一组驴源性特征肽及其在驴皮和阿胶胶定性检测中的应用流程

摘要

本发明公开了一组驴源性特征肽及其在驴皮和阿胶胶定性检测中的应用流程，包括五条驴源性特征肽，一组驴源性特征肽在驴皮鉴别方面中的应用流程，包括如下步骤：步骤一：将皮样去毛、皮下脂肪及杂质；步骤二：采用胰蛋白酶酶解：步骤三：进行液质联用检测；步骤四：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测。一组驴源性特征肽在阿胶鉴别方面中的应用流程，包括如下步骤：步骤一：采用胰蛋白酶酶解；步骤二：进行液质联用检测；步骤三：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测。本发明的有益效果是，通过酶解不同物种胶原蛋白的结果进行对比获得一组驴源性特征肽，将驴的特征性多肽序列应用到驴皮和阿胶的定性检测中去。

说明书

技术领域

本发明涉及生物材料应用，特别是一组驴源性特征肽及其驴皮和阿胶胶定性检测中的应用流程。

背景技术

阿胶由驴皮熬制而成，具有滋阴补血等多重，深受广大消费者的欢迎，目前阿胶及阿胶相关的药品、食品、保健食品等系列产品年产值已经超过300亿。由于阿胶的需求大，驴皮的供应量少。一些不法企业在巨大利益的诱惑下不使用驴皮，而使用价格低的马皮、牛皮、猪皮做原料生产阿胶，导致这些假胶不含驴皮源成分，因此寻找专属性强、灵敏度高的检测阿胶中驴源性成分的方法具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，设计了一组驴源性特征肽及其在驴皮和阿胶胶定性检测中的应用流程。

实现上述目的本发明的技术方案为，一组驴源性特征肽及其在驴皮和阿胶胶定性检测中的应用流程，一组驴源性特征肽，包括五条驴源性特征肽，所述五条驴源性特征肽分别为驴源性特征肽1GPTGEPGKPGDK；驴源性特征肽2GATGPAGVR；驴源性特征肽3GEAGPQGAR；驴源性特征肽4GEIGNPGR；驴源性特征肽5GEIGNPGR(P羟基化)。

所述驴源性特征肽1是驴相对于马、牛、羊、猪所特有，驴源性特征肽2是驴相对于马和猪所特有，驴源性特征肽3和驴源性4是驴相对于牛、羊、猪所特有，驴源性特征肽5是驴相对于牛、羊所特有。

一组驴源性特征肽在驴皮鉴别方面中的应用流程，包括如下步骤：

步骤一：将皮样去毛、皮下脂肪及杂质；

步骤二：采用胰蛋白酶酶解：称取皮类样品，利用丙酮进行脱脂处理，加入超纯水将皮溶解，冷冻干燥后称取1.5mg加入去离子水配成一定浓度的蛋白样品，加入变性缓冲液，进行超滤置换为碳酸氢氨缓冲液，加入胰蛋白酶37℃温浴酶解，超滤管离心过滤收集滤液；

步骤三：进行液质联用检测：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→5min，流动相A为95％；5→8min，流动相A为95％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为95％,流速为0.3ml/min；

步骤四：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，根据检测结果可以从驴皮、马皮、牛皮、羊皮和猪皮中区分驴皮，如果五条特征肽全部检出，则该皮样为驴皮：驴源性特征肽1选择m/z380.7→374.82,493.56；驴源性特征肽2选择m/z393.24→384.42,499.3；驴源性特征肽3选择m/z421.71→585.17,656.26；驴源性特征肽4选择m/z400.26→500.2,613.27；驴源性特征肽5选择m/z408.26→345.18,516.22；作为离子对进行MRM扫描。

步骤二中，所述变性缓冲液为0.5MTris-HCl，2.75mM乙二胺四乙酸，0.5M盐酸胍，pH8.0的缓冲液。

步骤四中，所述电喷雾正离子模式以三重四极杆质谱作为检测器，所述其电喷雾离子源为ESI+。

一组驴源性特征肽在阿胶鉴别方面中的应用流程，包括如下步骤：

步骤一：采用胰蛋白酶酶解：称取0.2g胶类样品溶于100ml 1％碳酸氢氨缓冲液，加入胰蛋白酶37℃温浴酶解；超滤管离心过滤收集滤液；

步骤二：进行液质联用检测：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→5min，流动相A为95％；5→8min，流动相A为95％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为95％,流速为0.3ml/min；

步骤三：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，根据检测结果可以从阿胶、马皮胶、牛皮胶、羊皮胶和猪皮胶中区分阿胶：如果五条特征肽全部检出，则该样品为阿胶：驴源性特征肽1选择m/z380.7→374.82,493.56；驴源性特征肽2选择m/z393.24→384.42,499.3；驴源性特征肽3选择m/z421.71→585.17,656.26；驴源性特征肽4选择m/z400.26→500.2,613.27；驴源性特征肽5选择m/z408.26→345.18,516.22；作为离子对进行MRM扫描；

步骤三中，所述电喷雾正离子模式以三重四极杆质谱作为检测器，所述其电喷雾离子源为ESI+。

利用本发明的技术方案制作的一组驴源性特征肽及其驴皮和阿胶胶定性检测中的应用流程，本发明通过Uniprot提供的Peptidemass功能模拟胰蛋白酶酶解不同物种胶原蛋白的结果，并通过将驴的胶原蛋白序列与其他物种胶原蛋白的序列比对获得驴相对于其他物种的特征性多肽序列，并将其应用到驴皮和阿胶的定性检测中去。

附图说明

图1是本发明所述一组驴源性特征肽在驴皮鉴别方面中的应用流程的结构示意图；

图2是本发明所述一组驴源性特征肽在阿胶鉴别方面中的应用流程的结构示意图；

图3是本发明所述驴源性特征肽1的液相质谱检测图；

图4是本发明所述驴源性特征肽2的液相质谱检测图；

图5是本发明所述驴源性特征肽3的液相质谱检测图；

图6是本发明所述驴源性特征肽4的液相质谱检测图；

图7是本发明所述驴源性特征肽5的液相质谱检测图；

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行具体描述，如图1-7所示，一组驴源性特征肽及其在驴皮和阿胶胶定性检测中的应用流程，一组驴源性特征肽，包括五条驴源性特征肽，所述五条驴源性特征肽分别为驴源性特征肽1GPTGEPGKPGDK；驴源性特征肽2GATGPAGVR；驴源性特征肽3GEAGPQGAR；驴源性特征肽4GEIGNPGR；驴源性特征肽5GEIGNPGR(P羟基化)；所述驴源性特征肽1是驴相对于马、牛、羊、猪所特有，驴源性特征肽2是驴相对于马和猪所特有，驴源性特征肽3和驴源性4是驴相对于牛、羊、猪所特有，驴源性特征肽5是驴相对于牛、羊所特有；一组驴源性特征肽在驴皮鉴别方面中的应用流程，包括如下步骤：步骤一：将皮样去毛、皮下脂肪及杂质；步骤二：采用胰蛋白酶酶解：称取皮类样品，利用丙酮进行脱脂处理，加入超纯水将皮溶解，冷冻干燥后称取1.5mg加入去离子水配成一定浓度的蛋白样品，加入变性缓冲液，进行超滤置换为碳酸氢氨缓冲液，加入胰蛋白酶37℃温浴酶解，超滤管离心过滤收集滤液；步骤三：进行液质联用检测：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→5min，流动相A为95％；5→8min，流动相A为95％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为95％,流速为0.3ml/min；步骤四：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，根据检测结果可以从驴皮、马皮、牛皮、羊皮和猪皮中区分驴皮，如果五条特征肽全部检出，则该皮样为驴皮：驴源性特征肽1选择m/z380.7→374.82,493.56；驴源性特征肽2选择m/z393.24→384.42,499.3；驴源性特征肽3选择m/z421.71→585.17,656.26；驴源性特征肽4选择m/z400.26→500.2,613.27；驴源性特征肽5选择m/z408.26→345.18,516.22；作为离子对进行MRM扫描；步骤二中，所述变性缓冲液为0.5MTris-HCl，2.75mM乙二胺四乙酸，0.5M盐酸胍，pH8.0的缓冲液；步骤四中，所述电喷雾正离子模式以三重四极杆质谱作为检测器，所述其电喷雾离子源为ESI+；一组驴源性特征肽在阿胶鉴别方面中的应用流程，包括如下步骤：步骤一：采用胰蛋白酶酶解：称取0.2g胶类样品溶于100ml 1％碳酸氢氨缓冲液，加入胰蛋白酶37℃温浴酶解；超滤管离心过滤收集滤液；步骤二：进行液质联用检测：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→5min，流动相A为95％；5→8min，流动相A为95％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为95％,流速为0.3ml/min；步骤三：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，根据检测结果可以从阿胶、马皮胶、牛皮胶、羊皮胶和猪皮胶中区分阿胶：如果五条特征肽全部检出，则该样品为阿胶：驴源性特征肽1选择m/z380.7→374.82,493.56；驴源性特征肽2选择m/z393.24→384.42,499.3；驴源性特征肽3选择m/z421.71→585.17,656.26；驴源性特征肽4选择m/z400.26→500.2,613.27；驴源性特征肽5选择m/z408.26→345.18,516.22；作为离子对进行MRM扫描；步骤三中，所述电喷雾正离子模式以三重四极杆质谱作为检测器，所述其电喷雾离子源为ESI+。

本实施方案的特点为，一组驴源性特征肽，包括五条驴源性特征肽，所述五条驴源性特征肽分别为驴源性特征肽1GPTGEPGKPGDK；驴源性特征肽2GATGPAGVR；驴源性特征肽3GEAGPQGAR；驴源性特征肽4GEIGNPGR；驴源性特征肽5GEIGNPGR(P羟基化)，一组驴源性特征肽在驴皮鉴别方面中的应用流程，包括如下步骤：步骤一：将皮样去毛、皮下脂肪及杂质；步骤二：采用胰蛋白酶酶解；步骤三：进行液质联用检测；步骤四：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，根据检测结果可以从驴皮、马皮、牛皮、羊皮和猪皮中区分驴皮，如果五条特征肽全部检出，则该皮样为驴皮，一组驴源性特征肽在阿胶鉴别方面中的应用流程包括如下步骤：步骤一：采用胰蛋白酶酶解；步骤二：进行液质联用检测；步骤三：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，根据检测结果可以从阿胶、马皮胶、牛皮胶、羊皮胶和猪皮胶中区分阿胶：如果五条特征肽全部检出，则该样品为阿胶，本发明通过Uniprot提供的Peptidemass功能模拟胰蛋白酶酶解不同物种胶原蛋白的结果，并通过将驴的胶原蛋白序列与其他物种胶原蛋白的序列比对获得驴相对于其他物种的特征性多肽序列，并将其应用到驴皮和阿胶的定性检测中去。

在本实施方案中，试验中使用的碳酸氢铵，胰蛋白酶购自Sigma公司、乙腈、甲酸购自Merck公司。所有试剂均为色谱纯。一组驴源性特征肽在驴皮鉴别方面中的应用流程包括如下步骤：步骤一：将皮样去毛、皮下脂肪及杂质；步骤二：采用胰蛋白酶酶解：称取皮类样品，利用丙酮进行脱脂处理，加入超纯水将皮溶解，冷冻干燥后称取1.5mg加入去离子水配成一定浓度的蛋白样品，加入变性缓冲液，变性缓冲液为0.5MTris-HCl、2.75mM乙二胺四乙酸、0.5M盐酸胍、pH8.0的缓冲液，进行超滤置换为碳酸氢氨缓冲液，加入胰蛋白酶37℃温浴酶解，超滤管离心过滤收集滤液；步骤三：进行液质联用检测：HPLC-TQ-SMS/MS的检测条件如下：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→5min，流动相A为95％；5→8min，流动相A为95％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为95％,流速为0.3ml/min；步骤四：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，根据检测结果可以从驴皮、马皮、牛皮、羊皮和猪皮中区分驴皮，如果五条特征肽全部检出，则该皮样为驴皮：驴源性特征肽1选择m/z380.7→374.82,493.56；驴源性特征肽2选择m/z393.24→384.42,499.3；驴源性特征肽3选择m/z421.71→585.17,656.26；驴源性特征肽4选择m/z400.26→500.2,613.27；驴源性特征肽5选择m/z408.26→345.18,516.22；作为离子对进行MRM扫描。

在本实施方案中，采用ThermoScientific公司Fusion-Orbitrap高分辨质谱仪，所述其离子源为Nanospray Flex纳喷源。胶原蛋白是动物真皮中的主要蛋白，因此本发明在胶原蛋白中选择合适的多肽作为驴皮胶原蛋白的特征性多肽。利用Uniport提供的PeptideMass功能模拟获得胰蛋白酶酶解驴皮、马皮、牛皮、羊皮、猪皮胶原蛋白的结果；利用分子生物学软件MEGA5.0对驴皮、马皮、牛皮、羊皮、猪皮胶原蛋白的序列进行比对。为了验证驴皮特征肽，选择了驴皮、马皮、牛皮、羊皮、猪皮，根据上文所述的样品预处理方法以及EASY-nLC1000-Orbitrap Fusion液质联用分析方法，检测结果显示特征肽的分子量和二级质谱都与理论值相符。

在本实施方案中，一组驴源性特征肽在阿胶鉴别方面中的应用流程，包括如下步骤：步骤一：采用胰蛋白酶酶解：称取0.2g胶类样品溶于100ml 1％碳酸氢氨缓冲液，加入胰蛋白酶37℃温浴酶解；超滤管离心过滤收集滤液；步骤二：进行液质联用检测：HPLC-TQ-SMS/MS的条件如下：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱内径2.1mm)；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→5min，流动相A为95％；5→8min，流动相A为95％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为95％,流速为0.3ml/min；步骤三：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，电喷雾正离子模式以三重四极杆质谱作为检测器，其电喷雾离子源为ESI+，根据检测结果可以从阿胶、马皮胶、牛皮胶、羊皮胶和猪皮胶中区分阿胶：如果五条特征肽全部检出，则该样品为阿胶：驴源性特征肽1选择m/z380.7→374.82,493.56，如图3所示，A：提取离子流；B：一级质谱；C：二级质谱图；；驴源性特征肽2选择m/z393.24→384.42,499.3，如图4所示，A：提取离子流；B：一级质谱；C：二级质谱图；驴源性特征肽3选择m/z421.71→585.17,656.26，如图5所示，A：提取离子流；B：一级质谱；C：二级质谱图；驴源性特征肽4选择m/z400.26→500.2,613.27，如图6所示，A：提取离子流；B：一级质谱；C：二级质谱图；驴源性特征肽5选择m/z408.26→345.18,516.22，如图7所示，A：提取离子流；B：一级质谱；C：二级质谱图；作为离子对进行MRM扫描。

在本实施方案中，实施例1，一组驴源性特征肽的鉴定:

胶原蛋白是动物真皮中的主要蛋白，因此本发明在胶原蛋白中选择合适的多肽作为驴皮胶原蛋白的特征性多肽。利用Uniport提供的PeptideMass功能模拟获得胰蛋白酶酶解驴皮、马皮、牛皮、羊皮、猪皮胶原蛋白的结果；利用分子生物学软件MEGA5.0对驴皮、马皮、牛皮、羊皮、猪皮胶原蛋白的序列进行比对，从而获得的理论的特征肽序列。为了验证驴皮特征肽，选择了驴皮、马皮、牛皮、羊皮、猪皮，根据上文所述的样品预处理方法以及EASY-nLC 1000-Orbitrap Fusion液质联用分析方法。检测结果如图3-7所示，特征肽的分子量和二级质谱都与理论值相符。

其中，EASY-nLC 1000-Orbitrap Fusion液质联用分析方法的检测条件为：第一，采用EASY-nLC 1000纳升液相系统进行分离。其中使用流动相A为2％乙腈的0.1％的甲酸水溶液和流动相B为98％乙腈的0.1％的甲酸水溶液作为检测试剂。其中工作人员可进行设备设置，洗脱梯度设置为第一阶段0→15min，流速为300nL·min-1，流动相A为100％，第二阶段15→70min，流速为300nL·min-1，流动相A为93％→78％，第三阶段70→90min，流速为300nL·min-1，流动相A为78％→65％，第四阶段90→95min，流速为300nL·min-1，流动相A为65％→10％，第五阶段95→105min，流速为450nL·min-1，流动相A为10％，其中的进样量均为1μl。第二，采用0.2mm×3.5cm(5μm粒径)的ReproSil-Pur C18-AQ Trap column进行脱盐富集工作，其中采用的仪器为实验室自制75μm×25cm(3μm粒径)的ReproSil-Pur C18-AQ纳升分析柱分离设备。第三，采用Thermo Scientific公司Fusion-Orbitrap高分辨质谱仪进行检测，其中离子源为Nanospray Flex纳喷源。采用正离子模式进行分析，喷雾电压为2.1kV，离子传输毛细管温度为275℃，S-Lens传输效率设置为60％。一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60,000(m/z＝400)，采集范围为350-1,650Th。二级质谱采用离子阱作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，利用Top20数据依赖模式进行母离子选择，采用CID模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为35％，从而完成检测工作。

本实施方案中，实施例2，驴源性特征肽的MRM检测条件:

利用三重四级杆液质联用方法对以上特征肽进行MRM参数的优化，优化后的MRM参数如表1所示：

表1驴皮特征肽的MRM检测条件

成分母离子(m/z)子离子(m/z)锥孔电压(v)碰撞能量(ev)驴源性特征肽1380.7374.822010驴源性特征肽1380.7493.562010驴源性特征肽2393.24384.421510驴源性特征肽2393.24499.31516驴源性特征肽3421.71585.171816驴源性特征肽3421.71656.261816驴源性特征肽4400.26500.21615驴源性特征肽4400.26613.271615驴源性特征肽5408.26345.181815驴源性特征肽5408.26516.221815

其中，三重四级杆液质联用方法同权利要求书中所述的HPLC-TQ-SMS/MS液质联用检测方法。

上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。