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抗倒伏分子标记及其多态性在鉴定玉米抗倒伏性状中的应用

摘要

本发明公开了抗倒伏分子标记及其多态性在鉴定玉米抗倒伏性状中的应用。本发明公开的应用中,抗倒伏分子标记为Br2基因或subr2基因,或以玉米的基因组DNA为模板、采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子;A1由序列1的第6336‑6355位所示的单链DNA和与序列1的第6648‑6667位所示单链DNA反向互补的单链DNA组成。实验证明,利用本发明的抗倒伏分子标记可以鉴定玉米的抗倒伏性状:与两条染色体都含有Br2基因的BB基因型相比,两条染色体都含有subr2基因的bb基因型玉米的株高、雌穗穗位高、去雄穗株高以及相对穗位高均显著降低。

著录项

  • 公开/公告号CN106544423A

    专利类型发明专利

  • 公开/公告日2017-03-29

    原文格式PDF

  • 申请/专利权人 中国农业大学;

    申请/专利号CN201610929888.6

  • 申请日2016-10-31

  • 分类号C12Q1/68;C12N15/11;

  • 代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司;

  • 代理人关畅

  • 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号

  • 入库时间 2023-06-19 01:48:18

法律信息

  • 法律状态公告日

    法律状态信息

    法律状态

  • 2020-03-20

    授权

    授权

  • 2017-04-26

    实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20161031

    实质审查的生效

  • 2017-03-29

    公开

    公开

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中抗倒伏分子标记及其多态性在鉴定玉米抗倒伏性状中的应用。

背景技术

在上世纪50、60年代,小麦、水稻等作物由于施用化肥而造成的高杆倒伏现象愈加严重,制约了作物产量的进一步提高。为解决这一问题,育种家利用水稻中的sd1和小麦中的rht1等半矮化基因分别对相应农作物进行改良,育成的矮杆品种有效解决了倒伏问题,大大提高了作物单产,从而引发了第一次绿色革命。然而,由于株高这一性状大多由微小多基因组成的qtl控制,因此在玉米中选育半矮杆品种的效率仍然很低,而且选出的基因往往在降低株高的同时雌穗也相应减小。目前已报道过的玉米矮杆基因包括编码参与赤霉素早期生物合成过程的细胞色素P450的Dwarf3(D3)基因,编码参与贝壳杉烯合成途径酶的Anther ear1(An1)基因,以及在玉米茎干中编码调节生长素运输的P-糖蛋白的Br2基因。虽然玉米的等位基因多样性非常丰富,但目前仍未发现像水稻中sd1和小麦种rht1基因一样的既能有效降低株高又对产量性状影响不大的基因。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定玉米的抗倒伏性状。

为解决上述技术问题,本发明首先提供了抗倒伏分子标记或其多态性在鉴定玉米抗倒伏性状中的应用;

所述抗倒伏分子标记,为以玉米的基因组DNA为模板、采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子;

所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成,所述P1为与玉米基因组DNA中序列1的第6377位上游特异结合的单链DNA,所述P2为m1)或m2):m1)与玉米基因组DNA中序列1的第6617位下游特异结合的单链DNA;m2)与玉米基因组DNA中序列1的第6632位下游特异结合的单链DNA。

上述应用中,所述玉米抗倒伏性状可体现在株高、雌穗穗位高、去雄株高和/或雌穗相对穗位高上。

上述应用中,所述雌穗相对穗位高为所述雌穗穗位高与所述株高的比值。

上述应用中,所述抗倒伏分子标记是基于玉米基因组中是否含有序列1的第6377-6617位获得的。含有序列1的第6377-6617位的玉米的抗倒伏能力低于不含序列1的第6377-6617位的玉米,具体为:含有序列1的第6377-6617位的玉米的株高低于不含序列1的第6377-6617位的玉米;含有序列1的第6377-6617位的玉米的雌穗穗位高低于不含序列1的第6377-6617位的玉米;含有序列1的第6377-6617位的玉米的去雄株高低于不含序列1的第6377-6617位的玉米;含有序列1的第6377-6617位的玉米的雌穗相对穗位高小于不含序列1的第6377-6617位的玉米。

上述应用中,所述抗倒伏分子标记为序列1的第6336-6667位或序列2的第6328-6427位所示的DNA分子;

所述P1为序列1的第6336-6355位所示的单链DNA,所述P2为与序列1的第6648-6667位所示单链DNA反向互补的单链DNA。

上述应用中,所述抗倒伏分子标记可为n1)或n2):n1)Br2基因或subr2基因;所述Br2基因的序列如序列表中序列1的第1-6655位所示,所述subr2基因的序列如序列表中序列1的第1-6415位所示;

n2)序列1所示的DNA分子或序列2所示的DNA分子。

为解决上述技术问题,本发明还提供了鉴定玉米基因型的方法。

本发明所提供的鉴定玉米基因型的方法中,所述基因型为BB基因型、Bb基因型和bb基因型,所述方法包括如下Ⅰ或Ⅱ或Ⅲ或Ⅵ:

Ⅰ、检测待测玉米基因组DNA中对应于序列表中序列1所示的DNA片段,如所述待测玉米基因组中两条染色体均为下述g1)的染色体,所述待测玉米为BB基因型;如所述待测玉米基因组中两条染色体均为下述g2)的染色体,所述待测玉米为bb基因型;如所述待测玉米基因组中两条染色体中一条为下述g1)的染色体,另一条为下述g2)的染色体,所述待测玉米为Bb基因型;

g1)对应于序列1所示的DNA片段含有序列1的第6377-6617位所示的DNA片段;

g2)对应于序列1所示的DNA片段不含序列1的第6377-6617位所示的DNA片段;

Ⅱ、检测待测玉米基因组DNA中对应于序列表中序列1的第6377-6632位所示的DNA片段,如所述待测玉米基因组中两条染色体均为下述h1)的染色体,所述待测玉米为BB基因型;如所述待测玉米基因组中两条染色体均为下述h2)的染色体,所述待测玉米为bb基因型;如所述待测玉米基因组中两条染色体中一条为下述h1)的染色体,另一条为下述h2)的染色体,所述待测玉米为Bb基因型;

h1)对应于序列表中序列1的第6377-6632位为序列1的第6377-6632位;

h2)对应于序列表中序列1的第6377-6632位为序列2的第6369-6392位;

Ⅲ、如下K1)和K2):

K1)以待测玉米基因组DNA为模板,采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物;

K2)检测步骤K1)得到的PCR产物,根据所述PCR产物确定玉米基因型:

所述PCR产物含有A1且不含A2,所述待测玉米的基因型为BB基因型;所述PCR产物含有所述A1和所述A2,所述待测玉米的基因型为Bb基因型;所述PCR产物含有所述A2且不含所述A1,所述待测玉米的基因型为bb基因型;

所述A1为一个含有a1的DNA分子,所述A2为一个不含有所述a1的DNA分子;所述a1为序列1的第6377-6617位所示的DNA片段或其任一片段;

Ⅵ、包括如下L1)和L2):

L1)以待测玉米基因组DNA为模板,采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物;

L2)下述L21)或L22):

L21)检测步骤L1)得到的PCR产物的大小,根据所述PCR产物的大小确定玉米基因型:

所述PCR产物含有332bp和100bp的DNA片段的所述待测玉米的基因型为Bb基因型;所述PCR产物含有332bp的DNA片段且不含有100bp的DNA片段的所述待测玉米的基因型为BB基因型;所述PCR产物不含有332bp的DNA片段且含有100bp的DNA片段的所述待测玉米的基因型为bb基因型;

L22)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列,根据所述PCR产物确定玉米基因型:

所述PCR产物含有序列1的第6336-6667位所示的DNA片段和序列2的第6328-6427位所示的DNA片段的所述待测玉米的基因型为Bb基因型;所述PCR产物含有序列2的第6328-6427位所示的DNA片段、不含序列1的第6336-6667位所示的的DNA片段,所述待测玉米的基因型为bb基因型;所述PCR产物含有序列1的第6336-6667位所示的DNA片段、不含序列2的第6328-6427位所示的的DNA片段,所述待测玉米的基因型为BB基因型。

上述方法中,所述检测步骤K1)得到的PCR产物可为检测所述PCR产物的大小或序列,根据所述PCR产物确定玉米基因型为根据所述PCR产物的大小或序列进行确定。

上述方法中,采用所述A1进行PCR扩增的反应体系中所述P1和所述P2的浓度均可为0.2pmol/μL。所述反应体系中可含有PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和/或水。其中,所述PCR缓冲液具体可为TaKaRa的2×GC Buffer I。所述dNTPs具体可为TaKaRa的dNTPMixture。所述DNA聚合酶具体可为TaKaRa的TaKaRa LA Taq。

上述方法中,采用所述A1进行PCR扩增的退火温度可为55℃。采用所述A1进行PCR扩增的退火条件可为55℃30s。采用所述A1进行PCR扩增的变性、退火和延伸条件可为94℃30s,55℃30s,72℃2min。采用所述A1进行PCR扩增的变性、退火和延伸的循环数可为35。采用所述A1进行PCR扩增前可增加条件1,所述条件1为变性′、退火′、延伸′。所述条件1的循环数可为1-10,如5。所述退火′的温度在不同的循环数下可不同,如每个循环的退火′温度可在前一个循环的基础上降低1℃,第一个循环的退火′温度可为65℃。所述变性′的条件可为94℃30s。所述延伸′的条件可为72℃2min。采用所述A1进行PCR扩增的反应条件具体可为实施例中表2。

为解决上述技术问题,本发明还提供了鉴定玉米抗倒伏性状的方法。

本发明所提供的鉴定玉米抗倒伏性状的方法,包括:利用所述鉴定玉米基因型的方法鉴定待测玉米的基因型,BB基因型的待测玉米的抗倒伏能力低于或候选低于bb基因型的待测玉米。

为解决上述技术问题,本发明还提供了鉴定玉米抗倒伏性状的方法。

本发明所提供的鉴定玉米抗倒伏性状的方法,包括下述G1)、G2)、G3)和/或G4):

G1)鉴定玉米的株高,所述鉴定玉米的株高包括:利用所述鉴定玉米基因型的方法鉴定待测玉米的基因型,BB基因型的待测玉米的株高低于或候选低于bb基因型的待测玉米;

G2)鉴定玉米的雌穗穗位高,所述鉴定玉米的雌穗穗位高包括:利用所述鉴定玉米基因型的方法鉴定待测玉米的基因型,BB基因型的待测玉米的雌穗穗位高低于或候选低于bb基因型的待测玉米;

G3)鉴定玉米的去雄株高,所述鉴定玉米的去雄株高包括:利用所述鉴定玉米基因型的方法鉴定待测玉米的基因型,BB基因型的待测玉米的去雄株高低于或候选低于bb基因型的待测玉米;

G4)鉴定玉米的雌穗相对穗位高,所述鉴定玉米的雌穗相对穗位高包括:利用所述鉴定玉米基因型的方法鉴定待测玉米的基因型,BB基因型的待测玉米的雌穗相对穗位高低于或候选低于bb基因型的待测玉米。

为解决上述技术问题,本发明还提供了鉴定玉米抗倒伏性状的引物对。

本发明所提供的鉴定玉米抗倒伏性状的引物对,为所述A1。

为解决上述技术问题,本发明还提供了所述抗倒伏分子标记。

为解决上述技术问题,本发明还提供了下述1)、2)、3)、4)或5):

1)所述A1在下述H1-H11中任一种中的应用:

H1、制备鉴定玉米抗倒伏性状产品;

H2、制备鉴定玉米株高产品;

H3、制备鉴定玉米雌穗穗位高产品;

H4、制备鉴定玉米去雄株高产品;

H5、制备鉴定玉米雌穗相对穗位高产品;

H6、鉴定玉米抗倒伏性状;

H7、鉴定玉米株高;

H8、鉴定玉米雌穗穗位高;

H9、鉴定玉米去雄株高;

H10、鉴定玉米雌穗相对穗位高;

H11、玉米育种;

2)检测所述抗倒伏分子标记的物质在上述H1-H11中任一种中的应用;

3)所述抗倒伏分子标记在上述H1-H11中任一种中的应用;

4)所述鉴定玉米基因型的方法在上述H6-H11中任一种中的应用;

5)所述鉴定玉米抗倒伏性状的方法在玉米育种中的应用。

为解决上述技术问题,本发明还提供了玉米育种方法。

本发明所提供的玉米育种方法,按照所述鉴定玉米基因型的方法鉴定玉米的基因型,选择bb或Bb基因型的玉米作为亲本进行育种。

本发明中,所述玉米育种可为培育抗倒伏玉米。所述玉米育种具体可为培育株高降低玉米、培育雌穗穗位高降低玉米、培育去雄株高降低玉米和/或培育雌穗相对穗位高降低玉米。

所述玉米或所述待测玉米可为B1)、B2)或B3):

B1)玉米自交系52220或其作为亲本的后代;

B2)玉米自交系Mo18W或其作为亲本的后代;

B3)玉米自交系52220与玉米自交系Mo18W的杂交后代。

所述332bp和100bp的DNA片段可通过电泳和/或测序检测。在利用电泳进行检测时,所述332bp的DNA片段具体可体现为在250bp与500bp间有一条带,所述100bp的DNA片段具体可体现为在100bp处有一条带。

实验证明,利用本发明的抗倒伏分子标记可以鉴定玉米的抗倒伏性状:与两条染色体都含有序列1的第6377-6617位的BB基因型(即两条染色体均含有Br2基因)相比,两条染色体都不含有序列1的第6377-6617位的bb基因型(即两条染色体均含有subr2基因)玉米的株高、雌穗穗位高、去雄穗株高以及相对穗位高均显著降低(P<0.01);BB基因型与bb基因型玉米的雄穗长、雌穗穗上叶片数、雌穗穗上叶长、叶夹角和茎干直径基本差异不显著,并且BB基因型与bb基因型玉米在苞叶数目、雌穗长、穗行数、行粒数、雌穗轴直径上均无显著差异。影响玉米植株倒伏的主要内因有:株高、雌穗穗位高和茎秆直径。而缺失了序列1的第6377-6617位所示的DNA片段的bb基因型玉米能够在降低株高和穗位高的同时保持茎干直径不变且对影响产量的穗部性状没有明显的负面效应,这使得其能够像水稻和小麦中的绿色革命基因一样,具有抗倒伏以及稳产的功效。

附图说明

图1为不同株系的BB基因型和bb基因型玉米的株高、雌穗穗位高、雄穗长、相对穗位高、去雄穗株高、雌穗穗上叶片数、雌穗穗上叶长、叶夹角和茎干直径的差异分析结果。**表示差异达到极显著水平(P<0.01),*表示差异达到显著水平(P<0.05)。

图2为两个亲本玉米自交系52220与玉米自交系Mo18W的鉴定结果。其中,M为分子量标准,泳道1和2均为玉米自交系Mo18W,泳道3和4均为玉米自交系52220。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。

下述实施例中的玉米自交系Mo18W和玉米自交系52220均来自于美国种质资源库(U.S.National Plant Germplasm System,网址为:https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/search.aspx),玉米自交系Mo18W的编号为PI>

实施例1、抗倒伏分子标记可以用来鉴定玉米的抗倒伏性状

本发明提供了一种抗倒伏分子标记,将其命名为ZaRl,ZaRl为以玉米的基因组DNA为模板、采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子;A1由名称为P1和P2的单链DNA组成,P1为序列1的第6336-6355位所示的单链DNA,P2为与序列1的第6648-6667位所示单链DNA反向互补的单链DNA。

利用引物对A1对不同玉米品系的基因组DNA进行PCR扩增,PCR产物共有两种,一种含有a1,另一种不含a1,a1为序列1的第6377-6617位所示的DNA片段。根据PCR产物,将玉米分为不同的基因型:PCR产物为一条含有a1的玉米的基因型为BB基因型;PCR产物为一条含有a1且一条不含有a1的玉米的基因型为Bb基因型;PCR产物为一条不含有a1的玉米的基因型为bb基因型。

利用玉米自交系52220与玉米自交系Mo18W杂交组配F2群体,F2群体自交得到F3群体,F3群体自交得到F4群体。

利用引物对A1对F4群体的基因型进行鉴定,选出4个Bb基因型的类NIL系的材料,具体鉴定方法如下:

提取玉米基因组DNA,利用引物对A1对玉米基因组DNA进行PCR扩增,反应体系如表1。

表1、PCR反应体系

组分体积(μl)2×GC Buffer I(TaKaRa产品)5dNTP Mixture(TaKaRa产品)2P1(10pmol/μL)0.2P2(10pmol/μL)0.2ddH2O2TaKaRa LA Taq(5U/μl)(TaKaRa产品)0.1DNA0.5总体积10

反应条件如表2。

表2、PCR反应条件

对得到的PCR产物进行电泳,其中两个亲本(玉米自交系52220与玉米自交系Mo18W)的电泳结果见表2。选择PCR产物为两个大小相差约232bp的条带进行回收,测序,最终选择4个类NIL系的材料(这4个类NIL系的材料的编号分别为105、114、162和17),这4个类NIL系的材料的基因型均为Bb基因型,其PCR产物均含有两条带,这两条带中的一条带对应的DNA片段的序列为序列1的第6336-6667位,另一条带对应的DNA片段的序列为序列2的第6328-6427位。

将这4个类NIL系的材料的种子在田间播种(播种地点为北京,播种时间为5月上旬),每个材料一个小区。按照上述方法利用引物对A1对这4个类NIL系的材料的子代的基因型进行鉴定,每个材料均有三种基因型,即BB基因型、Bb基因型和bb基因型,其中,BB基因型的PCR产物含有序列1的第6336-6667位所示的DNA片段、不含有序列2的第6328-6427位所示的DNA片段,Bb基因型的PCR产物含有序列1的第6336-6667位所示的DNA片段和序列2的第6328-6427位所示的DNA片段,bb基因型的PCR产物不含有序列1的第6336-6667位所示的DNA片段、含有序列2的第6328-6427位所示的DNA片段。

在玉米成熟时统计每个小区中BB基因型、Bb基因型和bb基因型的株高、雌穗穗位高、去雄穗株高、相对穗位高(相对穗位高=雌穗穗位高/株高)、雌穗穗上叶片数、雄穗长、雌穗穗上叶长、叶夹角(上位穗之上第一叶的叶夹角)、茎干直径(主茎茎秆地上部第三节间,中部短径(不包括叶鞘)的直径)以及雌穗的穗柄长、苞叶数目、雌穗长、穗行数、行粒数和雌穗轴直径。

不同株系的BB基因型和bb基因型玉米的株高、雌穗穗位高、雄穗长、相对穗位高、去雄穗株高、雌穗穗上叶片数、雌穗穗上叶长、叶夹角和茎干直径如表1所示,分析同一株系不同基因型间的差异(图1)。

表3、不同株系的BB基因型和bb基因型的表型

结果发现,在这4个编号分别为105、114、162和17材料中,与BB基因型,bb基因型玉米的株高、雌穗穗位高、去雄穗株高以及相对穗位高均显著降低(P<0.01),而BB基因型与Bb基因型的株高、雌穗穗位高、去雄穗株高以及相对穗位高均无显著差异。表明,本发明的抗倒伏分子标记与玉米的抗倒伏性状相关。除114的雄穗长、17与162的雌穗穗上叶长以及105的茎干直径外,BB基因型与bb基因型玉米的雄穗长、雌穗穗上叶片数、雌穗穗上叶长、叶夹角和茎干直径差异不显著(表3),BB基因型与Bb基因型的雄穗长、雌穗穗上叶片数、雌穗穗上叶长、叶夹角和茎干直径差异也不显著。而进一步对雌穗穗部性状的比较发现,除了穗柄长以外,BB基因型与bb基因型玉米在苞叶数目、雌穗长、穗行数、行粒数、雌穗轴直径上均无显著差异(表3),而BB基因型与Bb基因型的苞叶数目、雌穗长、穗行数、行粒数、雌穗轴直径上也均无显著差异。

影响玉米植株倒伏的主要内因有:株高、雌穗穗位高和茎干直径。而缺失了序列1的第6377-6617位所示的DNA片段的家系植株能够在降低株高和穗位高的同时保持茎干直径不变且对影响产量的穗部性状没有明显的负面效应,这使得其能够像水稻和小麦中的绿色革命基因一样,具有抗倒伏以及稳产的功效。发明人将这缺失了序列1的第6377-6617位所示的DNA片段的具有完整基因结构的等位基因命名为subr2基因。

为了证实subr2基因对于株高以及产量相关性状的影响,发明人利用极端矮杆的玉米自交系52220与骨干玉米自交系Mo18W杂交组配了F2群体。并从群体中选择了215株个体进行GBS测序,构建了平均密度达1SNP/100kb的高密度连锁图。经检测,株高性状在F2群体中呈正态分布并且在1号染色体80cM至110cM上存在一个主效QTL,可解释26%的表型变异。为了进一步精细定位,发明人在该区段内设计SSR标记将该QTL初步定位在标记P1和P7之间,筛选交换,并在来源于12个F3交换单株的2319株后代F3:4中继续加密标记进行筛选。通过线性回归模型对F4群体家系的基因型和表型相关性进行标记检测。最终将目标区段缩小至一号染色体200.8Mb至208.3Mb的范围内。通过对该区段内182个已注释的基因进行功能分析,并比对与该片段同源的高粱、水稻染色体片段上的基因,最终确定Br2为候选基因。经过测序比对,Mo18W上的Br2基因由5个外显子4个内含子组成,全长6657bp。其中4140bp的编码序列(CDS)最终编码生成含1379个氨基酸的蛋白。通过Interpro数据库的查看结构域,该蛋白含有两个ABC转运蛋白1型跨膜结构(118aa~441aa和785aa~1,105aa)以及两个P环核苷水解酶结构阈(463aa~699aa和1,121aa~1,357aa)。而在矮杆亲本52220中,br2基因(subr2基因)在第五外显子6377bp至6617bp位置缺失了241bp的序列从而导致第二个P环核苷酸水解酶结构域在翻译时失活。可利用subr2基因培育抗倒伏玉米。Br2基因与subr2基因为等位基因。

<110> 中国农业大学

<120> 抗倒伏分子标记及其多态性在鉴定玉米抗倒伏性状中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7017

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 1

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<210> 2

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<212> DNA

<213> 玉米

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aatggatgga tggatgggtt tggttcctcg agagattgat gggtgaggaa gctgaagctc 6480

cggatcaaat ggtggtactc catgatcgca acaatgaggg gaaaaaaaga aaggagaaaa 6540

tacggtggtt catatgattg tacaatttga cgatctgttt gagtcggggt tttaggatga 6600

tgtaaacctt cactcgcctt ttttttactc ttgtttctca tccgcatcag tatcatctat 6660

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cagattgtat taatgtactt agttagcctg ttttatatat acttataagt accaaat 6777

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