一种可同时检测并区分SIV、SRV、STLV的检测引物组及方法

摘要

本发明公开了一种可同时检测并区分SIV、SRV、STLV的检测引物组及方法。检测引物组包括SIV、SRV、STLV三种不同病毒的特异序列引物，并带有特定的Tag序列。其检测方法是通过提取血液样本中的病毒总DNA，通过多重PCR同时扩增三种病毒的目标片段，然后将扩增产物与荧光编码微球及链霉亲和素‑藻红蛋白溶液杂交，通过检测仪器读取MFI值，以此判定是否含有这三种类型的病毒。本发明可同时对SIV、SRV、STLV三种不同类型的病毒进行检测并区分开来。本发明具有高特异性、高灵敏度、快速高效、成本低、结果准确易读等优点，非常适于在各级检测单位进行推广应用。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及实验动物相关病原的检测方法，具体涉及一种可同时检测并区分SIV、SRV、STLV的检测引物组及方法。

背景技术

非人灵长类动物在进化上与人类密切相关，且具有自然分布广、数量多，易于饲养等特点被广泛应用于生殖生理、药物毒理、生物制品和人类疾病模型的研究。我国非人灵长类资源丰富，主要集中在我国广东、广西、云南、四川、海南等南方地区，目前饲养的企业有50余家，存栏规模30万只以上，每年用于科学研究的实验猴有3万余只，每年出口2万余只。随着实验用猴和饲养企业的增多，猴类自身携带的病原逐渐引起人们的关注，使得人类在与猴接触的过程中，感染病原的机会明显增加，特别是那些目前很难治愈的诸如AIDS等疾病的出现，更加增加了职业人员的风险。另外，实验猴携带病原也严重影响科学研究结果的准确性和真实性，损害了企业的经济效益。而目前在实验猴中三种最常携带的病毒为猴D型逆转录病毒(SRV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)和猴T淋巴细胞趋向性病毒(STLV)。

在现有的实验的动物质量检测标准中，对上述三个病原的检测方法仍然采用的ELISA或IFA的检测方法，该检测方法特异性差，灵敏度低，假阳性高，还必须结合WB检测特异性抗体才能最终确诊。ELISA法和IFA法检测的假阳性率高及WB法操作程序复杂，在一定程度上限制了其应用范围。因此，不论是为了保障整个饲养猴群的健康还是饲养人员、科研人员的人身安全，都有必要建立一种方便、快捷、灵敏、特异性强的检测方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种可同时检测并区分SIV、SRV、STLV的检测引物组。

本发明的另一个目的在于提供一种可同时检测并区分SIV、SRV、STLV的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种可同时检测并区分SIV、SRV、STLV的检测引物组，包括三对引物，其核苷酸序列如下所示：

SIV引物：

SIV-F：5’-ACGACCCGGCGGAAAGAAAAAGT-3’(SEQ ID NO:1)；

SIV-B：5’-TGCACCAGATGACGCAGACAGT-3’(SEQ ID NO:2)；

SRV引物：

SRV-F：5’-AYGGGGCTACTGCYCCATA-3’(SEQ ID NO:3)；

SRV-B：5’-GCCATTACCKGCYTGTTGATT-3’(SEQ ID NO:4)；

STLV引物：

STLV-F：5’-GTGCCAATCATGGACCTGCC-3’(SEQ ID NO:5)；

STLV-B：5’-TCCTGGAGCGTCGATTAGAAGG-3’(SEQ ID NO:6)。

优选的，引物SIV-F、SRV-F、STLV-F引物序列的5’端通过间隔臂序列添加有Tag序列。

优选的，引物SIV-F、SRV-F、STLV-F引物的Tag序列分别为：

SIV-F的Tag序列为：5’-ATCTCAATTACAATAACACACAAA-3’(SEQ ID NO:7)；

SRV-F的Tag序列为：5’-TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-3’(SEQ ID NO:8)；

STLV-F的Tag序列为：5’-CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-3’(SEQ ID NO:9)。

优选的，引物SIV-R、SRV-R、STLV-R引物序列的5’端添加有生物素标记。

一种可同时检测并区分SIV、SRV、STLV的方法，包括如下步骤：

1)提取待检样品RNA和合成cDNA；

2)PCR扩增反应；

3)PCR产物与荧光编码微球杂交。

4)信号检测及结果判读。

优选的，PCR扩增反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环33次；72℃延伸5min。

优选的，PCR产物与荧光编码微球溶液的杂交体系为：荧光编码微球溶液20μl，链霉亲和素-藻红蛋白溶液75μl，PCR产物5μl。

优选的，荧光编码微球分别标记有与上述所述Tag序列反向互补的序列。

优选的，PCR产物与荧光编码微球杂交的程序为：45℃杂交35min。

本发明的有益效果是：

本发明具有高特异性、高灵敏度、快速高效、成本低、结果准确易读等有益效果：

1)高特异性：本发明根据SIV、SRV、STLV三个病毒高度保守序列，分别设计了三套特异性引物，三套引物Tm值接近，可接受高退火温度进行PCR反应，保证了可以进行多重PCR反应和高特异性；

2)高灵敏度：由于采取荧光信号读取方式判定检测结果，该检测方法比传统的PCR检测方法要高出1至2个数量级。

3)快速高效：只需提取一份样本即可同时对三个病毒进行检测并予以区分，大大缩短了检测时间和样本量；

3)成本低：由于只需要一份试剂便可检测一份样本的多个指标，打破传统方法一份试剂检测一份样本的一个指标的局限，实现真正的高通量检测，大大降低了检测试剂的成本；

4)结果准确易读：检测荧光信号通过Luminex 200仪器进行读取，不需要进行电泳，检测结果容易判定，准确度高，该检测方法符合现代化检测的需求。

附图说明

图1是实施例3特异性的检测结果图；

图2是实施例4各病毒质粒的灵敏度检测结果图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1可同时检测并区分SIV、SRV、STLV的检测引物组的设计

分别以猴逆转录病毒(SIV)的主要核心蛋白gag基因部分序列(GenBank登录号为M74931.1)、猴逆转录病毒(SRV1，SRV2，SRV3)的p27蛋白中的部分保守基因序列(GenBank登录号分别为M11841.1、AF126467.1、M12349)、猴T淋巴细胞趋向性病毒Ⅰ型的env基因部分序列主要为靶基因，利用Primer Premier 6设计特异性的引物，分别对设计的上游引物的5’端添加Tag序列，Tag序列与引物序列之间用Spacer C18隔开，下游引物5’端添加生物素标记。最后用于PCR扩增的检测引物序列见表1。

表1.SIV、SRV、STLV检测引物组

实施例2可同时检测并区分SIV、SRV、STLV的方法的建立。

(1)病毒总RNA的提取：采用美基生物公司的病毒总RNA提取试剂盒分别对SIV、SRV病毒培养液中的总病毒RNA进行提取，并采用逆转录试剂盒进行逆转录成cDNA.

(2)PCR扩增反应：

20μl反应体系含有：SIVfd 0.2μM，SIVbk 0.2μM，SRVfd0.2μM，SRVbk 0.2μM，STLV1fd 0.2μM，STLVbk0.2μM，Multiplex PCR Assay Kit中反应液10.0μl，PCR Enzyme Mix 0.1μl，待检cDNA2.0μl，用DEPC水补齐到20μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，按如下程序进行PCR反应：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环33次；72℃延伸5min。

(3)PCR产物与荧光编码微球杂交。

A、配制荧光编码微球溶液：将包被有与设计引物的Tag序列反向互补的荧光微球(3种微球购自Luminex公司，浓度为2500个/μl，具体的SIV、SRV、STLV分别对应的荧光编码微球号为MTAG-67、MTAG-15、MTAG-56)用1.1×的Hybrdization Buffer稀释到每微升溶液中含有每种荧光编码微球50个。

B、配制链霉亲和素-藻红蛋白溶液：将1mg/ml的SAPE溶液用1×Hybrdization Buffer稀释到10ug/ml.

C、配制杂交体系：

试剂体积荧光编码微球溶液20μl链霉亲和素-藻红蛋白溶液75μlPCR产物5μl总体积100μl

D、杂交程序：45℃杂交35min

(4)信号检测及结果判读。

通过Luminex 200仪器对杂交产物进行检测及分析，读取每个样本中每种荧光微球的MFI值并统计出平均的MFI值作为判定依据。根据仪器软件设置，选取阴性对照为参考，当样本的MFI值大于1000时，可判为阳性。

实施例3特异性实验

用实施例2的方法同时对SIV、SRV、STLV的混合cDNA模板进行检测，验证特异性。

检测结果显示：三种病毒引物彼此间没有交叉反应(见图1)。

实施例4灵敏度实验

以每个病毒的cDNA为模板，分别对应的采用SIV-F/SIV-R、SRV-F/SRV-R、STLV-F/STLV-R引物组扩增目标片段并克隆到pMD19-T载体中，构建特定质粒，然后进行10倍梯度进行稀释，用实施例2的操作方法分别对稀释后的各梯度质粒DNA进行灵敏度的检测。

检测结果显示：对于SIV，SIVfd/SIVbk引物组对质粒的检测灵敏度为10fg/μl；对于SRV1、SRV2、SRV3，SRVfd/SRVbk引物组对质粒的检测灵敏度分别为100fg/μl、10fg/μl、10fg/μl，对于STLV，STLVfd/STLVbk引物组对质粒的检测灵敏度为1fg/μl(见图2)。

实施例5不同引物组检测效果的比较

用实施例2的方法，采用其他的检测引物组按照实施例4的方法对各浓度的质粒进行灵敏度检测，其他检测引物组序列及检测结果如下表2和表3。

表2其他检测引物组序列

表3不同检测引物组的检测效果比较

备注：检测引物组A来自于本发明的引物组。

检测结果显示：本发明的检测引物组相比其他的引物组具有更高的检测灵敏度，引物彼此间干扰更小；引物组B未出现假阳性，但检测灵敏度有所下降；检测引物组C的阴性对照检测为阳性，表明检测引物组出现了干扰作用。

本发明具有高特异性、高灵敏度、快速高效、成本低、结果准确易读等优点，适合于各级检测单位在实验动物病原检测过程中进行推广应用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省实验动物监测所

<120> 一种可同时检测并区分SIV、SRV、STLV的检测引物组及方法

<130>

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 23

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<213> 人工序列

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<400> 4

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<213> 人工序列

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gtgccaatca tggacctgcc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tcctggagcg tcgattagaa gg22

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cttaaactct acttacttct aatt24

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<212> DNA

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<212> DNA

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aggcagttgg ctgggttcgg tatt24

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<213> 人工序列

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