中的血药浓度比野生型纯合子高2~3倍，如不根据基因型调整剂量，突变型纯合子患者可能发生严重的毒副反应；相反，如果β受体发生功能性突变，在突变型纯合子个体中依然使用β受体阻滞药，往往会导致治疗失败。这不仅延误治疗，而且导致了医疗资源的浪费门。因此，根据个体与药物治疗相关的代谢酶转运体和受体的遗传变异制定不同的治疗方案，实现药物治疗个体化不仅是当今遗传药理学和临床药物治疗学的发展方向，而且具有十分重要的社会意义和经济意义。

现阶段，临床上检测高血压用药基因多态性主要采取测序法和基因芯片法进行检测。测序法灵敏度低，且整个检测周期需要7天，操作复杂不适合临床推广；基因芯片法灵敏度仅能达到10⁴copies/mL，且操作过程容易造成交叉污染导致假阳性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多重荧光PCR法检测高血压用药基因多态性的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明在一个试剂盒内包含高血压药物敏感性相关的7种基因多态性检测（CYP2C9*1及*3、CYP2D6*1及*10、CYP3A5*1及*3、ADRB1 (1165G>C) 、AGTR1 (1166A>C)、ACE (I/D)和NPPA（2238 T>C）），通过4个反应缓冲液进行扩增，每个反应缓冲液包含四个荧光通道，通过扩增结果判断7个位点等位基因类型，从而指导临床用药。

试剂盒共包含7个组分：反应液1#~4#，酶混合液，阳性对照，阴性对照，

反应液1#包含CYP2C9特异性引物及探针、特异性引物及探针；

反应液2#包含CYP3A5特异性引物及探针、ADRB1特异性引物及探针；

反应液3#包含AGTR1特异性引物及探针、ACE（I）和ACE（D）特异性引物及探针

反应液4#包含NPPA特异性引物及探针、内控引物探针；

酶混合液包含热启动Taq酶及UNG酶；

阳性对照包含特异性质粒及TE水；特异性质粒将各个基因型的质粒混合后配制成为阳性对照；

阴性对照包含TE水。

引物探针序列：

试剂组分配方：

反应液1#配方：Tris（PH8.8）20mmol/L，KCl 60mmol/L，MgCl_{2>2.0mmol/L，EDTA·2Na0.5mmol/L，2%DMSO，dATP 200μmol/L，dGTP 200μmol/L，dCTP 200μmol/L，dTTP 200μmol/L，CYP2C9上游引物417nmol/L，CYP2C9下游引物417nmol/L，CYP2C9探针（*1）62.5nmol/L，CYP2C9探针（*3）62.5nmol/L，CYP2D6上游引物417nmol/L，CYP2D6下游引物417nmol/L，CYP2D6探针（*1）62.5nmol/L，CYP2D6探针（*10）62.5nmol/L。}

反应液2#配方：Tris（PH8.8）20mmol/L，KCl 60mmol/L，MgCl_{2>2.0mmol/L，EDTA·2Na 0.5mmol/L，2%DMSO，dATP 200μmol/L，dGTP 200μmol/L，dCTP 200μmol/L，dTTP 200μmol/L，AGTR1上游引物417nmol/L，AGTR1下游引物417nmol/L，AGTR1探针（1166A）62.5nmol/L，AGTR1探针（1166C）62.5nmol/L，ADRB1上游引物417nmol/L，ADRB1下游引物417nmol/L，ADRB1探针（1165G）62.5nmol/L，ADRB1探针（1165C）62.5nmol/L。}

反应液3#配方：Tris（PH8.8）20mmol/L，KCl 60mmol/L，MgCl_{2>2.0mmol/L，EDTA·2Na 0.5mmol/L，2%DMSO，dATP 200μmol/L，dGTP 200μmol/L，dCTP 200μmol/L，dTTP 200μmol/L，CYP3A5上游引物417nmol/L，CYP3A5下游引物417nmol/L，CYP3A5探针（*1）62.5nmol/L，CYP3A5探针（*3）62.5nmol/L，ACE-I上游引物417nmol/L，ACE-I下游引物417nmol/L，ACE-I探针62.5nmol/L，ACE-D上游引物417nmol/L，ACE-D下游引物417nmol/L，ACE-D探针62.5nmol/L。}

反应液4#配方：Tris（PH8.8）20mmol/L，KCl 60mmol/L，MgCl_{2>2.0mmol/L，EDTA·2Na 0.5mmol/L，2%DMSO，dATP 200μmol/L，dGTP 200μmol/L，dCTP 200μmol/L，dTTP 200μmol/L，NPPA上游引物417nmol/L，NPPA下游引物417nmol/L，NPPA探针（2238T）62.5nmol/L，NPPA探针（2238C）62.5nmol/L，内控上游引物417nmol/L，内控下游引物417nmol/L，内控探针62.5nmol/L。}

酶混合液配方：Taq酶4U/µL，UNG酶0.04U/µL。

本发明试剂与市场现有试剂对比表

本发明的优点在于：

优点：本发明的优势为1、灵敏度达到1ng；2、扩增完后直接得到结果，无需后续操作，获得样本后3小时就能得到结果；3、包含7种基因，涵盖市面上常见的高血压药物。

有益效果：1、为临床治疗提供准确的参考，提高治疗有效率，减少药物副作用；2、一次检测覆盖临床常用药物，降低检测成本；3、降低患者经济负担。

附图说明

图1 1#样本结果图。

图2 2#样本结果图。

图3 3#样本结果图。

图4 4#样本结果图。

图5 5#样本结果图。

图6 6#样本结果图。

图7 7#样本结果图。

具体实施方式

实施例1

1、反应液的配制

（1）反应液1#的配制

取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma^®HCl>®>2>

（2）反应液2#的配制

取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma^®HCl>®>2>

（3）反应液3#的配制

取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma^®HCl>®>2>

（4）反应液4#的配制

取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma^®HCl>®>2>

（5）酶混合液的配制

取10mL容量瓶，分别加入10000U/mL的Taq酶4mL，1000U/mL的UNG酶0.4mL。用双重蒸馏水补足体积到10mL，翻转使之充分混匀，将液体转移到10mL烧杯中，按100µL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

（6）阴性对照的配制

取100mL容量瓶，加入生理盐水定容至100mL，将液体转移到10mL烧杯中，按500µL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

（7）阳性对照的配制（浓度为5.0×10³copies/mL）

取100mL容量瓶，分别加入5.0×10⁷copies/mL>

2、核酸提取

采用已备案的核酸提取试剂盒进行核酸提取，提取后用微量紫外分光光度计测核酸纯度，其OD260/OD280应在1.6~2.0之间。

3、加样上机

（1）反应混合物配制

取出反应液1#、反应液2#、反应液3#、反应液4#、酶混合液室温放置，使其充分溶解，配制反应混合物（每测试配置体系：29.5µL反应液+0.5µL 酶混合液），按照需要计算好试剂用量，充分混合均匀后，3000-5000g离心5秒。

（2）加样

取出八联管，依次加入30µL配制好的反应混合物，然后将提取好的样本取2µL加入扩增管或八联管，盖好盖子，稍微离心后置入荧光PCR扩增仪内。

加样顺序，建议参照一下表格进行：

（3）上机检测

1）循环条件设置

38℃ 5分钟，95℃ 10分钟；进入以下循环：95℃ 15秒，58℃ 40秒（检测信号），40循环；25℃30秒。

2）仪器检测通道选择

荧光素设定为FAM、ROX、HEX和CY5。

4、结果判断

（1）阴性对照应无Ct值或者为0；阳性对照Ct值应≤36；反应液4#中ROX通道Ct值应≤36；

（2）样本测试结果应以下表判断：

实施例2

1、试剂特异性验证

（1）实验样本

采取6份特异性样本对试剂的特异性进行验证，其中2份为生理盐水样本、2份为大肠杆菌、2份为小牛血清样本。

（2）实验过程

用反应液1#、反应液2#、反应液3#、反应液4#分别检测以上6份特异性样本，分析检测结果，验证试剂的特异性。

（3）实验结果

6份特异性样本检测结果皆为阴性，表明试剂特异性好，无交叉反应情况。具体结果见下表：

反应液1#特异性检测结果

反应液2#特异性检测结果

反应液3#特异性检测结果

反应液4#特异性检测结果

2、试剂精密性验证

（1）实验样本

采取1份精密性样本（浓度为5.0×10³copies/mL）对试剂的精密性进行验证，样本配制方法为取100mL容量瓶，分别加入5.0×10⁷copies/mL>

（2）实验过程

用反应液1#、反应液2#、反应液3#、反应液4#分别重复检测以上精密性样本10次，分析检测结果，验证试剂的精密性。

（3）实验结果

三种反应液检测精密性样本批内变异系数（CV值）均＜5%，表明试剂重复性好。具体结果见下表：

反应液1#精密性检测结果

反应液2#精密性检测结果

反应液3#精密性检测结果

反应液4#精密性检测结果

3、试剂最低检测限验证

（1）实验样本

取不同基因型的临床样本，提取核酸后稀释为0.5ng/µL，取稀释后的核酸2µL进行扩增，验证试剂的最低检测限。

（2）实验过程

用反应液1#、反应液2#、反应液3#、反应液4#分别重复检测以上最低检测限样本10次，分析检测结果，验证试剂的最低检测限。

（3）实验结果

四种反应液检测最低检测限样本均为阳性，试剂的最低检测限为1ng。具体结果见下表：

4、试剂等位基因突变敏感性验证

（1）实验样本

采取7份突变敏感性样本对试剂等位基因突变敏感性进行验证。1号为5.0×10⁷copies/mL的CYP2C9（*1）、CYP2C9（*3）质粒1：1混合；2号为5.0×10⁷copies/mL的CYP2D6（*1）、CYP2D6（*10）质粒1：1混合；3号为5.0×10⁷copies/mL的AGTR1（1166A）、AGTR1（1166C）质粒1：1混合；4号为5.0×10⁷copies/mL的ADRB1（1165G）、ADRB1（1165C）质粒1：1混合；5号为5.0×10⁷copies/mL的CYP3A5（*1）、CYP3A5（*3）质粒1：1混合；6号为5.0×10⁷copies/mL的ACE-I、ACE-D质粒1：1混合；7号为5.0×10⁷copies/mL的NPPA（2238T）、NPPA（2238C）质粒1：1混合。

（2）实验过程

用反应液1#、反应液2#、反应液3#、反应液4#分别检测以上样本，分析检测结果，验证试剂的等位基因突变敏感性。

（3）实验结果

四种反应液检测等位基因突变敏感性样本均为阳性，证明本试剂在基因比例为50%时能够准确检出。具体结果见图1-7。

实施例3：检测40例临床样本的结果

1、按照实施例1所示的配制方法，配制试剂盒相关组分，于-20℃保存备用。

2、于厦门大学附属中山医院获得40例临床全血样本，采用德必碁生物科技（厦门）有限公司生产的核酸提取试剂（全血型）提取40例临床样本的基因组DNA，用紫外分光光度计检测DNA样本的纯度，40例样本OD260/OD280皆在1.6~2.0之间。

3、按照实施例1所示的步骤，进行DNA加样并上荧光定量PCR仪进行检测，本次使用的仪器为ABI7500.

4、按照实施例1所示判断标准，对结果进行判读并统计，结果如下表：

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 德必碁生物科技(厦门)有限公司

<120> 一种多重荧光PCR法检测高血压用药基因多态性的试剂盒

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<170> PatentIn version 3.3

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