基于横向磁镊的生物单分子操纵检测系统及相应的毛细管

摘要

本发明提供一种基于横向磁镊的生物单分子操纵检测系统，包括透明样品槽，磁铁装置，光源和物镜，其特征在于，所述样品槽的侧壁的内侧面作为单分子连接面，所述单分子连接面与光源所发出的用于照明的平行光束不平行也不垂直，所述物镜的轴线与所述磁铁装置对单分子样品的作用力方向垂直。本发明还提供了一种用于上述分子操纵检测系统的毛细管。本发明能够操纵检测更短的生物单分子；能够提高现有横向磁镊操纵检测的时间和空间分辨率；能够较简单地消除仪器的机械热漂移对检测结果的不利影响。

说明书

技术领域

本发明涉及生物单分子操纵检测技术领域，具体地说，本发明涉及一种基于横向磁镊的生物单分子操纵检测系统及相应的毛细管。

背景技术

生物单分子操纵检测技术是单个分子层面的技术，这种技术能够在胞外实现生物大分子在细胞内受到力或力矩的操纵，因此被越来越多地使用。目前，生物单分子操纵检测技术主要用于研究和DNA或RNA结合的蛋白以及某些蛋白质本身的物理或生物化学性质。现有的单分子操纵检测方法包括光镊法、生物膜力探针法、原子力显微镜法和磁镊法等，这些方法各有其特征及不同的应用范围。其中，磁镊法具有诸多优点，例如：对生物大分子的施力区间是多数生物大分子相互作用的区间，磁镊仪器及实验方法简单，同时能够对多个单分子进行高通量实验。

基于磁镊法的单分子操纵检测过程大致如下：首先对样品槽进行化学修饰，然后在样品槽的玻璃表面(内壁表面)连接DNA等大分子，在DNA分子另一端连接微米量级的超顺磁球(Superparamagnetic Microspheres)，再通过磁铁操纵超顺磁球，最后用成像装置来追踪超顺磁球的位置以获得DNA的相关物理或生物化学信息。现有磁镊装置分为纵向磁镊和横向磁镊，其中纵向磁镊时空分辨率高但成本昂贵且难以做反应长度为10微米以上的实验，而横向磁镊成本低廉且能够做反应长度较长的实验，但时空分辨率较低。图1a示出了现有技术中一种基于横向磁镊装置的单分子操纵检测系统的示意图，参考图1a，该单分子操纵检测系统包括矩形毛细管101、磁铁104和物镜105，图中示出了矩形毛细管101、磁铁104的立体结构，同时示意性地给出了磁铁在单分子操纵检测系统中的相对位置。图1b示出了图1a的矩形毛细管的横截面及单分子操纵检测系统中其它部件的位置关系。参考图1a、图1b，矩形毛细管101呈水平状态放置，其底面连接DNA单分子103的一端，该单分子103的另一端连接超顺磁球102，磁铁104设置在毛细管101的斜上方，在磁铁104的吸引下，超顺磁球102 被拉起，使得单分子103被拉长。物镜105设置在毛细管101的正下方，用于观测被拉直的单分子103以及超顺磁球102，进而实现对单分子103的观测。然而，由于超顺磁球的大小和布朗振动限制，上述磁镊装置只能连接较长的DNA从而时空分辨率较低，且由于是斜拉而使得观测到的布朗振动更大，进一步降低了对生物单分子检测的空间分辨率。

图2a示出了另一种基于横向磁镊的单分子操纵检测系统，该图中，201为样品槽，202为磁球，203为单分子，204为磁铁，205为物镜。该方案中，将被测DNA单分子连接到样品槽201的竖直方向的侧壁上，同时将磁铁204水平设置，通过水平方向的磁力将吸引磁球202，使其将单分子203拉伸并呈水平状态(可参考中国专利申请CN200610081295.5)。用于检测单分子的物镜205则设置在样品槽的正下方，使被平行光束照明的磁球和单分子能够通过物镜205进行观察。这种方案中没有DNA斜拉的问题，但该方案中矩形毛细管壁处往往存在较为明显的阴影。图2b示出了一个经过对比度调整的矩形毛细管壁阴影的示意图，其中阴影的宽度约为20um左右。所以长度较短的DNA的影像会被上述阴影覆盖，导致长度较短的DNA无法检测，从而使横向磁镊的时空分辨率较低。

综上所述，现有横向磁镊的精度已经无法满足某些实验的精度要求，因此，当前迫切需要一种能够提高时间和空间分辨率，应用范围更广的解决方案。

发明内容

本发明的任务是提供一种能够克服上述现有技术缺陷的基于横向磁镊装置的操纵检测生物单分子的解决方案。

根据本发明的一个方面，提供了一种基于横向磁镊的生物单分子操纵检测系统，包括透明样品槽，磁铁系统，光源和物镜，所述样品槽的侧壁的内侧面作为单分子连接面，所述单分子连接面与光源所发出的用于照明的平行光束不平行也不垂直，所述物镜的光轴与所述磁铁装置对单分子样品的作用力方向垂直。

其中，所述单分子连接面与光源所发出的用于照明的平行光束的角度优选为：大约15度到45度。

其中，所述平行光线方向与所述磁铁系统对单分子样品的作用力方向垂直。

其中，所述样品槽为毛细管。

其中，所述毛细管具有平行的上壁和下壁以及连接上壁和下壁的侧壁，作为所述单分子连接面的所述侧壁的内侧面与上壁呈约45度到75度的夹角。

其中，所述侧壁的外侧面具有一段与所述侧壁的内侧面适配的斜面，该斜面能够使从所述单分子连接面进入所述侧壁的平行光束在从侧壁的外侧面出射时仍保持平行。

其中，还包括用于夹持所述毛细管的马蹄形夹具，所述马蹄形夹具上设有液体入口和出口，所述毛细管的两端与所述液体入口和出口连通。

其中，所述毛细管为横截面为矩形的毛细管，所述横截面为矩形的毛细管倾斜放置，以使所述单分子连接面与光源所发出的用于照明的平行光束不平行也不垂直。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于基于横向磁镊的生物单分子检测系统的毛细管，所述毛细管具有平行的上壁和下壁以及连接上壁和下壁的侧壁，作为所述单分子连接面的所述侧壁的内侧面与上壁的角度是45度到75度。

其中，所述侧壁的外侧面具有一段与所述侧壁的内侧面适配的斜面，该斜面能够使从所述单分子连接面进入所述侧壁的垂直于所述上壁的平行光束在从侧壁的外侧面出射时仍保持平行。

与现有技术相比，本发明具有下列技术效果：

1、本发明的基于横向磁镊装置的生物单分子操纵检测系统能够操纵检测长度比现有横向磁镊更短的DNA或RNA等生物单分子。

2、本发明能够提高现有横向磁镊操纵检测的时间和空间分辨率。

3、本发明能够较简单地消除仪器的机械热漂移对检测结果的不利影响。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1a示出了现有技术中一种基于横向磁镊装置的单分子操纵检测方案的示意图；

图1b示出了图1a的矩形毛细管的横截面及单分子操纵检测系统中其它部件的位置关系；

图2a示出了现有技术中另一种基于横向磁镊装置的单分子操纵检测方案的立体示意图；

图2b示出了图2a所示的方案中经过对比度调整的矩形毛细管壁阴影的示意图；

图3a示出了本发明一个实施例的毛细管的立体示意图；

图3b示出了图3a的毛细管的横截面示意图；

图4示出了本发明一个实施例的基于磁镊装置的单分子操纵检测系统的原理示意图；

图5示出了本发明一个实施例中的单分子操纵检测系统主要部件的俯视示意图；

图6示出了本发明一个实施例中的方马蹄形夹板装置的分解示意图；

图7示出了本发明另一个实施例中的基于磁镊装置的单分子检测与操纵系统的示意图。

图8示出了本发明另一种基于纵横比不为1的矩形毛细管的单分子检测与操纵系统的示意图。

具体实施方式

根据本发明的一个实施例，提供了一种基于横向磁镊装置的单分子操纵检测系统，该系统使用了一种特制的毛细管作为连接单分子和磁球(本文中将超顺磁球简称为磁球)的容器，以避免只能斜拉或通过物镜所观测到图像中出现位于容器壁处的阴影区。图3a示出了本实施例的毛细管的立体示意图；图3b示出了图3a的毛细管的横截面示意图。该毛细管的材料为玻璃材质，包括平行的上壁301和下壁302，以及连接上壁301和下壁302的侧壁303。其中上壁301长于下壁302。侧壁303的厚度从上至下逐渐增大，使得侧壁303的内侧面304呈倾斜状态(即侧壁的内侧面304与上壁301不垂直)。在实验中，侧壁303的内侧面304将用于连接单分子，因此，本文中也将侧壁303的内侧面304称为单分子连接面。本实施例中，侧壁303的外侧面还具有与其内侧面304相匹配的斜面305，该斜面305和上壁301的夹角b与侧壁303的内侧面304(即单分子连接面)和上壁301的夹角a适配，使得从单分子连接面进入的平行光束，在从侧壁的外侧面出射时仍保持平行(可参考图4)。通常来说，内侧面304和上壁301的夹角a在45度到75度之间时，效果较佳。

图4示出了本实施例的基于横向磁镊装置的单分子操纵检测系统的原理示意图。其中，x轴代表毛细管的管轴方向，z轴代表单分子的拉伸方 向，y轴代表用于观测的物镜光轴方向，x、y、z轴两两垂直。本实施例中，基于磁镊装置的单分子操纵检测系统包括前面所述的侧壁的内侧面呈倾斜状态的毛细管3，水平放置的磁铁装置2，以及位于所述毛细管下方的物镜1以及CCD和相应的用于数据处理的检测软件和硬件。其中，磁铁装置2采用铷铁硼高强磁性材料制作磁头21。在毛细管3中，侧壁303内侧面304连接单分子4的一端，单分子4的另一端连接磁球5。磁铁2用于吸引连接在毛细管侧壁303的磁球5，单分子4水平拉伸。本实施例中，平行光从毛细管3的上壁301进入毛细管形成科勒照明，然后从侧壁303的内侧面304(即倾斜的单分子连接面)进入侧壁303，再从侧壁303的外侧的斜面305出射。斜面305的角度与内侧面304适配使得出射后仍为平行光并被物镜1所接收。在一个例子中，从物镜收集的光经由和显微镜连接的CCD进行数字成像，然后在计算机上显示，并通过程序实时追踪磁球的位置(图4中未示出物镜以外的显微镜部件以及显微镜所连接的CCD)。

使用上述侧壁的内侧面呈倾斜状态的毛细管进行观测，能够避免物镜所得图像中出现妨碍观察单分子连接端的阴影区。其原因如下：发明人观察发现，传统的横向磁镊装置所观测图像的阴影区只存在于光路中不同材料的分界线附近。进一步地，发明人对传统的基于横向磁镊装置的单分子检测与操纵方案中的阴影区产生的原因进行了分析：由于工艺限制玻璃表面通常不是完美的平面，因此玻璃制毛细管的内侧壁可能具有一些纳米及微米级结构，这些结构对光具有一定的散射作用。而在传统的基于横向磁镊装置的单分子检测和操纵方案中，关心的焦面实际上是一条焦线，在不同的焦线上，玻璃表面的纳米及微米级结构可能导致侧壁上的多处发生散射，而当各散射光的光程差处于相干距离之内时还会进一步发生衍射，形成具有衍射条纹的一片区域。另一方面，基于横向磁镊装置的单分子检测和操纵方案中通常采用科勒照明这一照明方式，其对比度较低，磁球需要距离衍射条纹更远才能较好的探测追踪。而在图4的实施例中，由于采用了侧壁的内侧面呈倾斜状态的毛细管，避免了用于照明的平行光线沿着毛细管侧壁的内侧面传播，使得原本处于光路中不同材料的分界线处的侧壁变为一个具有足够宽度的面，进而避免了不同光传播介质分界线所形成的阴影区对单分子检测和操纵造成的干扰。

本实施例的基于磁镊装置的单分子检测与操纵系统中，由于避开了单 分子连接面处的阴影区，因此能够直接观察到连接在玻璃表面粘死的磁球，从而使得该单分子检测与操纵系统能够检测和操纵长度更短的DNA或RNA分子。这一方面扩展了基于磁镊装置的单分子检测与操纵系统的应用范围，另一方面也能够提升单分子检测与操纵的时间分辨率和空间分辨率，而且可以方便地消除机械热漂移。

对于连有单根DNA等高聚物分子的磁球来说，有：

γ_trans＝6πRη>

f_c＝k^DNA/2πγ_trans>

上述6个公式中：F是磁力的大小；K_B是波尔兹曼常数；T是绝对温度，一般是室温；A是DNA的驻留长度，溶液条件不变，A是常数；γ_trans是磁球的粘滞系数，为常数；η是磁球在溶液中的粘度，为常数；R是磁球的半径，为常数；L是DNA的首末端矩；L₀是DNA的轮廓长度；k_DNA是DNA的弹性系数；<δx²>是磁球在x方向上的振动方差的平均值；>z(f)是仪器在z方向上的振动功率谱；f是磁球布朗运动的频率；f_c是磁球布朗运动截止频率；f_cam是图像获取的频率。

由式(1)和(2)知，在F相同的条件下，<δx²>正比于L，而L正相关于L₀，也就是说仪器在x方向上的噪声正相关于L₀。所以，L越短，仪器在x方向上的噪声越小。此外由于x和y方向的对称性，所以y方向的噪声和x方向相同。另外，由于磁球在三维空间中的振动，仪器在x与y方向上的噪声在z方向上具有分量，所以x与y方向上的噪声与Z方向相关。

由式(2)、(3)、(4)和(5)知，在F固定的条件下，DNA在z方向的振动大小与L₀正相关。

f_c表示体系的时间分辨率，由式(2)、(4)、(5)和(6)知，在F固定的条件下，DNA的时间分辨率f_c与L₀负相关。

所以有如下结论：DNA(被测单分子)越短，系统的时空分辨率越高。现有技术中的横向磁镊操纵检测系统通常只能检测10微米以上的DNA，这导致其时空分辨率不足。而本实施例的单分子检测和操纵系统能够消除了单分子连接面处的阴影区，因此能够探测到连接短DNA的磁球(例如用于实验的DNA长度可达几百纳米，这样就获得了更高的时空分辨率。

另一方面，在一个优选实施例中，光的方向和生物大分子连接面之间的夹角在45度到75度之间，这样既便于避免物镜中的阴影影响单分子的观测，又能够保证在连接更短的单分子样品时，该单分子样品不和毛细管管壁触碰而对布朗运动产生影响，从而有利于产生较高的时间和空间分辨率。

图5示出了本发明一个优选实施例的单分子操纵检测系统主要部件的俯视示意图，该图中示出毛细管的夹持及调节结构。参考图5，单分子检测与操纵系统包括一基座4，基座4上固定有样品台5和磁铁装置2。样品台5为框形结构，夹持固定毛细管的方马蹄形夹具6置于框形结构中。样品台5的两条平行的框架51、52上分别设有具有较高的弹性系数的弹簧53和调节螺钮54，方马蹄形夹具6置于样品台5的框形结构中时，旋转调节螺钮54能够使弹簧53和调节螺钮54将方马蹄形夹具6夹紧固定。并且，通过调节螺钮54的旋转，可以沿着毛细管3轴线方向调节方马蹄形夹具6的位置，以便观测毛细管3中不同位置处的单分子和磁球。在一个例子中，样品台5优选非磁性材料制作，比如铝或铜。磁铁装置2水平放置，磁铁系统2由马达电机控制，此处的马达电机能够使磁头接近或远离毛细管，或者使磁头旋转从而旋转磁球进而旋转生物大分子。基座4向下凸出的圆槽41以便将基座固定到显微镜的载物台上。显微镜的物镜1置于毛细管3的正下方，以便探测毛细管3中的样品。

图6示出了方马蹄形夹具的分解示意图。在该优选施例中，方马蹄形夹具的制作材料为非磁性材料(比如有机玻璃)，以使其不对实验的样品造成影响。方马蹄形夹具包括上夹板63和下夹板64。在使用时，先将毛 细管置于在上夹板63和下夹板64之间，然后用螺栓将上夹板63和下夹板64固定。毛细管3与上夹板63和下夹板64的连接处设有圆槽形的液体入口61和液体出口62，使得毛细管3能够与外界连通并方便地注入或排出液体，并且毛细管3与液体入口61和液体出口62的连接处使用密封圈密封以防止液体从液体入口61和液体出口62的侧面泄露。具体地，参考图6，下夹板64为一方马蹄形板，其上具有三个螺孔65、两个凸柱66以及用于与毛细管3连接的两个环形槽69，环形槽69可容纳密封圈68。上夹板63也是一方马蹄形板，该方马蹄形板具有三个螺孔65、底部设置两个与凸柱66适配的凹槽67以及用于与毛细管3连接的两个环形槽71，环形槽71可容纳密封圈68。在使用时，在下夹板64的环形槽69和上夹板63的环形槽71中嵌入密封圈，然后将毛细管的两端置于上、下夹板的环形槽之间，再将上、下夹板扣紧，使下夹板64两个凸柱66和上夹板63的凹槽67紧密配合，最后再用螺栓70通过螺孔65将上、下夹板锁紧。并且，环形槽71处还设置小孔，形成液体入口61和液体出口62，使得毛细管的两端与外界连通，以便于注入或排出液体。

上述样品台和夹持设备能够辅助固定毛细管位置和角度，从而使磁球连接到需要的位置，并且降低或消除机械振动对样品的影响，并便于观察磁球。

下面进一步给出一个基于上述单分子操纵检测系统的横向磁镊实验优选流程，该流程包括：

a、清洗毛细管以及表面改性处理，这一步耗时5小时左右；

b、清洗马蹄形夹板，这一步耗时约半小时；

c、装配马蹄形夹板和特制的毛细管以及样品的入口和出口(入口和出口连接改造的医用输液管)；

d、把特异性连接抗体灌进和马蹄形夹板装配好的毛细管，反应约1个小时；

e、把钝化试剂灌入毛细管，反应1个小时；

f、把表面处理过的超顺磁球和化学修饰过的DNA混匀，反应十分钟；

g、把连有DNA的磁球灌入毛细管；

h、把带有毛细管的马蹄形夹板斜放到支架上，等待磁球沉淀并连接到毛细管的内斜面上；本步骤中，支架具有一定倾角，使得毛细管的单分子连接面水平(这样可以避免因受重力影响而使磁球无法均匀铺开)，以 保证实验准备阶段磁球能够比较均匀地铺满毛细管中的有效位置。

i、把带有毛细管的马蹄形夹板放到样品台上并固定；

j、灌入毛细管缓冲液，把没有和毛细管内表面连接的磁球冲走；

k、把磁铁用电动机从磁球的远处移动到近处，使磁球受到一定的力，拉长DNA。

l、用程序实时追踪磁球的位置，检验磁球和毛细管之间连接的DNA是否是单根；

m、把要研究的蛋白以及相关的ATP等灌进毛细管，追踪磁球并观察其反应曲线。

另外，本发明的单分子操纵检测系统也可以采用暗场照明方式，例如可以使光源和物镜都位于毛细管下方，其光路原理图如图7所示。这种方案下，物镜所观测的磁球散射光从而被CCD接收形成图像，CCD在其它部分不接收光照。

此外，需要说明的是，图4的实施例仅是基于特制毛细管的单分子操纵检测系统的一个示例，它并不是本发明的唯一实现方式。例如，在另一个实施例中，将图4实施例中毛细管的上壁和下壁的位置翻转，其余保持不变。该实施例的单分子检测与操纵系统虽然结构有所变化，但对实验没有明显影响。

进一步地，根据本发明的另一个实施例，还提供了另一种基于纵横比不为1的矩形毛细管的单分子检测与操纵系统，图8示出了该系统的示意图，该单分子检测与操纵系统包括：矩形毛细管801、磁铁装置804和物镜805。其中，矩形毛细管801倾斜放置，它的一个壁连接单分子802的一端，单分子802的另一端连接磁球803。磁铁装置804水平放置，使得磁球803受到水平方向的吸引力，进而将单分子802拉直，且单分子802呈水平状态。物镜805设置在矩形毛细管801的正下方，用于观测单分子802的状态。该实施例中，由于矩形毛细管呈倾斜状态的放置，也就是说，单分子连接面倾斜设置，与光源所发出的用于照明的平行光束不平行也不垂直。这种状态下，避免了用于照明的平行光线沿着毛细管壁的内侧面811传播，使得原本处于光路中不同材料的分界线处的侧壁变为一个具有足够宽度的面，从而在界限806和807之间形成一个良好的照明区。因此该实 施例也能够避免不同光传播介质分界线所形成的阴影区对单分子检测和操纵造成的干扰。优选地，单分子连接面与光源所发出的用于照明的平行光束的角度约15度到45度。相应地，为使单分子连接面的倾斜角度处于合适的区间(即15度到45度)，本实施例中的矩形毛细管的横截面的纵横比(即长宽比)不为1。

最后应说明的是，以上实施例仅用以描述本发明的技术方案而不是对本技术方法进行限制，本发明在应用上可以延伸为其它的修改、变化、应用和实施例，并且因此认为所有这样的修改、变化、应用、实施例都在本发明的精神和教导范围内。