一种胸腺素α1‑猪干扰素α融合蛋白基因及其重组蛋白的制备方法

摘要

本发明公开了一种胸腺素α1‑猪干扰素α融合蛋白基因及其重组蛋白的制备方法。本发明的经改造后的胸腺素α1‑猪干扰素α融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明同时公开了该基因表达的重组蛋白制备及活性检测的方法，具体涉及胸腺素α1‑猪干扰素α融合蛋白基因的改造、基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达、重组蛋白的制备和发酵培养条件，以及活性检测方法等操作方法的改进等步骤。本发明简单易行，成本较低，实现了胸腺素α1‑猪干扰素α融合蛋白在毕赤酵母中高效稳定分泌表达，表达的重组融合蛋白具有高水平的抗病毒活性和调节免疫细胞活性，为提供具有治疗猪病毒性疾病及免疫调节功能的绿色无残留生物制品奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种胸腺素α1-猪干扰素α融合蛋白基因的改造，还涉及含有该基因的表达载体的构建、毕赤酵母中稳定分泌表达及制备重组胸腺素α1-猪干扰素α融合蛋白的方法，以及重组胸腺素α1-猪干扰素α融合蛋白的抗病毒活性和免疫调节作用，本发明属于动物基因工程与动物病毒学技术领域。

背景技术

胸腺激素是由胸腺上皮细胞产生的多肽激素的总称，又称胸腺肽(thymopeptide)。目前应用的胸腺肽大多是从小牛或猪胸腺中提取纯化得到的多肽物质,其生物活性主要是诱导T细胞分化成熟和调控免疫平衡。在人医临床主要用于自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、红斑狼疮、肾小球肾炎和重症肌无力等,也用于恶性肿瘤、病毒性肝炎及抗生素不能有效控制的感染等疾病的辅助治疗，在兽医尚无临床应用。

胸腺素(Thymosin,T)是由25个以上的氨基酸残基组成，在胸腺肽的各种有效组分中，其活性最高。根据等电点不同，胸腺素可分为α、β和γ家族。α家族中以胸腺素α1(Tα1)的研究最多，Tα1由28个氨基酸残基组成，最初是Goldstein从小牛胸腺组织第五组分(Thymosin Fraction 5,TF5)中分离提纯的一种多肽,分子量为3.1KDa，等电点为4.2[Goldstein AL,etal.Thymosin alpha 1:isolation and sequence analysis of animmunologycally active thymicpolypetide[J].ProcNatlAcadSci USA,1997,74(2):725-729；Low TL,et al.The chemistry and biology of thymosinⅡ.Amino acidsequence analysis of thymosin alpha 1and polypeptide beta l[J].J BiolChem,1979,254(3):987-995.]。不同动物之间胸腺素α1的多肽序列高度保守[Goldstein AL,etal.From lab to bedside:emerging clinical applicationsof thymosin alpha1.Expert OpinBiol Ther,2009；9(5):593-608.]。

1957年Issacs和Lindenmann从流感病毒感染的鸡胚细胞培养液中分离到一种生物活性物质，因其干扰同源和异源病毒复制，因而命名为干扰素(Interferon,IFN)[Isaacs,A,et al.Virus interference.I.The interferon.Proc.R.Soc.LondonSer.1957.B 147:258-267.]。干扰素α(IFN-α)属于I型干扰素，主要功能为“抗病毒细胞因子”。谢海燕、吴丹等克隆了猪IFN-α基因，构建了原核表达载体，并成功地表达了猪IFN-α；葛丽等克隆了猪IFN-α，构建了真核表达载体，并成功地表达了猪IFN-α；曹瑞兵等克隆并改造了猪IFN-α基因，实现了在原核系统中的高效表达；姚清侠等在酵母表达体系中获得有生物学活性的重组猪干扰素α(Porcine Interferona,PoIFN-a)并对其抑制FMDV，PRV，PRRSV的活性进行了研究。干扰素是一种非特异性广谱抗病毒生物制剂，可用于治疗许多病毒性疾病。杨国师等研究发现用猪白细胞干扰素预防注射，能大大降低乳猪发病率，而且以7日龄乳猪开始进行预防注射效果最佳。郑永波等用猪白细胞干扰素进行临床试验，试验结果表明如果直接用干扰素进行治疗，能提高对患病动物的治愈率，若用干扰素配合抗生素及抗病毒药物对患病动物进行治疗，更能显著提高对患病动物的治愈率。张泉军等通过试验和临床扩大试验发现，猪白细胞干扰素对哺乳仔猪和断奶仔猪某些病毒性腹泻或病毒与细菌混合感染引发的腹泻，均有良好的预防和治疗作用。

目前有两个大肠杆菌表达猪干扰素-胸腺素α1融合蛋白的专利申请已公开(申请号分别为：CN200910217774.9和CN201410063007.8)，这两个专利申请均使用原核表达系统来表达GST-猪干扰素α-胸腺素α1融合蛋白，表达的目的蛋白均为包涵体，需要经过包涵体的变性、复性、透析、过柱纯化、蛋白酶切除GST和目的蛋白再纯化(专利申请号为CN200910217774.9，见其说明书第11页；专利申请号CN201410063007.8，见其说明书第3页)，本领域技术人员所熟知的是，包涵体的变性和复性步骤存在诸多不确定因素，整个纯化过程非常复杂且难以进行质量控制，会大大提高目的蛋白的生产成本。

本发明是以毕赤酵母高效分泌表达了胸腺素α1-猪干扰素α(Tα1-PoIFNα)融合蛋白，在摇瓶中重组目的蛋白的表达量可以达到210mg/L，在发酵罐中重组目的蛋白的表达量可以达到1100mg/L，所表达的Tα1-PoIFNα融合蛋白是分泌的，且以可溶的形式存在于培养上清中，只需要经过过滤纯化即可，生产成本很低。迄今为止，国内外未见以毕赤酵母来高效分泌表达Tα1-PoIFNα融合蛋白的报道。综上所述可以得出结论，本发明是国内外以毕赤酵母高效分泌表达Tα1-PoIFNα融合蛋白的首次报道，本发明高效分泌表达的重组Tα1-PoIFNα融合蛋白具有很高的抗病毒活性和调节免疫细胞活性。本发明高效稳定分泌表达的重组Tα1-PoIFNα融合蛋白为提供具有治疗猪病毒性疾病和免疫调节功能的绿色无残留生物制品奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种人工合成的胸腺素α1-猪干扰素α(Tα1-PoIFNα)融合蛋白基因；

本发明的另一目的是提供含上述人工合成的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因的DNA重组载体和宿主细胞；

本发明的再一目的是提供一种制备Tα1-PoIFNα融合蛋白及活性检测的方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的一种胸腺素α1-猪干扰素α(Tα1-PoIFNα)融合蛋白基因，其特征在于所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的一种Tα1-PoIFNα融合蛋白基因是在不改变胸腺素α1和猪干扰素α天然氨基酸序列的前提下，对进行Tα1-PoIFNα融合蛋白基因进行DNA分析及RNA结构预测后进行改造得到的，其能够使Tα1-PoIFNα融合蛋白在毕赤酵母中稳定分泌表达。

本发明还提供了一种包含所述的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因的重组表达载体。

优选的，所述的重组表达载体为甲醇调节型重组酵母表达载体，更优选的，所述的重组载体是将SEQ ID NO.1所示的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因克隆到酵母表达载体pPIC9K中得到的，所述重组表达载体含有EcoRI和Not I酶切位点，一个强启动子AOX1启动子以及一个G418抗性选择位点。

进一步的，本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞为包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的宿主细胞，或者为包含含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的重组表达载体的宿主细胞。

优选的，所述的宿主细胞为真核生物细胞。更优选的，所述的宿主细胞为甲醇营养型重组酵母细胞GS115。

更进一步的，本发明还提供了所述的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因在制备Tα1-PoIFNα融合蛋白中的应用。

本发明提供的一种制备Tα1-PoIFNα融合蛋白的方法，其特征在于是将SEQ IDNO.1所示的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因克隆至表达载体，然后将得到的重组表达载体转化宿主菌，进行重组蛋白的诱导表达，收集纯化即得。

在本发明中，优选的，所述的方法包括以下步骤：

(1)人工合成Tα1-PoIFNα融合蛋白基因，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将合成的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因克隆到酵母表达载体pPIC9K中，电转化GS115感受态细胞后，用MD板及G418+YPD平板筛选，激活培养后在摇瓶中小量或发酵罐中大量以甲醇诱导表达并进行无菌检验；

(3)无菌收集培养上清，经过滤或纯化后制备重组Tα1-PoIFNα融合蛋白，整个过程中进行蛋白无菌检验；

(4)用单克隆抗体对Tα1-PoIFNα融合蛋白进行免疫检测；

(5)检测重组Tα1-PoIFNα融合蛋白的抗病毒活性和调节免疫细胞活性。

在本发明中，优选的，在步骤(1)所述的基因的5’端加入了EcoRI限制性内切酶位点，在其3’端加入了Not I限制性内切酶位点。

在本发明中，优选的，所述的在摇瓶中以甲醇诱导小量表达的条件为每间隔24h加入100％甲醇至甲醇终浓度为0.5～1％(v/v)，即加入量为每毫升培养液中加5～10μL100％甲醇，进行诱导培养，26～30℃250～300r/min震荡培养96～120h，收获培养上清，经过滤或纯化后制备重组Tα1-PoIFNα融合蛋白。

在本发明中，优选的，所述的在发酵罐中以甲醇诱导大量表达的步骤及条件为：1)甘油培养扩增菌体：发酵罐参数设置分别为搅拌速度600～1000r/min，温度26～28℃,控制方式均为P-I-D，维持溶解氧值(DO)在30％至40％；2)甲醇诱导表达：按照8～12mL/L比例在甲醇中加入PTM1培养基，混匀后，以2.4～3.6mL/h/L/初始发酵液的速率加入到发酵罐中诱导表达，以使酵母适应以甲醇为唯一碳源的环境，随后补加甲醇的速率升为4.8～7.2mL/h/L初始发酵液，最后提高补加甲醇的速率至10～12mL/h/L/初始发酵液，开始诱导表达后，每天取表达上清用于蛋白分析，诱导表达72～96h后，结束发酵；收获培养上清，经过滤或纯化后制备重组Tα1-PoIFNα融合蛋白。

具体的，所述方法包括以下步骤：

(1)在不改变天然氨基酸序列的前提下人工合成Tα1-PoIFNα融合蛋白基因Tα1-PoIFNα，该人工合成的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。然后在其5’端加入了EcoR I限制性内切酶位点，在其3’端加入了Not I限制性内切酶位点；将该人工合成的基因克隆至pUC57中获得pUC-Tα1-PoIFNα。

(2)将包含Tα1-PoIFNα融合蛋白基因的质粒pUC-Tα1-PoIFNα和pPIC9K用EcoR I和Not I双酶切，琼脂糖电泳后胶回收Tα1-PoIFNα和pPIC9K片段，连接Tα1-PoIFNα和pPIC9K得到表达载体pPIC9K-Tα1-PoIFNα。

(3)毕赤酵母的电转化

以Sal I或Sac I线性化pPIC9K-Tα1-PoIFNα，与GS115感受态细胞混合后，用BioRad Gene Pulser电转化，电转化产物涂布MD平板，待长出单菌落后分别转接至不同浓度G418+YPD抗性平板上，26～30℃孵育2～3d。

(4)蛋白的诱导表达

从抗性板中挑选单菌落进行活化后诱导培养，检测上清中目的蛋白的表达情况，上清以12000g离心3min，取上清进行纯化，以纯化蛋白进行SDS-PAGE检测。

(5)重组Tα1-PoIFNα融合蛋白的免疫学检测

对收获的上清以12000g离心3min，取上清进行SDS-PAGE，以PoIFNα的单抗经过Western-blot检测目的蛋白的反应原性。

(6)重组Tα1-PoIFNα融合蛋白的活性检测

对收获的上清以12000g离心3min，再取上清过滤，检测过滤后上清中PoIFNα的抗病毒活性和Tα1的调节免疫细胞活性。

在用于重组Tα1-PoIFNα融合蛋白的摇瓶小量制备时，包括以下步骤：

(1)用灭菌牙签挑G418+YPD平板上生长的具有G418抗性的单菌落，挑于3mL的BMGY液体培养基中进行激活培养，培养温度为26～30℃，在摇床中250转/min振荡过夜，至OD600＝2～6，细胞处于对数生长期；

(2)将步骤(1)的培养菌液在1500g和室温条件下离心3min收集沉淀，重悬于5mL的BMMY中，控制溶氧量和防止污染，在30mL的试管中继续在摇床中振荡培养；

(3)每间隔24h加入100％甲醇至终浓度为1％(v/v)，即加入量为每毫升培养液中加10μL100％甲醇，进行诱导培养，26～30℃250r/min震荡培养96～120h，收获培养上清，经过滤或纯化后制备重组衣壳蛋白。

在用于重组Tα1-PoIFNα融合蛋白的大量制备时，本发明采用了5L发酵罐进行发酵表达，步骤为1)甘油培养扩增菌体：发酵罐参数设置分别为搅拌速度600～1000r/min，温度26～28℃,控制方式均为P-I-D，维持溶解氧值(DO)在30％至40％；2)甲醇诱导表达：按照8～12mL/L比例在甲醇中加入PTM1培养基，混匀后，以2.4～3.6mL/h/L/初始发酵液的速率加入到发酵罐中诱导表达，维持此低速率甲醇补加2～3h，以使酵母适应以甲醇为唯一碳源的环境，随后补加甲醇的速率升为4.8～7.2mL/h/L初始发酵液，以此速率维持2h，最后提高补加甲醇的速率至10～12mL/h/L/初始发酵液，同时检测DO值和发酵液温度并判断甲醇是否过量，开始诱导表达后，每天取表达上清用于蛋白分析。诱导表达72～96h后，结束发酵；收获培养上清，经过滤或纯化后制备重组Tα1-PoIFNα融合蛋白。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

(1)本发明是国内外有关Tα1-PoIFNα融合蛋白在酵母中高效分泌表达并具有高生物活性的首次报道。

(2)本发明高效稳定分泌表达的Tα1-PoIFNα融合蛋白为提供具有治疗猪病毒性疾病及免疫调节功能的绿色无残留生物制品奠定了基础。

(3)本发明方法简单易行，成本较低。

附图说明

图1为毕赤酵母表达的本发明Tα1-PoIFNα融合蛋白的SDS-PAGE结果；

M为预染蛋白Marker，1为Tα1-PoIFNα融合蛋白发酵表达上清，2为Tα1-PoIFNα融合蛋白摇瓶表达上清；

图2为毕赤酵母表达的本发明Tα1-PoIFNα融合蛋白Western-blot结果；

M为预染蛋白Marker，1为Tα1-PoIFNα融合蛋白发酵表达上清，2为Tα1-PoIFNα融合蛋白摇瓶表达上清；

图3为毕赤酵母表达的Tα1-PoIFNα融合蛋白过滤后上清的抗病毒活性检测结果。

10^-7、10^-8分别表示将表达的包含重组蛋白的过滤后上清做10^-7和10^-8倍稀释后作用MDBK细胞，然后以VSV感染；Negative为空白未感染VSV的MDBK细胞，无病变，作为阴性对照；Positive为感染VSV的MDBK细胞，几乎100％病变，作为阳性对照；10^-7、10^-8、Negative和Positive图片的拍摄时间近乎一致。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所设定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

实施例1经过改造的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因的合成

对Tα1-PoIFNα融合蛋白基因进行DNA分析及RNA结构预测后进行改造，在不改变天然氨基酸序列的前提下人工合成Tα1-PoIFNα融合蛋白基因，命名为Tα1-PoIFNα，该人工合成的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2Tα1-PoIFNα融合蛋白的小量制备

1、Tα1-PoIFNα融合蛋白基因工程酵母菌种的构建

(1)材料和方法：

毕赤酵母菌Pichiapastoris GS115，pPIC9K表达质粒，均购自美国Invitrogen公司。DNA聚合酶、限制性内切酶EcoR I、Not I、Sac I购自TaKaRa公司，T4 DNA连接酶购自NEB公司。BMGY、BMMY、YPD培养基，见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。质粒抽提试剂盒、PCR产物回收试剂盒购自Axgen公司。一抗为抗猪干扰素α单克隆抗体，为自制，二抗为兔抗鼠IgG-HRP抗体，购自Sigma公司；

(2)表达载体pPIC9K-Tα1-PoIFNα的构建

(a)将实施例1合成的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因Tα1-PoIFNα的5’端加入EcoR I限制性内切酶位点，在其3’端加入了Not I限制性内切酶位点后克隆至pUC57中获得pUC-Tα1-PoIFNα；

(b)将包含Tα1-PoIFNα融合蛋白基因的质粒pUC-Tα1-PoIFNα和pPIC9K分别用EcoRI和Not I双酶切，琼脂糖凝胶电泳后分别胶回收Tα1-PoIFNα和pPIC9K目的片段，将回收的Tα1-PoIFNα和pPIC9K的目的片段连接得到表达载体pPIC9K-Tα1-PoIFNα；

(3)重组毕赤酵母的电转化

使用来源于TaKaRa公司的限制性内切酶Sac I将重组质粒pPIC9K-Tα1-PoIFNα线性化后，与毕赤酵母GS115感受态细胞混合，用BioRad Gene Pulser电转仪电击转化，转化参数为1.5kV、25uF、200Ω；电击后，立即加入l mL冰浴的山梨醇，温育后，将转化菌液涂布于MD平板上，26～30℃孵育3d，待平板上的单菌落长出后，将其分别依次点种在含抗生素G418 250、500、1000、2000、3000mg/L的G418+YPD平板上，26～30℃孵3d，然后将G4182000mg/L G418+YPD平板上的单菌落再分别依次点种在G418 2500、3000mg/L的G418+YPD平板上，26～30℃孵育3d；该重组酵母菌株抵抗G418的能力与其整合质粒拷贝数成正比。

(4)重组蛋白的诱导表达

用灭菌牙签挑G418+YPD平板上生长的含有本发明所述的Tα1-PoIFNα融合蛋白基因Tα1-PoIFNα的G418抗性单菌落，挑于3mL的BMGY液体培养基中进行激活培养，培养温度为28℃，250r/min振荡过夜，至OD600≈6.0，细胞处于对数生长期，得到的培养菌液在1500g和室温条件下离心3min收集沉淀，重悬于5mL的BMMY中，防止污染，在30mL的试管中继续振荡培养，每间隔24h加入100％甲醇至甲醇终浓度为1％(v/v)，即加入量为每毫升培养基中加入10μL100％甲醇，进行诱导培养4d，28℃250r/min振荡培养96h收获上清，然后以12000g离心3min取上清通过SDS-PAGE电泳检测Tα1-PoIFNα融合蛋白(见图1)，结果表明所表达的重组蛋白的大小与预期一致，蛋白的表达量可以达到210mg/L；电泳后将产物转移到硝酸纤维素膜上，进行Western-blot鉴定(见图2)，一抗为抗猪干扰素α单克隆抗体，二抗为兔抗鼠lgG-HRP抗体，结果表明表达得到的重组蛋白能够与抗猪干扰素α单克隆抗体以及兔抗鼠lgG-HRP抗体发生免疫反应。

实施例3Tα1-PoIFNα融合蛋白的大量制备

1、材料：

含有Tα1-PoIFNα融合蛋白基因Tα1-PoIFNα的菌种：GS115(pPIC9K-Tα1-PoIFNα)(实施例2制备)；

仪器：发酵罐、电泳仪；

培养基：YPD、BMGY、BSM和PTM1发酵培养基的具体配置方法见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册；

2、方法：

2.1种子培养和酵母细胞生物量的积累

将冻存的工程菌在YPD琼脂板上划线,26℃培养。至菌落长到2mm,挑取单克隆菌落加入到10mL YPD培养液(种子培养基)中,26℃、250r/min振荡培养24h。将上述培养物1mL接种到200m L YPD培养液中,26℃、250r/min振荡培养24h,使其A600≈10。配制2L BSM培养基,加入5L发酵罐,121℃、30min高压灭菌培养基及发酵罐。待发酵罐内培养基冷却到室温时,用氨水调节BSM培养基的pH值至所需数值,而后加入PTM1培养基和生物素贮备液。将上述100mL YPD培养菌种加入发酵罐,开始发酵罐培养,此为第一阶段即甘油培养扩增菌体,发酵罐参数设置分别为搅拌速度800r/min，温度26℃,控制方式均为P-I-D，维持溶解氧值(DO)在30％至40％，必要时通入纯氧。此阶段每天至少取样1次，测A600和细胞湿重，分析酵母菌生长状态，肉眼和镜下观察菌液，并留上清用于蛋白分析。约24h后DO值上升至接近100％,按照每升12mL PTM1培养基的比例在高压灭菌后的50％甘油中加入PTM1培养基,混匀后，以18.2mL/h/L初始发酵液的速率加入到发酵罐中，至菌体湿重达200g/L。停止补加甘油后，观测DO值上升至接近100％后，继续维持“甘油饥饿”状态30min，转入甲醇诱导表达阶段。

2.2甲醇诱导表达

按照12mL/L比例在甲醇中加入PTM1培养基，混匀后，以3.6mL/h/L初始发酵液的速率加入到发酵罐中诱导表达，维持此低速率甲醇补加2h，以使酵母适应以甲醇为唯一碳源的环境。补加甲醇的速率升为7.2mL/h/L初始发酵液，以此速率维持2h。提高补加甲醇的速率至11mL/h/L初始发酵液，同时检测DO值和发酵液温度并判断甲醇是否过量(停补甲醇观测DO值变化,若停补甲醇后，DO值在1min内上升幅度大于10％，说明碳源受限，反之说明甲醇过量)，若碳源受限，则加快补甲醇的速率，若甲醇过量则应调慢补甲醇的速率，直到合适的速度。开始诱导表达后，每隔12h取样1次，测A600和细胞湿重，分析酵母菌生长状态，肉眼和镜下观察菌液，并取表达上清用于蛋白分析。诱导表达72h后，结束发酵，经检测在发酵罐中重组目的蛋白的表达量可以达到1100mg/L。通过SDS-PAGE电泳(见图1)检测和Western-blot(见图2)鉴定表达上清中的Tα1-PoIFNα融合蛋白。

3、重组Tα1-PoIFNα融合蛋白的大量制备及活性检测

将收获的发酵上清以12000g离心30min后过滤，分别取过滤后上清进行SDS-PAGE和抗病毒活性及调节免疫细胞活性检测(玫瑰花环试验)。

1)抗病毒活性试验：采用MDBK细胞/VSV检测系统，微量细胞病变(cytopathogeniceffect,CPE)抑制法测定重组蛋白的抗病毒活性。在96孔板中以10倍(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9)倍比稀释表达的过滤后上清(每孔50μL，设8个重复)，随后每孔加入100μLMDBK细胞悬液(5×10⁴细胞)，设细胞和病毒对照，37℃、5％CO2培养24h，弃去孔中液体，每孔加入200μLVSV悬液(200TCID₅₀/0.2mL)，细胞对照孔加入200μL培养基，培养36～48h，当病毒对照孔中的MDBK细胞几乎全部发生病变时判定结果，根据细胞的病变程度，记录不同浓度时的保护性。细胞的病变程度分为：无明显的CPE、有25％左右的CPE、有50％左右的CPE、有75％左右的CPE、有100％左右的CPE。结果计算：根据Reed-Muench法计算。保护50％CPE的重组蛋白稀释度中的干扰素量即为1个抗病毒活性单位(IU)。

结果表明，过滤后上清的抗病毒活性为1.2×10⁸IU/mL(见图3)。

2)玫瑰花环试验：Tα1具有促进细胞表面受体表达的活性。根据玫瑰花环试验可测定融合蛋白刺激淋巴细胞表面受体表达的活性，据此判断融合蛋白中胸腺素α1的生物学活性。取试管6支，其中3支各加入Hank's液0.1mL作为对照。另外3支各加样品溶液0.1mL作测定管，每管加脱E受体的淋巴细胞悬液0.2mL，摇匀37℃孵育1h，加入绵羊红细胞悬液0.2mL500r/min离心3min，放入4℃冰箱过夜，次日取出弃上清，每管中加入固定液1滴，轻摇静置10min，加入染色液2滴并摇匀，静置15min后开始计数。视野中淡蓝色的较大细胞为淋巴细胞，共数计数板16个大方格上淋巴细胞个数(200个)，统计其中的E玫瑰花环形成细胞数(结合3个以上绵羊红细胞的淋巴细胞)计玫瑰花环形成率，取各管平均值。按照公式计算Tα1的活性：样品活性＝[(样品测定管平均读数-对照管平均读数)/100]×100％，测定结果如表1所示：

表1Tα1-PoIFNα重组融合蛋白的Tα1活性

玫瑰花环形成平均数(％)活性(％)Hank’s液7-无重组蛋白淋巴细胞对照6-含重组蛋白的过滤后上清2215

以上结果表明，包含重组蛋白的过滤后上清具有明显的Tα1活性。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120> 一种胸腺素α1-猪干扰素α融合蛋白基因及其重组蛋白的制备方法

<130> KLPI161371

<170>PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 624

<212> DNA

<213> Tα1-PoIFNα

<400> 1

tctgatgctg ctgttgatac ttcttctgag attactacta aggatttgaa ggagaagaag 60

gaggttgttg aggaggctga gaacggttct ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct 120

ggttcttgtg atttgccaca aactcactct ttggctcaca ctagagcttt gagattgttg 180

gctcaaatga gaagaatttc tccattctct tgtttggatc acagaagaga tttcggttct 240

ccacacgagg ctttcggtgg taaccaagtt caaaaggctc aagctatggc tttggttcac 300

gagatgttgc aacaaacttt ccaattgttc tctactgagg gttctgctgc tgcttggaac 360

gagtctttgt tgcaccaatt ctacactggt ttggatcaac aattgagaga tttggaggct 420

tgtgttatgc aagaggctgg tttggagggt actccattgt tggaggagga ttctattaga 480

gctgttagaa agtacttcca cagattgact ttgtacttgc aagagaagtc ttactctcca 540

tgtgcttggg agattgttag agctgaggtt atgagatctt tctcttcttc tagaaacttg 600

caagatagat tgagaaagaa ggag 624