基于 μ‑calpain 活性判断肌肉最佳成熟度的方法

摘要

本发明公开了一种基于μ‑calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法，牲畜肉嫩度用肌原纤维小片化指数代表，持水性用加压失水率代表，包括：步骤一、牲畜宰后取多份生肉样品，置于温度2‑6℃下分别成熟不同时间；步骤二、测定成熟不同时间下的各份生肉样品中的μ‑calpain相对活性、肌原纤维小片化指数及加压失水率；步骤三、绘制成熟时间与μ‑calpain相对活性、成熟时间与加压失水率的趋势图，拟合成熟时间与肌原纤维小片化指数的曲线图，并依照成熟时间将三条曲线置于同一个图中，再基于μ‑calpain相对活性值的变化判断出生肉的最佳成熟时间。本发明的方法能高效、精准地判断出猪肉的最佳成熟度，有别于传统方法中依赖经验判别。获得的最佳成熟度的猪肉具有嫩度最佳、保水性适宜等优点。

说明书

技术领域

本发明属于肉品加工技术领域，涉及一种基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法。

背景技术

据国家统计局农业生产数据显示，2014年全年猪牛羊禽肉产量8540万吨，比上年增长2.0％，其中猪肉产量5671万吨，增长3.2％，我国肉类产量以稳定的速度增长。据估计国外有超过50％的猪肉由于持水性差而导致猪肉的汁液流失率较高，我国冷鲜肉的汁液流失率高达5％，平均比发达国家高出1％-2％，冷鲜肉持水性差给国内外肉品企业造成巨大的经济损失。肌肉持水性差会降低猪肉重量，而且大量的水溶性蛋白及肌浆蛋白会随着汁液流失而损失。此外，肌肉嫩度是肉品品质评价指标的另一重要指标，直接影响消费者的购买欲望。与风味、多汁性等其他肉品指标相比，嫩度在贮存过程中极易发生变化，如何有效的评价肌肉嫩度，根据成熟机理改善嫩度是肉品科学研究的热点。

畜禽宰后，μ-calpain活性及肌肉品质均呈现动态变化，其中嫩度与持水性是肉品品质评价最为重要的指标。宰后成熟过程中，肉品嫩度由于尸僵的发生，嫩度会降低，而在随后的低温(0-4℃)成熟过程中，肌肉蛋白适度降解会使嫩度得到改善。宰后肌肉持水性的变化受多个因素的相互影响，研究表明肌肉中的水分在僵直过程中会被挤出，此后持水性由于成熟时间的不同呈显著变化趋势。有学者表明在宰后过程中，嫩度不断提高的同时，滴水损失也随之增加。既获得适宜嫩度的猪肉，又能够保证猪肉持水性处于较佳状态，对肉品企业乃至消费者至关重要。因此，亟需一种判定肌肉处于最佳成熟度的方法，获得嫩度适宜、持水性较佳、多汁鲜美的冷鲜肉。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法，解决肉品加工企业及零售市场对优良品质冷鲜肉的需求，以获得最佳成熟度的生鲜肉。

本发明再有一个目的是通过对肌肉中μ-calpain活性的测定，利用曲线拟合确定冷鲜肉处于最佳肌肉嫩度与持水性，解决了传统依靠经验判断、结果不稳定、准确率低等缺点。

本发明提供的技术方案为：

一种基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法，牲畜肉嫩度用肌原纤维小片化指数代表，持水性用加压失水率代表，包括如下步骤：

步骤一、牲畜宰后取多份生肉样品，置于温度2-6℃下分别成熟不同时间；

步骤二、测定成熟不同时间下的各份生肉样品中的μ-calpain相对活性、肌原纤维小片化指数及加压失水率；

步骤三、绘制成熟时间与μ-calpain相对活性的趋势图、成熟时间与加压失水率的趋势图，拟合成熟时间与肌原纤维小片化指数的曲线图，并依照成熟时间将三条曲线置于同一个图中，之后基于μ-calpain相对活性值的变化判断出生肉的最佳成熟时间。

优选的是，所述的基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法中，所述步骤一中，所述多份生肉样品取自背最长肌样品。

优选的是，所述的基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法中，所述步骤一中，将多份生肉样品置于温度2-6℃下分别成熟6h、12h、24h、72h、120h和168h。

优选的是，所述的基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法中，所述步骤二中，所述μ-calpain相对活性采用以酪蛋白为底物的活性电泳进行测定，测定后得到不同成熟时间与μ-calpain相对活性的趋势图。

优选的是，所述的基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法中，所述步骤二中，所述加压失水率的测定包括如下步骤：

2.1)将生肉样品顺着肌纤维方向切成约1-3cm厚的薄片，然后用2-5层纱布进行包裹，并在生肉样品上下各垫15-20层定性滤纸；

2.2)将步骤2.1)中的生肉样品置于钢环式膨胀压缩仪平台上，加压至20-50kg保持5-10min，记录加压前质量和加压后生肉样品质量。

优选的是，所述的基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法中，所述步骤三中，利用非线性回归模型y＝y₀+a(1-e^-bx)拟合肌原纤维小片化指数对宰后时间的响应。

优选的是，所述的基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法中，所述步骤三中，判断出生肉的最佳成熟时间为4℃下处理120h。

优选的是，所述的基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法中，所述步骤一中，所述牲畜宰后45min再取生肉样品。

优选的是，所述的基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法中，所述牲畜为猪。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明的基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法，以生猪宰后45min的背最长肌作为检测样品，去除外层肌膜及结缔组织，在4℃放置成熟不同时间测定与肌肉蛋白降解相关的μ-calpain活性、肌原纤维小片化指数及持水性，通过对μ-calpain活性、肌原纤维小片化指数、持水性进行曲线拟合，获得猪肉达到最佳成熟度的时间。本发明的方法能高效、精准地判断出猪肉的最佳成熟度，有别于传统方法中依赖经验判别。获得的最佳成熟度的猪肉具有嫩度最佳、保水性适宜等优点，为肉制品加工企业进行蒸煮、腌制、冻藏等后续加工提供最佳原料肉的判断方法。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明其中一个实施例中宰后不同时间μ-calpain活性电泳分析图；

图2为本发明其中一个实施例中宰后不同时间肌原纤维小片化指数的变化曲线图；

图3为本发明其中一个实施例中宰后不同时间肌肉加压失水率的变化曲线图；

图4为宰后成熟过程中基于μ-calpain活性判定肌肉嫩度及持水性的拟合曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供一种基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法，牲畜肉嫩度用肌原纤维小片化指数代表，持水性用加压失水率代表，包括如下步骤：

步骤一、牲畜宰后取多份生肉样品，置于温度2-6℃下分别成熟不同时间；

步骤二、测定成熟不同时间下的各份生肉样品中的μ-calpain相对活性、肌原纤维小片化指数及加压失水率；

步骤三、绘制成熟时间与μ-calpain相对活性的趋势图、成熟时间与加压失水率的趋势图，拟合成熟时间与肌原纤维小片化指数的曲线图，并依照成熟时间将三条曲线置于同一个图中，之后基于μ-calpain相对活性值的变化判断出生肉的最佳成熟时间。

肌原纤维小片化指数与肉的嫩度呈正相关，加压失水率与肉的持水性呈负相关。分别测肌原纤维小片化指数、加压失水率、μ-calpain相对活性，在不同时间点的值，将三者呈现在同一图上，更直观表示出μ-calpain活性与持水性的关系。在μ-calpain相对活性值的变化速率最慢的范围内，找到加压失水率的可接受的值内，肌原纤维小片化指数较佳的范围或者值，该范围或值对应的成熟时间极为生肉的最佳成熟时间。

在本发明的其中一个实施例中，如图4所示，在4℃下处理条件下，成熟时间120h时，加压损失率降到最低，此时，肌原纤维小片化指数处于较佳值。因此，判断出4℃处理条件生肉的最佳成熟时间为120h。

在上述方案中，所述步骤一中，所述多份生肉样品取自背最长肌样品。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤一中，将多份生肉样品置于温度2-6℃下分别成熟6h、12h、24h、72h、120h和168h。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤二中，所述μ-calpain相对活性采用以酪蛋白为底物的活性电泳进行测定，测定后得到不同成熟时间与μ-calpain相对活性的趋势图。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤二中，所述加压失水率的测定包括如下步骤：

2.1)将生肉样品顺着肌纤维方向切成约1-3cm厚的薄片，然后用2-5层纱布进行包裹，并在生肉样品上下各垫15-20层定性滤纸；

2.2)将步骤2.1)中的生肉样品置于钢环式膨胀压缩仪平台上，加压至20-50kg保持5-10min，记录加压前质量和加压后生肉样品质量。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤三中，利用非线性回归模型y＝y₀+a(1-e^-bx)拟合肌原纤维小片化指数对宰后时间的响应。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤一中，所述牲畜宰后45min再取生肉样品。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述牲畜为猪。

实施例1

一种基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法及验证实验。

主要试剂的成分如下：

提取液：0.1M NaCl,10mM Na₃PO₄,2mM>2,l>

样品处理液：0.2M Na₂HPO₄,0.2M>2PO₄

12.5％的分离胶：3.35mL双蒸水,2.5mL 1.5MTris·HCl,100μL 10％SDS,4mL30％Acr-Bis(29:1),5μL TEMED,50μL 10％APS

4％的浓缩胶：3.05mL双蒸水,1.25mL 0.5M Tris·HCl,50μL 10％SDS,0.65mL30％Acr-Bis(29:1),5μL TEMED,25μL 10％APS

孵育液：50mM Tris-HCl，10mM CaCl₂,pH7.0

考马斯亮蓝R-250：考马斯亮蓝R-250 0.2g,95％乙醇84mL,冰醋酸20mL,加水定容至200mL

MFI缓冲液：100mM KCl,11.2mM K₂HPO4,8.8mM>2PO₄,1mM EGTA,1mM>2

1)猪肉样品的处理

步骤一：生猪宰后45-60min取背最长肌，去除外层肌膜及结缔组织后取样，取样大小为10cm×6cm×4cm。

步骤二：将步骤一中所述的样品用聚乙烯保鲜袋包装后置于2-6℃条件下成熟，分别成熟6h，12h，24h，72h，120h，168h。

2)μ-calpain活性测定

取1g剔除结缔组织的肉样，加入3倍体积的提取液，在4℃下高速匀浆30s，每10s间隔10s，然后离心(4℃，8 000×g，30min)，取上清，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，按体积1:1的比例加入样品处理液，置于-80℃冰箱备用。采用12.5％的分离胶和4％的浓缩胶，制成0.75mm厚的凝胶。置于4℃层析柜中恒压100V预电泳15min后上样40μg蛋白，继续电泳3h。电泳完成后，胶用孵育液洗涤3次，每次20min，随后置于孵育液室温下反应16h后，考马斯亮蓝R-250染色，脱色后用GelDox凝胶成像系统获取图像。如图1所示。

3)肌原纤维小片化指数测定

取4g肉样加40mL预冷(2℃)的MFI缓冲液进行匀浆并离心(1 000×g，15min，2℃)，取沉淀再用40mL上述缓冲液混匀后离心(1 000×g，15min，2℃)，取沉淀，加入10mL上述缓冲液再次混匀，并过滤除去结缔组织，再加入10mL缓冲液洗离心管，并进行过滤；将过滤后的混合液测定蛋白浓度，将蛋白浓度调为0.5mg/mL，在540nm测吸光度值A₅₄₀，MFI值即为A₅₄₀乘以200。利用非线性回归模型y＝y₀+a(1-e^-bx)拟合肌原纤维小片化指数对宰后时间的响应，结果如图2所示。

4)加压失水测定

将肉样顺着肌纤维方向切成约1cm厚的薄片，然后用双层纱布进行包裹，并在肉样上下各垫18层定性滤纸，置于钢环式膨胀压缩仪平台上，加压至35kg保持5min，记录加压前质量和加压后肉样质量，如图3所示。

5)数据分析

将μ-calpain活性、肌原纤维小片化指数、加压失水率进行拟合，得到最佳成熟度的时间点为成熟120h，如图4所示。

通过对最佳成熟度的猪肉样品进行蒸煮处理，测定其蒸煮损失、嫩度及感官评价。对最佳成熟度的猪肉样品进行冻结，测定其解冻损失。

表1三种不同成熟度肉样蒸煮损失、解冻损失及剪切力值

注：1为排酸24h后肉样；2为最佳成熟度肉样；3为过度成熟肉样

表1表示三种不同成熟度猪肉样品蒸煮损失、解冻损失及剪切力。由表可知，利用此发明提供的方法获得的最佳成熟度的猪肉蒸煮损失及解冻损失均最小，剪切力最低，表明处于最佳成熟度的猪肉持水性、嫩度最佳。

表2三种不同成熟度肉样蒸煮后感官评价得分

注：1为排酸24h后肉样；2为最佳成熟度肉样；3为过度成熟肉样

表2表示三种不同成熟度猪肉感官评价得分。由表可知，最佳成熟度猪肉在色泽、气味、弹性、多汁性、组织状态均获得最高评分。表明处于最佳成熟度猪肉有利于后续加工中保持猪肉食用品质。

实施例2

一种基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法，牲畜肉嫩度用肌原纤维小片化指数代表，持水性用加压失水率代表，包括如下步骤：

步骤一、牲畜宰后45min取背最长肌样品，去除外层肌膜及结缔组织后取样，取样大小为10cm×6cm×4cm，样品用聚乙烯保鲜袋包装后置于2℃条件下成熟，分别成熟6h，12h，24h，72h，120h，168h。

步骤二、测定成熟不同时间下的各份生肉样品中的μ-calpain相对活性、肌原纤维小片化指数及加压失水率。

μ-calpain相对活性采用以酪蛋白为底物的活性电泳进行测定，测定后得到不同成熟时间与μ-calpain相对活性的趋势图。

加压失水率的测定包括如下步骤：

2.1)将生肉样品顺着肌纤维方向切成约1cm厚的薄片，然后用2层纱布进行包裹，并在生肉样品上下各垫15层定性滤纸；

2.2)将步骤2.1)中的生肉样品置于钢环式膨胀压缩仪平台上，加压至20kg保持5min，记录加压前质量和加压后生肉样品质量。

步骤三、绘制成熟时间与μ-calpain相对活性的趋势图、成熟时间与加压失水率的趋势图，利用非线性回归模型y＝y₀+a(1-e^-bx)拟合成熟时间与肌原纤维小片化指数的曲线图，并依照成熟时间将三条曲线置于同一个图中，之后基于μ-calpain相对活性值的变化判断出生肉的最佳成熟时间。

实施例3

一种基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法，牲畜肉嫩度用肌原纤维小片化指数代表，持水性用加压失水率代表，包括如下步骤：

步骤一、牲畜宰后45min取背最长肌样品，去除外层肌膜及结缔组织后取样，取样大小为10cm×6cm×4cm，样品用聚乙烯保鲜袋包装后置于6℃条件下成熟，分别成熟6h，12h，24h，72h，120h，168h。

步骤二、测定成熟不同时间下的各份生肉样品中的μ-calpain相对活性、肌原纤维小片化指数及加压失水率。

μ-calpain相对活性采用以酪蛋白为底物的活性电泳进行测定，测定后得到不同成熟时间与μ-calpain相对活性的趋势图。

加压失水率的测定包括如下步骤：

2.1)将生肉样品顺着肌纤维方向切成约3cm厚的薄片，然后用5层纱布进行包裹，并在生肉样品上下各垫20层定性滤纸；

2.2)将步骤2.1)中的生肉样品置于钢环式膨胀压缩仪平台上，加压至50kg保持10min，记录加压前质量和加压后生肉样品质量。

步骤三、绘制成熟时间与μ-calpain相对活性的趋势图、成熟时间与加压失水率的趋势图，利用非线性回归模型y＝y₀+a(1-e^-bx)拟合成熟时间与肌原纤维小片化指数的曲线图，并依照成熟时间将三条曲线置于同一个图中，之后基于μ-calpain相对活性值的变化判断出生肉的最佳成熟时间。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

本发明涉及一种基于μ-calpain活性判断肌肉最佳成熟度的方法。通过将猪肉成熟不同时间测定与肌肉蛋白降解相关的μ-calpain活性及肌原纤维小片化指数、持水性，通过对μ-calpain活性、肌原纤维小片化指数、持水性进行曲线拟合，获得猪肉达到最佳成熟度的时间。在实际加工过程中，通过利用最佳成熟度的原料肉可以为进一步加工、冻结等处理提供技术支持。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。