吉尔吉斯白桦叶绿体伴侣蛋白60亚基β4基因及其编码蛋白

摘要

吉尔吉斯白桦叶绿体伴侣蛋白60亚基β4基因及其编码蛋白，它属于生物技术领域。吉尔吉斯白桦BkCPN60β4基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。其的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。本发明中吉尔吉斯白桦BkCPN60β4基因的编码区长度为1248bp，编码415个氨基酸，亚细胞定位表明BkCPN60β4蛋白定位在细胞核和细胞质，BkCPN60β4基因成功转化拟南芥，转基因株系BkCPN60β4基因的表达量高于野生型(WT)，1.5mmol/L和3.0mmol/L NaHCO

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及吉尔吉斯白桦叶绿体伴侣蛋白60亚基β4基因及其编码蛋白。

背景技术

伴侣蛋白是结构复杂的一类分子伴侣蛋白质，并广泛存在于原核与真核细胞的质体和线粒体中。质体CPN60含有α亚基和β亚基两种类型，在拟南芥中存在2种α亚基基因和4种β亚基基因，水稻中α亚基基因和β亚基基因各有3种。CPN60蛋白参与蛋白折叠的装配，并且蛋白的底物十分丰富，该蛋白可能在不同的逆境胁迫中发挥重要的作用。但是CPN60蛋白在植物体内参与的植物生命活动的机制还尚不清楚。

发明内容

本发明目的是提供吉尔吉斯白桦叶绿体伴侣蛋白60亚基β4(BkCPN60β4)基因及其编码蛋白。

本发明中吉尔吉斯白桦叶绿体伴侣蛋白60亚基β4基因的核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示。

本发明中吉尔吉斯白桦叶绿体伴侣蛋白60亚基β4基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

本发明获得了吉尔吉斯白桦BkCPN60β4基因及其编码蛋白，BkCPN60β4基因的编码区长度为1248bp，编码415个氨基酸，亚细胞定位表明BkCPN60β4蛋白定位在细胞核和细胞质，BkCPN60β4基因成功转化拟南芥，转基因株系BkCPN60β4基因的表达量高于野生型(WT)，1.5mmol/L和3.0mmol/L>3处理转基因拟南芥与野生型株系，表明转BkCPN60β4基因的拟南芥能够提高对NaHCO₃的耐受性。

附图说明

图1是本发明中吉尔吉斯白桦叶片总RNA电泳图；

图2是本发明中BkCPN60β4基因cDNA的PCR产物的凝胶电泳图，其中，泳道M为2kbMarker，泳道1为以cDNA为模板的BkCPN60β4基因的PCR扩增产物；

图3是本发明中pMD18-T-BkCPN60β4的菌液PCR产物的凝胶电泳图，其中，泳道M为2kb Marker，泳道1-5均为以pMD18-T-BkCPN60β4单菌落；

图4是本发明中pBI121-BkCPN60β4-GFP的菌液PCR产物的凝胶电泳图，其中，泳道M为2kb Marker，泳道1-3均为pBI121-BkCPN60β4-GFP的菌液PCR产物；

图5是本发明中过表达BkCPN60β4基因的拟南芥转基因株系的Kana筛选图；

图6是本发明中过表达BkCPN60β4基因的拟南芥转基因株系的PCR鉴定中BkCPN60β4基因PCR产物的凝胶电泳图，其中，泳道M为2kb Marker，泳道CK+为阳性对照，泳道CK-为阴性对照，泳道1-3为T₂代6#-8#转基因株系；

图7是本发明中过表达BkCPN60β4基因的拟南芥转基因株系的PCR鉴定中35S PCR产物的凝胶电泳图，其中，泳道M为2kb Marker，泳道CK+为阳性对照，泳道CK-为阴性对照，泳道1-3为T₂代6#-8#转基因株系；

图8是本发明中过表达BkCPN60β4基因的拟南芥转基因株系的PCR鉴定中Kana PCR产物的凝胶电泳图，其中，泳道M为2kb Marker，泳道CK+为阳性对照，泳道CK-为阴性对照，泳道1-3为T₂代6#-8#转基因株系；

图9是本发明中过表达BkCPN60β4基因的拟南芥转基因株系的表达量分析图；

图10是本发明中拟南芥萌发后期的NaHCO₃抗性分析中无NaHCO₃处理组的图；

图11是本发明中拟南芥萌发后期的NaHCO₃抗性分析中1.5mmol/L>3处理组的图；

图12是本发明中拟南芥萌发后期的NaHCO₃抗性分析中3.0mmol/L>3处理组的图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式吉尔吉斯白桦叶绿体伴侣蛋白60亚基β4基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

本实施方式中叶绿体伴侣蛋白60亚基β4基因的简写为BkCPN60β4基因。

本实施方式中吉尔吉斯白桦BkCPN60β4基因的编码区全长序列1248bp。

具体实施方式二：本实施方式吉尔吉斯白桦叶绿体伴侣蛋白60亚基β4基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

本实施方式吉尔吉斯白桦BkCPN60β4基因的编码蛋白由415个氨基酸组成。

本实施方式中吉尔吉斯白桦BkCPN60β4基因的获得过程：

1实验材料

1.1植物材料

吉尔吉斯白桦实生苗；野生型拟南芥种子。

1.2菌株与载体

Trans1-T1大肠杆菌感受态细胞；pMD18-T载体；pBI121表达载体；pROKⅡ植物表达载体。

1.3主要试剂和培养基

DNA消化酶、反转录酶、Ex Taq、OMEGA胶回收和质粒提取试剂盒均购自TaKaRa公司， Tip Green qPCR SuperMix荧光染料购自全式金生物公司，其他试剂为国产分析纯。

RNA提取的相关药品：CTAB提取液，5mol/L LiCl，75％乙醇，以上药品需用0.1％DEPC水配制；β-巯基乙醇，氯仿，无水乙醇。

CTAB提取液的组成：2％CTAB(m/v)、20mmol/L EDTA、l00mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1.4mol/L NaCl

LB液体培养基(1L)：酵母5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，纯水1L，高压灭菌后备用；LB固体培养基(1L)：酵母5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂15g，纯水1L，高压灭菌后备用。

1.4实验仪器

电子天平、微量移液器、常温离心机及冷冻离心机、凝胶成像仪、高压灭菌锅、超净工作台、制冰机、PCR仪、摇床、培养箱、恒温水浴槽、旋祸振荡器、核酸测定仪、ABI7500荧光定量PCR仪、基因枪、荧光显微镜。

1.5引物合成与测序

实验中用到的引物均委托北京华大基因公司合成，测序均由哈尔滨博仕生物技术有限公司完成。

所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所使用的材料、试剂、酶、感受态细胞何质粒等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

2实验方法

2.1吉尔吉斯白桦叶片总RNA的提取

准备工作：水浴锅和CTAB提取液预热，取出事先用锡纸包裹的高压灭菌的研钵和研棒进行预冷，离心机预冷(4℃)和其他药品预冷。

(1)向灭菌的1.5ml离心管中加入700μL无水乙醇；

(2)取未做任何处理的吉尔吉斯白桦叶片于液氮中充分研磨，研好后将其立刻加入上述离心管中，振荡3min，12000rpm 4℃时离心10min；

(3)弃去离心后的上清，向上述离心管中加入700μL CTAB提取液、100μLβ-巯基乙醇，振荡5min，65℃水浴5min(其间摇晃数次)，12000rpm 4℃时离心10min；

(4)吸取离心后的上清至新的离心管中，加入预冷的400μL氯仿、400μL水-饱和酚，振荡3min，12000rpm 4℃时离心10min；

(5)重复步骤(4)1次；

(6)吸取离心后的上清至新的离心管中，加入预冷的等体积氯仿，振荡3min，12000rpm4℃时离心10min；

(7)吸取离心后的上清至新的离心管中，加入1/2体积预冷的无水乙醇、0.8倍体积预冷的5mol/L LiCl，振荡混匀，冰浴10min，12000rpm 4℃时离心10min；

(8)弃去离心后的上清，加入700μL 75％乙醇洗涤沉淀，混匀，12000rpm 4℃时离心5min；

(9)弃去离心后的上清，室温干燥10min，加入50μL 0.1％DEPC水溶解沉淀；

(10)1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，核酸测定仪检测RNA纯度，保存于-80℃冰箱，备用。

2.2吉尔吉斯白桦BkCPN60β4基因的克隆

以叶片总RNA为模板，使用M-MLV ReverseTranscriptase进行反转录，合成第一链cDNA，以其作为模板用于PCR扩增，引物BkCPN60β4-F：5'ATGTCCAGAGAGGTTGAAGAT 3'，BkCPN60β4-R：5'GCCAGTCCATCCGCCAAACTAAACG 3'，反应体系参考TaKaRa公司的Ex Taq酶说明书进行。

PCR扩增，反应体系50μL，成分如下：

反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min；16℃终止。

PCR产物用1％琼脂糖凝聚电泳检测。对上述PCR产物进行胶回收，将回收得到的BkCPN60β4基因DNA片段与pMD18-T载体相连接，连接产物转化大肠杆菌，随机挑取白色的单菌落摇菌，进行菌液PCR验证，并测序。

2.3吉尔吉斯白桦BkCPN60β4蛋白的亚细胞定位

BkCPN60β4基因的亚细胞定位引物序列为pBI121-BkCPN60β4-GFP-F：5'GGGGTACCATGTCCAGAGAGGTTGAAGATC 3'，pBI121-BkCPN60β4-GFP-R：5'GGACTAGTAACGCCAATTGGGCTGATACCTG'，以BkCPN60β4基因测序正确的克隆提取质粒，进行PCR扩增，扩增产物胶回收后经KpnⅠ和SpeⅠ双酶切，同时pBI121-GFP质粒也用KpnⅠ和SpeⅠ双酶切；

PCR扩增，反应体系成分如下：

反应条件：95℃预变性2min，95℃变性20s，63℃退火20s，72℃延伸40s，共30个循环，最后72℃延伸5min；4℃终止。

pBI121-GFP质粒双酶切体系：

条件：37°酶切3h，加入10×Loading buffer终止反应。

BkCPN60β4PCR纯化产物双酶切体系：

条件37°酶切3h，加入10×Loading buffer终止反应。

分别回收小片段和大片段，用T4DNA连接酶连接，从而得到pBI121-BkCPN60β4-GFP融合表达载体，转入Trans5α感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行测序验证。测序正确后制备微载体，以pBI121-GFP作为对照组，转化到洋葱表皮细胞，获得高效瞬时表达，从而通过绿色荧光蛋白的荧光信号来确定目标蛋白在细胞内的位置，用该方法以达到确定基因表达产物-蛋白质在细胞中发挥功能的具体部位的目的。

2.4转BkCPN60β4基因拟南芥的获得、PCR鉴定及纯合子筛选

用XbaⅠ和SacⅠ限制性内切酶同时对测序正确的pMD18-T-BkCPN60β4重组质粒和pROKⅡ载体质粒进行双酶切并连接，利用农杆菌介导方法转化拟南芥。收获T₀种子，用1.0mL>-2s^-1)培养6-8d，移栽抗卡那霉素(Kana)的长出两片真叶的绿色幼苗，于组织培养室中进行生长，做好标记便于单株收获T₁代种子，分别命名为1#、2#、3#、4#、5#、6#，7#，8#。

取Kana的每个转基因株系的T₁代种子继续进行Kana筛选，每个转基因株系取12棵抗Kana植株进行移栽，得T₂代转BkCPN60β4基因的幼苗，剪取1-2片嫩叶用于基因组DNA的提取，以35S:BkCPN60β4质粒DNA作为阳性对照，野生型拟南芥DNA为阴性对照，进行PCR检测。自T₂代开始统计分离比，即绿苗与黄化苗株数之比。收获转BkCPN60β4基因株系的T₂代种子时，每个株系的12棵植株单独收种子，分别标记为1#1、1#2….1#12，2#1、2#2….2#12，3#1、3#2….3#12，4#1、4#2….4#12，5#1、5#2….5#12，6#1、6#2….6#12，选取分离比接近3:1的株系继续筛选培养，筛至T₃-T₄代，全为绿苗的株系为纯合株系。

2.5转pROKⅡ-BkCPN60β4基因拟南芥纯合子的实时荧光定量PCR分析

分别以转BkCPN60β4基因的拟南芥T₃代6#4，7#4，8#1株系叶片和WT叶片的cDNA为模板，参照pBIOZOL>-△△CT法分析数据。分析吉尔吉斯白桦BkCPN60β4基因在拟南芥中的表达情况。

荧光定量PCR反应体系和程序分别如下：

反应程序：

融解曲线分析

2.6转pROKⅡ-BkCPN60β4基因拟南芥纯合子的NaHCO₃抗性分析

将WT和转BkCPN60β4基因的拟南芥T₂-6#4；7#4；8#1株系的种子消毒灭菌，春化后于正常的1/2MS培养基上组织培养室培养7d，选取长势一致的幼苗移栽至无NaHCO₃(对照组)和NaHCO₃浓度分别为1.5mmol/L、3.0mmol/L的1/2MS培养基上培养10d，每个处理的每个株系设3次重复，观察幼苗的表型变化。

3结果与分析

3.1总RNA的提取

以吉尔吉斯白桦叶片为材料，采用CTAB法提取总RNA，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示：28S和18S RNA条带清晰可见，并且28S RNA的含量约是18S RNA含量的两倍(图1)，说明成功提取总RNA，可以用于cDNA的反转录。

3.2吉尔吉斯白桦BkCPN60β4基因的克隆及序列分析

将cDNA模板稀释10倍，选用BkCPN60β4基因克隆引物进行PCR扩增，得到的条带(图2)；重组质粒的菌液PCR已扩增出目的条带(图3)，相应的菌液送测序，得知BkCPN60β4基因的编码区长度为1248bp，可编码415个氨基酸。

3.3吉尔吉斯白桦BkCPN60β4蛋白的亚细胞定位分析

选用亚细胞定位引物进行菌液PCR筛选阳性克隆，结果扩增得到目的条带(图4)，转pBI121-BkCPN60β4-GFP的洋葱，在其细胞核和细胞质中均可见到绿色荧光。

3.4转BkCPN60β4基因拟南芥的获得、PCR鉴定及纯合子筛选

取侵染后收获的T₀代种子于Kana浓度为30mg/L的培养基上进行Kana抗性筛选，结果显示：一周左右，绝大多数的种子被Kana杀死，子叶变黄；少数转BkCPN60β4基因种子的子叶保持绿色，且生根继续生长(图5)，待转基因拟南芥长出两片真叶进行移栽。

取WT和各转基因株系(1#-8#)的T₂代嫩叶提取基因组DNA，进行目的基因、35S和Kana鉴定，结果显示(图6、7和8)6#-8#转基因株系均扩增得到BkCPN60β4基因、35S和Kana条带，而WT均未扩增出条带，说明过表达BkCPN60β4基因的拟南芥转化株系鉴定成功。

收获PCR鉴定成功的转基因株系的T₂代种子(单株收种子)继续进行Kana筛选，结果发现转BkCPN60β4基因的拟南芥T₃代株系(6#4；7#4；8#1)在Kana培养基上子叶全部绿色、均长出真叶，且继续生长至生根；而在同一Kana培养基上的WT幼苗全部黄化且不再生长，故转BkCPN60β4基因的T₃代株系(T₃-6#4；7#4；8#1)即为纯合株系，可用于抗性实验分析。

3.5转pROKⅡ-BkCPN60β4基因拟南芥纯合子的实时荧光定量PCR分析

为了检测BkCPN60β4基因在拟南芥纯合株系中的表达情况，以WT作为对照、AtActin作为内参基因，进行qRT-PCR分析，结果表明(图9)，三个转基因株系(T₃-6#4；7#4；8#1)中BkCPN60β4基因的表达量均比WT中高，且BkCPN60β4基因在7#4和8#1转基因株系中的表达量变化显著，分别为WT的24.09和38.45倍。

3.6转pROKⅡ-BkCPN60β4基因拟南芥的NaHCO₃抗性分析

观察表型发现(图10、11和12)，无NaHCO₃时WT和转化子(6#4、7#4、和8#1)的长势均良好，且无明显差别；与无NaHCO₃相比，1.5mmol/L>3处理下WT和转化子(6#4、7#4、和8#1)的株系均变短，但地上部分比WT生长旺盛，且侧根明显增多，根长明显长于WT；与1.5mmol/L>3处理相比，3.0mmol/L>3处理下WT和转化子的株系均变短，但转化子的长势比WT长势好。以上实验说明1.5mmol/L和3.0mmol/L>3均抑制幼苗的生长，但BkCPN60β4基因能够减轻NaHCO₃对转基因拟南芥的抑制作用，表明BkCPN60β4基因能够提高转基因拟南芥对NaHCO₃的耐受性。

序 列 表

<110> 东北林业大学

<120> 吉尔吉斯白桦叶绿体伴侣蛋白60亚基β4基因及其编码蛋白

<160> 10

<210> 1

<211> 1248

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 吉尔吉斯白桦BkCPN60β4基因的核苷酸序列。

<400> 1

atgtccagag aggttgaaga tcatgagctt gtagatgttg ctgcagttag tgcagggaat 60

gattatgtgg tgggaaacat gattgctgat gctcttcgcc aagtgggaag gaagggtgta 120

gtgacaattg aaaaagggaa gtgtaccgag aatagtctac agattgtaga aggaatgcaa 180

tttgatcgtg gatatttgtc tccttacttt gtaactgatc gacaaaagat gacaattgag 240

ttccataatt gcaagttact tttggtcgac aaaaaaatca caaacccaaa ggagatgttt 300

aaaatattgg acagtgcagt taaagagaag tatcccattg tgatagttgc agagggtatt 360

gagcaggaag ctctggctcc agtaattaga aataaactga ggggtgtgct gaaagcagct 420

gctatcaagg ctcctgcctt tggtgagcgc aagagccagt acttggatga catcgccatc 480

ttgactggag gcactgtaat cagagatgag atggggttga gccttgaaaa ggttgggaag 540

gaggtattgg gctcggcaat aaaggtcgtg ataaccaagg gttcaacatt aatagttaca 600

gatgggagca ctcgcaaagc tgttgaagag agggtttctc aaatccggag gcttgtagag 660

aacactgaag aaaaatttca aaaaaagata ctgaatgaga gaatagctag gctgtcagcg 720

ggaattgcca ttcttcaggt aggagcacaa acacaagttg agttgaagga taaacaactc 780

aggcttgaag atgctttgaa tgcaacaaag tcagcaattg aggaaggtgt tgtagttgga 840

gggggctgta cccttttgag gctatctaca acagtagatg gtatcaaaca agtcttggac 900

aatgaagaac agaagattgg agctgagatc ttcaaaagag ctttgagata tcctgtgaga 960

ctgatagcca aaaatgcagg tgtaaatggc aatgtggtta tagaaaaggt tctttctaat 1020

gataatatta attatggata caatgctgca agagaccgtt atgaggattt gatgaaggct 1080

ggaatcatgg atccatcaaa ggtagttaga tgttgtttgg agcatgcagc atctgtagcc 1140

aagacttttc tgacatctga tgctgttgta gttgacatta aggaactaga gcccatcaga 1200

aggagaccac caatgccaac ctcaggtatc agcccaattg gcgtttag1248

<210> 2

<211> 415

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>吉尔吉斯白桦BkCPN60β4基因编码蛋白的氨基酸序列。

<400> 2

atg tcc aga gag gtt gaa gat cat gag ctt gta gat gtt gct gca 45

Met Ser Arg Glu Val Glu Asp His Glu Leu Val Asp Val Ala Ala

5 1015

gtt agt gca ggg aat gat tat gtg gtg gga aac atg att gct gat 90

Val Ser Ala Gly Asn Asp Tyr Val Val Gly Asn Me tIle Ala Asp

202530

gct ctt cgc caa gtg gga agg aag ggt gta gtg aca att gaa aaa 135

Ala Leu Arg Gln Val Gly Arg Lys Gly Val Val Thr Ile Glu Lys

354045

ggg aag tgt acc gag aat agt cta cag att gta gaa gga atg caa 180

Gly Lys Cys Thr Glu Asn Ser Leu Gln Ile Val Glu Gly Met Gln

505560

ttt gat cgt gga tat ttg tct cct tac ttt gta act gat cga caa 225

Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Val Thr Asp Arg Gln

657075

aag atg aca att gag ttc cat aat tgc aag tta ctt ttg gtc gac 270

Lys Met Thr Ile Glu Phe His Asn Cys Lys Leu Leu Leu Val Asp

808590

aaa aaa atc aca aac cca aag gag atg ttt aaa ata ttg gac agt 315

Lys Lys Ile Thr Asn Pro Lys Glu Met Phe Lys Ile Leu Asp Ser

95100 105

gca gtt aaa gag aag tat ccc att gtg ata gtt gca gag ggt att 360

Ala Val Lys Glu Lys Tyr Pro Ile Val Ile Val Ala Glu Gly Ile

110 115 120

gag cag gaa gct ctg gct cca gta att aga aat aaa ctg agg ggt 405

Glu Gln Glu Ala Leu Ala Pro Val Ile Arg Asn Lys Leu Arg Gly

125 130 135

gtg ctg aaa gca gct gct atc aag gct cct gcc ttt ggt gag cgc 450

Val Leu Lys Ala Ala Ala Ile Lys Ala Pro Ala Phe Gly Glu Arg

140 145 150

aag agc cag tac ttg gat gac atc gcc atc ttg act gga ggc act 495

Lys Ser Gln Tyr Leu Asp Asp Ile Ala Ile Leu Thr Gly Gly Thr

155 160 165

gta atc aga gat gag atg ggg ttg agc ctt gaa aag gtt ggg aag 540

Val Ile Arg Asp Glu Met Gly Leu Ser Leu Glu Lys Val Gly Lys

170 175 180

gag gta ttg ggc tcg gca ata aag gtc gtg ata acc aag ggt tca 585

Glu Val Leu Gly Ser Ala Ile Lys Val Val Ile Thr Lys Gly Ser

185 190 195

aca tta ata gtt aca gat ggg agc act cgc aaa gct gtt gaa gag 630

Thr Leu Ile Val Thr Asp Gly Ser Thr Arg Lys Ala Val Glu Glu

200 205 210

agg gtt tct caa atc cgg agg ctt gta gag aac act gaa gaa aaa 675

Arg Val Ser Gln Ile Arg Arg Leu Val Glu Asn Thr Glu Glu Lys

215 220 225

ttt caa aaa aag ata ctg aat gag aga ata gct agg ctg tca gcg 720

Phe Gln Lys Lys Ile Leu Asn Glu Arg Ile Ala Arg Leu Ser Ala

230 235 240

gga att gcc att ctt cag gta gga gca caa aca caa gtt gag ttg 765

Gly Ile Ala Ile Leu Gln Val Gly Ala Gln Thr Gln Val Glu Leu

245 250 255

aag gat aaa caa ctc agg ctt gaa gat gct ttg aat gca aca aag 810

Lys Asp Lys Gln Leu Arg Leu Glu Asp Ala Leu Asn Ala Thr Lys

260 265 270

tca gca att gag gaa ggt gtt gta gtt gga ggg ggc tgt acc ctt 855

Ser Ala Ile Glu Glu Gly Val Val Val Gly Gly Gly Cys Thr Leu

275 280 285

ttg agg cta tct aca aca gta gat ggt atc aaa caa gtc ttg gac 900

Leu Arg Leu Ser Thr Thr Val Asp Gly Ile Lys Gln Val Leu Asp

290 295 300

aat gaa gaa cag aag att gga gct gag atc ttc aaa aga gct ttg 945

Asn Glu Glu Gln Lys Ile Gly Ala Glu Ile Phe Lys Arg Ala Leu

305 310 315

aga tat cct gtg aga ctg ata gcc aaa aat gca ggt gta aat ggc 990

Arg Tyr Pro Val Arg Leu Ile Ala Lys Asn Ala Gly Val Asn Gly

320 325 330

aat gtg gtt ata gaa aag gtt ctt tct aat gat aat att aat tat 1035

Asn Val Val Ile Glu Lys Val Leu Ser Asn Asp Asn Ile Asn Tyr

335 340 345

gga tac aat gct gca aga gac cgt tat gag gat ttg atg aag gct 1080

Gly Tyr Asn Ala Ala Arg Asp Arg Tyr Glu Asp Leu Met Lys Ala

350 355 360

gga atc atg gat cca tca aag gta gtt aga tgt tgt ttg gag cat 1125

Gly Ile Met Asp Pro Ser Lys Val Val Arg Cys Cys Leu Glu His

365 370 375

gca gca tct gta gcc aag act ttt ctg aca tct gat gct gtt gta 1170

Ala Ala Ser Val Ala Lys Thr Phe Leu Thr Ser Asp Ala Val Val

380 385 390

gtt gac att aag gaa cta gag ccc atc aga agg aga cca cca atg 1215

Val Asp Ile Lys Glu Leu Glu Pro Ile Arg Arg Arg Pro Pro Met

395 400 405

cca acc tca ggt atc agc cca att ggc gtt tag 1248

Pro Thr Ser Gly Ile Ser Pro Ile Gly Val

410 415

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物BkCPN60β4-F的核苷酸序列。

<400> 3

atgtccagag aggttgaaga t 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物BkCPN60β4-R的核苷酸序列。

<400> 4

gccagtccat ccgccaaact aaacg 25

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物pBI121-BkCPN60β4-GFP-F的核苷酸序列。

<400> 5

ggggtaccat gtccagagag gttgaagatc 30

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物pBI121-BkCPN60β4-GFP-R的核苷酸序列。

<400> 6

ggactagtaa cgccaattgg gctgatacct g 31

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物AtActin-F的核苷酸序列。

<400> 7

ggtaacattg tgctcagtgg tg 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物AtActin-R的核苷酸序列。

<400> 8

ctcggccttg gagatccaca tc

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BkCPN60β4基因的qRT-PCR引物BkCPN60β4-F'的核苷酸序列。

<400> 9

gcagagggta ttgagcag 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BkCPN60β4基因的qRT-PCR引物BkCPN60β4- R'的核苷酸序列。

<400> 10

aacctttatt gccgagcc 18