一种能降低青贮中玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的微生物制剂

摘要

本发明属于微生物制剂领域，具体涉及一种能降低青贮中玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的植物乳杆菌制剂及其应用。本发明所提供的制剂是由植物乳杆菌CGMCC No.11932制备而成，能够有效降低青贮饲料中的呕吐毒素降低和玉米赤霉烯酮，每千克玉米青贮饲料添加0.05克微生物制剂，密封发酵30天,呕吐毒素降低36.5％，玉米赤霉烯酮降低49.38％；每千克苜蓿青贮饲料添加0.10克微生物制剂，密封发酵35天,呕吐毒素浓度由起始的24.14μg/Kg，降低为18.88μg/Kg，玉米赤霉烯酮浓度降低26.83％；同时，青贮饲料经植物乳杆菌SCI‑03发酵后，质地柔软，具有酸甜清香味，牲畜喜食，消化率可提高20％。

说明书

技术领域：

本发明属于微生物制剂领域，具体涉及一种能降低青贮中玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的植物乳杆菌制剂及其应用。

背景技术：

伴随着我国畜牧行业的不断发展以及高品质饲料价格的不断攀升，青贮饲料以其易操作，耐贮藏和应用范围广的特性已被广泛的应用。

但由于玉米和苜蓿等青贮原料在生长过程中，表面附着的有害霉菌可产生呕吐毒素和玉米赤霉烯酮等霉菌毒素，加之青贮的前期霉菌迅速繁殖也会产生大量的真菌毒素，导致青贮后可能会对家畜的健康产生一定的影响，情况严重可能会导致牲畜的死亡。其中，广泛存在青贮的真菌毒素玉米赤霉烯酮可作用于牲畜的生殖系统，使家畜产生雌性激素亢进症，妊娠期的动物流产、死胎和畸胎等，也可能引起中枢神经系统的中毒症状，如神智抑郁和共济失调等。呕吐毒素对动物有很强的毒性，能引起动物呕吐、腹泻、皮肤刺激、拒食、神经紊乱、流产、死胎等。

目前关于上述毒素降解研究较为广泛，如公布号为CN 105771147A的中国发明专利《玉米赤霉烯酮降解剂及其应用》明公开了一种玉米赤霉烯酮(ZON)降解剂，其包括成分a、或成分a和成分b，其中成分a和成分b的体积比为1：3－3：1；所述成分a经下述步骤获得：产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌K3和枯草芽孢杆菌K4单独培养16－24h后获得各菌液，然后以1：1：1、1：2：2或1：3：3的体积比混匀即得；所述成分b为米曲霉经发酵培养后所获得的米曲霉粗酶液。经试验发现：当产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌K3、枯草芽孢杆菌K4的比例为1:2:2时，ZON降解率达到92.21％；当三种复合益生菌与米曲霉的配比为2:1时，ZON降解率达到95.15％。中国发明专利ZL201110459937.1公布了一种《玉米赤霉烯酮的微生物降解方法》，是用蜡样芽孢杆菌和/或植物乳杆菌菌粉来降解玉米赤霉烯酮。本发明利用蜡样芽孢杆菌和/或植物乳杆菌菌粉对玉米赤霉烯酮进行降解，通过在体外模拟胃肠道环境下分别测定上述菌粉对ZEN的降解效果，摸索出其对ZEN的最佳降解条件，为进一步将其开发为生物解毒剂，用于谷物和饲料中ZEN的降解提供了有力的指导。

但是目前尚未出现能够同时降解玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的益生菌，因此，筛选具有既能降解玉米赤霉烯酮又能降解呕吐毒素功能的微生物制剂，对于畜牧养殖来讲具有重要意义。

发明内容：

为了实现上述目的，本发明提供一种可以降解玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的微生物制剂，所述微生物制剂包含植物乳杆菌，其制备方法具体如下：

(1)植物乳杆菌高密度发酵培养

将植物乳杆菌种子液按5-10％接种量接入高密度发酵培养基，初始pH6.5-7.0，通氮气保持压力0.03-0.05MPa，转速60-80r/min，恒pH 5.5-5.9，37℃发酵5-8h，植物乳杆菌活菌数达到10¹⁰CFU/mL以上，制得发酵液；

高密度发酵培养基：大豆蛋白粉60-80g，葡萄糖40-80g，无水乙酸钠10-20g，K₂HPO₄7-10g，柠檬酸钠9-12g，酵母粉7-15g，吐温-80>

(2)添加保护剂

向发酵液直接添加保护剂干粉，混合均匀，保护剂各组分与发酵液的质量比组成为：脱脂乳3.0-8.0％(m/m)，海藻糖1.5-5.0％(m/m)，大豆蛋白粉10-15％(m/m)，维生素C0.4-0.6％(m/m)；

(3)干燥

将上述与保护剂混合均匀的发酵液，经冷冻干燥得到冻干菌粉微生物制剂，获得菌粉植物乳杆菌活菌数可以达到2×10¹¹CFU/g以上；

进一步地，所述植物乳杆菌具体为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SCI-03，该菌株已于2015年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号CGMCC No.11932；

所述菌种植物乳杆菌SCI-03(初始接种量1×10⁶CFU/mL)在含有100μg/L玉米赤霉烯酮的MRS液体培养基中，25℃恒温培养24小时后，玉米赤霉烯酮浓度降为58μg/L，植物乳杆菌SCI-03活菌数为8×10⁶CFU/mL，显著降低玉米赤霉烯酮含量；植物乳杆菌SCI-03(初始接种量1×10⁶CFU/mL)在含有100μg/L呕吐毒素的MRS液体培养基中，25℃恒温培养24小时后，玉米赤霉烯酮浓度降为68μg/L，植物乳杆菌SCI-03活菌数为7×10⁶CFU/mL，降解效果显著。

所述可以降解玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的微生物制剂的使用方法如下：

每千克青贮饲料添加0.05-0.10克微生物制剂，密封发酵30-35天,可使青贮饲料中的呕吐毒素降低40％左右，玉米赤霉烯酮降低50％左右。

有益效果：

1、本发明提供的微生物制剂能够有效降低青贮饲料中的呕吐毒素降低和玉米赤霉烯酮，每千克玉米青贮饲料添加0.05克微生物制剂，密封发酵30天,呕吐毒素浓度降低36.5％，玉米赤霉烯酮浓度降低49.38％；每千克苜蓿青贮饲料添加0.10克微生物制剂，密封发酵35天,呕吐毒素浓度由起始的24.14μg/Kg，降低为18.88μg/Kg，玉米赤霉烯酮浓度降低26.83％；

2、植物乳杆菌SCI-03能够将青贮原料中的碳水化合物转化成有机酸，苯乳酸、抗菌多肽、细菌素、二氧化碳使pH降低，抑制有害菌的生长，提高贮藏稳定性，而且青贮料中氨态氮浓度减少，丁酸浓度降低，乳酸浓度增加，从而提高青贮饲料质量和适口性，使干物质损失降低。青贮饲料经植物乳杆菌SCI-03发酵后，质地柔软，具有酸甜清香味，牲畜喜食，消化率可提高20％。

具体实施方式：

实施例1植物乳杆菌SCI-03降解毒素能力测定

(1)菌种的活化:将-80℃冷冻保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SCI-03接种于5ml MRS液体培养基中(MRS培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三钠2g，吐温-801g，硫酸镁200mg，硫酸锰54mg，蒸馏水1000mL，pH6.5 121℃15min灭菌备用)，37℃培养18小时，如此传代培养2次得到活化的菌种；

(2)种子培养：将上述活化好的菌种按2％接种于种子培养基中，37℃静置培养10小时；

种子培养基：大豆蛋白粉60g，葡萄糖40g，无水乙酸钠10g，K₂HPO₄>

(3)植物乳杆菌高密度发酵培养

将植物乳杆菌种子液按5％接种量接入高密度发酵培养基，初始pH7.0，通氮气保持压力0.03MPa，转速60r/min，恒pH 5.9，37℃发酵5h，植物乳杆菌活菌数达到10¹⁰CFU/mL以上；

高密度发酵培养基：大豆蛋白粉60g，葡萄糖40g，无水乙酸钠10g，K₂HPO₄7g，柠檬酸钠9g，酵母粉7g，吐温-80>

(4)玉米赤霉烯酮降解能力测定：MRS液体培养基中添加100μg/L玉米赤霉烯酮后，按1×10⁶CFU/mL浓度接入步骤(3)制得的植物乳杆菌SCI-03培养液，25℃恒温培养24小时后，测定玉米赤霉烯酮的浓度为58μg/L，显著降低玉米赤霉烯酮含量；

(5)呕吐毒素降解能力测定：MRS液体培养基中添加100μg/L呕吐毒素后，按1×10⁶CFU/mL浓度接入步骤(3)制得的植物乳杆菌SCI-03培养液，25℃恒温培养24小时后，测定呕吐毒素浓度降为68μg/L，降解效果显著；

MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。

玉米赤霉烯酮和呕吐毒素均经过0.22μm的膜进行过滤除菌。

实施例2：一种微生物制剂的制备及其在玉米青贮中的应用

(1)菌种的活化:将-80℃冷冻保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SCI-03接种于5ml MRS液体培养基中(MRS培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三钠2g，吐温-801g，硫酸镁200mg，硫酸锰54mg，蒸馏水1000mL，pH6.5 121℃15min灭菌备用)，37℃培养18小时，如此传代培养2次得到活化的菌种；

(2)种子培养：将上述活化好的菌种2％接种于种子培养基中，37℃静置培养10小时；

种子培养基：大豆蛋白粉60g，葡萄糖40g，无水乙酸钠10g，K₂HPO₄7g，柠檬酸钠9g，酵母粉7g，吐温-80>

(3)植物乳杆菌高密度发酵培养

将植物乳杆菌SCI-03种子液按8％接种量接入高密度发酵培养基，初始pH6.5，通氮气保持压力0.04MPa，转速70r/min，恒pH 5.5，37℃发酵6h，植物乳杆菌活菌数达到10¹⁰CFU/mL以上；

高密度发酵培养基：大豆蛋白粉70g，葡萄糖60g，无水乙酸钠15g，K₂HPO₄8g，柠檬酸钠10g，酵母粉10g，吐温-80>

(4)添加保护剂

发酵液直接添加保护剂干粉混合均匀，保护剂各组分与发酵液的质量比组成为：脱脂乳3.0％(m/m)，海藻糖1.5％(m/m)，大豆蛋白粉10％(m/m)，维生素C 0.4％(m/m)；

(5)干燥

将上述与保护剂混合均匀的发酵液经冷冻干燥得到冻干菌粉，获得菌粉植物乳杆菌活菌数可以达到5×10¹¹CFU/g；

(6)玉米青贮中玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的降解

每千克青贮饲料添加0.05克微生物制剂，密封发酵30天,呕吐毒素浓度由起始的44.98μg/Kg，降低为28.54μg/Kg，玉米赤霉烯酮浓度由起始的102.61μg/Kg，降低为51.94μg/Kg。

实施例3：一种微生物制剂的制备及其在苜蓿青贮中的应用

(1)菌种的活化:将-80℃冷冻保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SCI-03接种于5ml MRS液体培养基中(MRS培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三钠2g，吐温-801g，硫酸镁200mg，硫酸锰54mg，蒸馏水1000mL，pH6.5 121℃15min灭菌备用)，37℃培养18小时，如此传代培养2次得到活化的菌种；

(2)种子培养：将上述活化好的菌种按2％接种于种子培养基中，37℃静置培养10小时；

种子培养基：大豆蛋白粉60g，葡萄糖40g，无水乙酸钠10g，K₂HPO₄>

(3)植物乳杆菌高密度发酵培养

将植物乳杆菌SCI-03种子液按10％接种量接入高密度发酵培养基，初始pH7.0，通氮气保持压力0.05MPa，转速80r/min，恒pH 5.7，37℃发酵8h，植物乳杆菌活菌数达到10¹⁰CFU/mL以上；

高密度发酵培养基：大豆蛋白粉80g，葡萄糖80g，无水乙酸钠20g，K₂HPO₄10g，柠檬酸钠12g，酵母粉15g，吐温-80>

(4)添加保护剂

发酵液直接添加保护剂干粉混合均匀，保护剂各组分与发酵液的质量比组成为：脱脂乳8.0％(m/m)，海藻糖5.0％(m/m)，大豆蛋白粉15％(m/m)，维生素C 0.6％(m/m)；

(5)干燥

将上述与保护剂混合均匀的发酵液冷冻干燥得到冻干菌粉，获得菌粉植物乳杆菌活菌数可以达到4×10¹¹CFU/g；

(6)苜蓿青贮中玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的降解

每千克青贮饲料添加0.10克微生物制剂，密封发酵35天,呕吐毒素浓度由起始的24.14μg/Kg，降低为18.88μg/Kg，玉米赤霉烯酮浓度由起始的62.76μg/Kg，降低为45.92μg/Kg。

玉米赤霉烯酮的检测方法：

流动相：A水，B(V(乙腈)：V(水)＝36:64)，流速为0.5mL/min，分析柱：ZORBAXElipse AAA C18(3.5um，4.6×150mm)；检测器：FLD(荧光检测器)；激发波长：235nm；发射波长，460nm。

质谱条件：质谱模式：ESI正离子；毛细管电压：2.5KV；锥孔电压：40V；锥孔气流量:0L/Hr；脱溶剂气流量：600L/Hr；源温：100℃，脱溶剂温度：600℃。

呕吐毒素的检测方法：

流动相：A(V水：V甲醇：V乙腈＝96:2:2)，每1000mL A中加5mg叠氮化钠，B乙腈，流速：0.5ml/min，分析柱：C18(5um，4.6×100mm)，检测器：VWD，检测波长：220nm.

质谱条件：质谱模式：ESI正离子；毛细管电压:2.5KV；锥孔电压：40V；锥孔气流量:0L/Hr；脱溶剂气流量：600L/Hr；源温：100℃，脱溶剂温度：600℃。